1、ICS650.020.40 B21DB2302黑 龍 江 省 齊 齊 哈 爾 市 地 方 標 準DB 2302/T 0122021馬鈴薯試管苗繼代培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程2021 - 12 - 26 發(fā)布2022 - 01 - 26 實施齊齊哈爾市市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB2302/T 0122021目次前言III引言IV1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義13.1 試管苗13.2 脫毒試管苗13.3 繼代13.4 繼代培養(yǎng)14 材料選擇14.1 癥狀學(xué)觀察24.1.1 繁殖材料24.1.2 癥狀學(xué)觀察24.2 類病毒與病毒病檢測24.2.1 RT-PCR 法檢測24.2.2 DAS-ELISA 法

2、檢測34.3 材料選擇35 培養(yǎng)基制備35.1 器材與試劑35.2 操作程序35.2.1 洗滌35.2.2 MS 培養(yǎng)基藥品母液配制和保存35.2.3 MS 培養(yǎng)基制備35.2.4 培養(yǎng)基的分裝和滅菌46 莖段剪切46.1 器材與試劑46.2 操作程序46.2.1 無菌操作室內(nèi)消毒殺菌46.2.1.1 操作前消毒殺菌46.2.1.2 操作中消毒46.2.2 莖段剪切47 組織培養(yǎng)57.1 器材57.2 組培條件5I學(xué)兔兔 標準下載8 檔案管理5附錄 A（規(guī)范性附錄） MS 培養(yǎng)基配方6II前言本文件按照GB-T1.1-2020 標準化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草

3、。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由齊齊哈爾市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局歸口。本文件起草單位：黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院。本文件主要起草人：宋繼玲、楊夢平、婁樹寶、祝海娟、辛丹丹、劉喜才、孫邦升、劉春生、孫旭紅、王 聰、王立春、孔德崴。III引言由于具有繁殖速度快，生長整齊一致，高產(chǎn)高效、優(yōu)質(zhì)、性狀穩(wěn)定和便于運輸?shù)葍?yōu)點，馬鈴薯主要生產(chǎn)國都采用馬鈴薯試管苗繼代培養(yǎng)技術(shù)。黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院自 1978 年借鑒國外先進經(jīng)驗，將馬鈴薯莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯種質(zhì)資源保存，從 40 多年的試管苗繼代培養(yǎng)工作中不斷總結(jié)經(jīng)驗，改進技術(shù)，建立了一套便捷、快速、安全、

4、污染率極低的繼代培養(yǎng)技術(shù)，總結(jié)出一套馬鈴薯試管苗繼代培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程。IV馬鈴薯試管苗繼代培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程1 范圍本文件規(guī)定了馬鈴薯試管苗繼代培養(yǎng)的術(shù)語和定義、材料選擇、培養(yǎng)基制備、莖段剪切、組培培養(yǎng)技術(shù)要求。本文件適用于齊齊哈爾地域內(nèi)馬鈴薯試管苗繼代培養(yǎng)的安全生產(chǎn)與保存。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29378-2012 馬鈴薯脫毒種薯生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T 401-2000 脫毒馬鈴薯種薯（苗）檢測技術(shù)規(guī)程方法NY/T1606-2008 馬鈴薯種薯

5、生產(chǎn)技術(shù)操作規(guī)程NY/T 1962-2010 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測技術(shù)規(guī)程方法3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1 試管苗在組織培養(yǎng)中成苗前的過渡階段，在試管中培育后逐漸轉(zhuǎn)移移栽或運輸。3.2 脫毒試管苗經(jīng)檢測確認不帶馬鈴薯 X 病毒(PVX)、馬鈴薯 Y 病毒(PVY)、馬鈴薯 S 病毒(PVS)、 馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)、馬鈴薯 A 病毒（PVA）、馬鈴薯 M 病毒（PVM）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）的試管苗。3.3 繼代愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程叫做繼代。3.4 繼代培養(yǎng)繼

6、代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁培養(yǎng)過程。14 材料選擇采用田間癥狀學(xué)觀察與DAS-ELISA法檢測、RT-PCR法檢測相結(jié)合的方法。4.1 癥狀學(xué)觀察4.1.1 繁殖材料每份待觀察馬鈴薯試管苗均擴繁 10 株，并編號。5 月上旬于溫室內(nèi)假植，6 月上旬定植于防蟲網(wǎng)棚。每份馬鈴薯試管苗種植 1 行，行距 60cm，株距 30cm。每隔 5 行馬鈴薯試管苗種植 1 行當?shù)刂髟云贩N的脫毒種薯為對照。田間管理同當?shù)鼐W(wǎng)棚管理相同。4.1.2 癥狀學(xué)觀察生育期間觀察每份馬鈴薯試管苗生長發(fā)育狀況。當馬鈴薯被病毒和類病毒致病因子侵染后，在馬鈴薯的葉片、整體植株、塊莖上可觀察到特有的癥狀（見表 1）。種

7、植的試管苗出現(xiàn)表 1 中的任一癥狀，為非生理性原因表現(xiàn)的異常，將該份試管苗淘汰。未出現(xiàn)由病毒病和類病毒致病因子引起的癥狀試管苗進行類病毒與病毒病檢測。表 1 馬鈴薯由病毒病和類病毒致病因子引起的癥狀癥狀表現(xiàn)部位癥狀類型癥狀描述葉片顏色異常1、明脈(葉脈顏色比正常的淺)；2、花葉或斑駁；3、黃化；4、異常著色。形狀、大小或結(jié)構(gòu)的異常1、小葉（葉片與健康植株比，明顯變?。?、卷葉；3、皺縮，4、革質(zhì)葉片。葉片壞死1、頂端壞死（主莖和分支頂部先壞死）；2、系統(tǒng)壞死（有壞死的條斑、斑點或環(huán)斑分布于全部或部分葉片上），3、葉脈壞死植株植株整體異常1、矮縮（比健康的植株小，且葉或莖出現(xiàn)某些畸形）；2、矮

8、化(植株株型變小，不表現(xiàn)畸形)；3、衰弱（植株莖稈十分細弱，匍匐于地面）；4、簇生（葉片小而嚴重皺縮，并沿著莖緊密地生長在一起）；5、叢枝（主莖上的腋枝增生）塊莖塊莖畸形1、紡錘形塊莖；2、過長（塊莖比健康植株的塊莖明顯變長）；3、氣生薯；4、過度生長（塊莖芽眼脹大或在大塊莖上長出小塊莖）；5、開裂。塊莖壞死1、壞死斑（塊莖表面形成大小各異，深而干燥圓型病斑），2、網(wǎng)狀壞死（在塊莖內(nèi)部形成網(wǎng)狀壞死線）；3、內(nèi)部壞死（在塊莖內(nèi)部形成環(huán)狀或不規(guī)則形狀壞死點或斑）。4.2 類病毒與病毒病檢測24.2.1 RT-PCR 法檢測首先檢測馬鈴薯試管苗類病毒（PSTVd），檢測按 NY/T 1962-201

9、0 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒檢測技術(shù)規(guī)程方法執(zhí)行。檢測結(jié)果為陽性試管苗淘汰，檢測結(jié)果為陰性試管苗進行病毒病檢測。4.2.2 DAS-ELISA 法檢測馬鈴薯 X 病毒 （PVX）、馬鈴薯 Y 病毒（PVY）、馬鈴薯 S 病毒（PVS）、馬鈴薯 M 病毒（PVM）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯 A 病毒（PVA）檢測按 NY/T 401-2000 脫毒馬鈴薯種薯（苗）檢測技術(shù)規(guī)程方法執(zhí)行。檢測結(jié)果任一病毒病呈陽性試管苗淘汰，檢測結(jié)果全陰性試管苗留存。4.3 材料選擇選擇田間無病毒和類病毒致病因子引起的癥狀、類病毒與病毒病檢測全陰性試管苗，肉眼觀察試管內(nèi)植株與根系健康、無污染，植株為 5cm 以

10、上試管苗作為核心基礎(chǔ)苗。5 培養(yǎng)基制備5.1 器材與試劑高壓蒸氣滅菌鍋、蒸餾水器、鍋、試管、燒杯、量筒、酸度計、電爐子、天平、pH 試紙、瓊脂或卡拉膠、硝酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、乙二胺四乙酸二鈉、碘化鉀、鉬酸鈉、氯化鈷、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硼酸、維生素 B1、維生素 B6、甘氨酸、菸酸、肌醇、蔗糖或白砂糖。5.2 操作程序5.2.1 洗滌繼代培養(yǎng)使用的各種用具、器皿必須清洗干凈后才能使用。新購置的玻璃器皿使用前，用肥皂水洗凈，清水沖洗 3 遍，干后備用。已用過的玻璃器皿，先將器皿中的殘渣除去，用熱的肥皂水浸泡 1h 后洗凈，清水沖洗 3 遍，達到瓶壁水珠分布非常

11、均勻，透明感強，干后備用。5.2.2 MS 培養(yǎng)基藥品母液配制和保存一般配制成比所需濃度高 10100 倍的母液，用時按比例稀釋。母液的配制有兩種方法，一種方法是將母液配制成單一化合物母液，另一種方法是配制成混合溶液。在配制大量元素無機鹽母液時，要防止在混合各種鹽類時產(chǎn)生沉淀，為此各種藥品必須在分別充分溶解后再按附表 A 藥品順序混合。另外， 在混合各種無機鹽時，其稀釋度要大，慢慢地混合，同時邊混合邊攪拌。鐵鹽必須單獨配制，因為與其他母液混合容易產(chǎn)生沉淀。配制母液成分見附表 A。配制好的母液分別貼上標簽，注明母液號、日期及配制 1L 培養(yǎng)基所取量。室溫儲存即可，冰箱 4儲存最佳，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和

12、沉淀產(chǎn)生，停止使用。5.2.3 MS 培養(yǎng)基制備3首先將儲存的藥品母液按順序排好，再將各種玻璃器皿、量筒、燒杯等放在指定的位置備用。稱量所需的瓊脂或卡拉膠、蔗糖或白砂糖。準備好試管塞或組培瓶蓋等。(1)按母液順序,根據(jù)母液的不同倍數(shù)量取規(guī)定的量。(2)用量杯量出配制培養(yǎng)基所需蒸餾水的 4/5，將稱好的瓊脂或卡拉膠倒人鍋內(nèi)加熱， 邊加熱邊攪動，使瓊脂或卡拉膠充分溶解，繼續(xù)加熱到沸騰后加入稱量好的藥品母液和蔗糖或白砂糖， 加入量見附錄 A，最后用蒸餾水定容至所需體積。(3)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 值，用酸度計檢驗 pH 值小于 5.8 時，用滴管滴加 5%NaOH，pH 值大于 5.8 時滴加 1mol

13、/L 鹽酸溶液，將 pH 值調(diào)至 5.8 為宜，培養(yǎng)基配制完畢。5.2.4 培養(yǎng)基的分裝和滅菌配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝。分裝時注意不要將培養(yǎng)基沾到容器壁上, 以免引起污染。試管分裝 8ml 15ml/管后蓋試管塞，組培瓶分裝 30ml50ml/瓶，然后用組培瓶蓋等封口，放入高壓滅菌鍋 120滅菌15min。滅菌后取出冷卻待用。6 莖段剪切6.1 器材與試劑超凈工作臺、紫外燈、酒精燈、剪刀、組培鉤或長鑷子、90%酒精、酒精蘸缸、75%酒精脫脂棉、火柴、苯扎溴銨。6.2 操作程序6.2.1 無菌操作室內(nèi)消毒殺菌6.2.1.1 操作前消毒殺菌6.2.1.1.1 熏蒸無菌室間隔 2 個月以上未使用的無菌

14、操作室進行熏蒸消毒，熏蒸消毒使用二氧化氯空間消毒劑。6.2.1.1.2 紫外線消毒殺菌將工作服、口罩、工作鞋、酒精蘸缸、剪刀、酒精燈、組培鉤或長鑷子、火柴、基礎(chǔ)苗等無菌室所需物品放在無菌室固定位置，啟動超凈工作臺，開啟殺菌，并將室內(nèi)紫外線燈打開消毒，工作人員快速離開無菌室。紫外線殺菌 30min 后關(guān)閉紫外線燈開啟通風，15min 后工作人員方可進入。6.2.1.2 操作中消毒工作人員洗手后按無菌操作程序進人無菌室，穿戴好消毒服裝，就座于無菌操作臺前，拉開無菌操作臺玻璃門使門下邊緣距操作臺面25cm30cm，用75%酒精棉將雙手消毒，再用75%酒精棉擦拭剪刀、組培鉤或長鑷子及超凈工作臺面，用火

15、柴點燃酒精燈，將剪刀、組培鉤或長鑷子在酒精蘸缸中蘸取90% 酒精燃燒消毒，然后進行切段工作，每次使用工具放置到臺面前都應(yīng)蘸取90%酒精燃燒消毒。6.2.2 莖段剪切4在點燃的酒精燈附近取掉試管塞或組培瓶蓋，使試管或組培瓶口稍傾斜距酒精燈燈芯 0.5cm 處，用手輕輕轉(zhuǎn)動試管或組培瓶，將試管或組培瓶口邊緣消毒，然后放在超凈工作臺的酒精燈附近，再取掉基礎(chǔ)苗的試管塞或組培瓶蓋，用同樣的方法在酒精燈上進行消毒，注意防止燒傷試管苗。拿起消過毒的組培鉤或長鑷子將基礎(chǔ)苗取出 2/3，手握試管或組培瓶根部上揚使試管苗頂部懸于培養(yǎng)基容器上方，基礎(chǔ)苗試管口或組培瓶口與新培養(yǎng)基容器口呈 45°角為宜。用剪

16、刀將基礎(chǔ)苗剪成若干段帶一片小葉的“上短下長”莖段，用組培鉤或長鑷子將“下長”端插入培養(yǎng)基內(nèi)，一般每管可插 15 個莖段，每瓶可插1060 個莖段。將新繼代的試管或組培瓶口稍傾斜至酒精燈燈芯 0.5cm 處用手輕輕轉(zhuǎn)動試管或組培瓶， 將試管或瓶口邊緣消毒，試管塞或組培瓶蓋在酒精燈上消毒后封口，然后在試管或組培瓶外壁上注明名稱、繼代日期及操作者。7 組織培養(yǎng)7.1 器材培養(yǎng)室、培養(yǎng)架、組培燈、空調(diào)、臭氧機。7.2 組培條件把繼代的試管苗送到培養(yǎng)室，置于組培架上培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度 1822，每天光照 16h，光照強度 2000lx3 000lx，相對濕度 45<RH<65%。繼代 3d4d

17、 后開始每日巡視試管苗，如果發(fā)現(xiàn)有污染的試管苗，立刻將其移出培養(yǎng)室。健康的試管苗 25d30d 可再繼代或作為扦插用苗，如做保存試管苗可培養(yǎng) 34 個月再用于繼代培養(yǎng)的基礎(chǔ)苗。組培室每 3d4d 使用臭氧機消毒 2h。8 檔案管理建立馬鈴薯試管苗繼代培養(yǎng)技術(shù)檔案，內(nèi)容包括：癥狀學(xué)觀察數(shù)據(jù)；RT-PCR法檢測和DAS-ELISA 法檢測結(jié)果；培養(yǎng)基制備、莖段剪切和組織培養(yǎng)的日期、數(shù)量、操作人員、污染率等，檔案至少保存2 年以上。5附錄A（規(guī)范性附錄） MS 培養(yǎng)基配方母液序號成份使用濃度(mg/L)擴大倍數(shù)擴大后重量硝酸銨NH4NO316502033g加蒸餾水溶解后定容至硝酸鉀KNO319002038g1000ml，配制 1L 培養(yǎng)基取1磷酸二氫鉀KH2PO4170203.4g母液 50ml硫酸鎂MgSO4.7H2O370207.4g氯化鈣CaCl2.2H2O440206.6g硫酸亞鐵FeSO2.7H2O27.82005.57g加蒸餾水溶解后定容至2乙二胺四乙酸二鈉37.32007.45g1000ml，配制 1L 培養(yǎng)基取Na2.EDTA母液 5ml碘化鉀KI0.8310083mg加蒸餾水溶解后定容至鉬酸鈉Na2MoO4.2H2O0.2510025mg200ml，配制 1L 培養(yǎng)基取硫酸銅CuSO4.5