1、第一章 核酸的分離純化技術(shù)實驗一 細(xì)菌DNA的分離提取一、原理和用途用EDTA絡(luò)合二價離子，SDS結(jié)合膜蛋白，溶菌酶破壞膜結(jié)構(gòu)，使DNA溢出到膜外，經(jīng)氯仿異戊醇沉淀蛋白，可獲得較純的DNA。用于克隆細(xì)菌染色體上的目的基因、細(xì)菌污染檢測，繪制基因圖譜等。二、實驗材料大腸桿菌或沙門氏菌等。三、溶液與緩沖液1 LB液體培養(yǎng)基：精解蛋白胨 3.0 g酵母浸出粉 1.5 g氯化鈉 3.0 g葡萄糖 0.6 g按上述配方用餾蒸水溶解至300 mL。用10 mol/L NaOH調(diào)pH至7.27.4。分裝150 mL三角燒瓶中，每瓶30 mL。然后置高壓蒸汽消毒鍋，以1.1 kg/cm2 滅菌20 min。2

2、 SE溶液：0.15 mol/L NaCl0.1 mol/L EDTA（pH 8.0）。3 20% SDS4 溶菌酶5 5 mol/L過氯酸鈉6 氯仿/異戊(24:1)醇7 20倍SSC溶液：0.3 mol/L 檸檬酸鈉3 mol/L NaCl8 10 mg/mL RNA酶：稱取10 mg核糖核酸酶A于滅菌的Ep管內(nèi)，加1 mL 100 mmol/L pH 5.0的NaAc溶液，即為10 mg/mL RNA酶A，為了破壞脫氧核糖核酸酶，置80水浴中10 min或100水浴2 min，然后存-20。C保存。四、儀器設(shè)備及耗材超凈工作臺；電熱恒溫培養(yǎng)箱；臺式高速冷凍離心機(jī)；高速離心機(jī)；穩(wěn)壓電泳儀；

3、紫外檢測儀；水平式電泳槽；水浴鍋；水平儀；攝影設(shè)備；高壓蒸汽消毒鍋；20 mL、200 mL、1000 mL微量移液器。玻璃棒，500 mL三角燒瓶，100 mL、250 mL燒杯，50 mL、10 mL量筒，50 mL塑料離心管，1.5 mL Ep管，20200 mL、1000 mL吸頭。五、實驗方法將200 mL LB液體培養(yǎng)基中生長的菌液4000 r/min離心10 min，收集菌體。用SE溶液洗滌菌體，重懸于20 mL SE溶液中。加入2.0 mL 20% SDS、10 mg溶菌酶，混勻，37保溫，不時振蕩，菌體溶解（約3060 min）后，置60水浴中10 min。加入5 mol/L

4、 過氯酸鈉至終濃度為1 mol/L，再加入1倍體積的氯仿/異戊醇，緩振20 min，12000 r/min離心5 min。5轉(zhuǎn)移水相到另一離心管中，加入2倍體積100%的乙醇，混勻，用玻棒輕輕纏出DNA細(xì)絲，加70% 冷乙醇300 mL清洗。6將玻璃棒置離心管中，用0.1SSC沖洗，使DNA溶解，然后用20SSC溶液調(diào)整濃度為1SSC。7加入2倍體積100% 冷乙醇，室溫混勻-20放置30 min。84 12000 r/min離心5 min，小心除去上清，除盡壁液。9加70% 冷乙醇300 mL，清洗沉淀。4 12000 r/min 離心5 min，去上清。10加28 mL TE，2 mL R

5、NA酶。11制取0.7% 的瓊脂糖凝膠板（含0.5 mg/mL溴化乙錠），插好點樣梳。12凝膠冷卻，加緩沖液使平板微淹沒，抽出點樣梳。13加1 mL溴酚藍(lán)，點樣10 mL，接通電源，電壓50 V/cm，約12 h，將點樣膠在紫外燈下觀察DNA譜帶。注意：1方法5加入2倍體積100% 的乙醇后，可以接方法8，結(jié)果純度稍差。2DNA譜帶在點樣孔0.5 cm左右。3可以在方法1后，菌體重懸于10 mL SE溶液中，每人取1 mL菌液，以后按1/10量操作。六作業(yè)與思考題1用玻棒輕輕纏出的DNA細(xì)絲是什么樣的？2為什么加70% 冷乙醇300 mL清洗？ 實驗二 質(zhì)粒DNA的分離提取方法一 堿變性法提取

6、質(zhì)粒DNA 一、原理和用途堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但是共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離，當(dāng)以pH 4.8的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH到中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)象，保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成單鏈的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。堿變性提取質(zhì)粒的DNA可以用于酶切、連接、重組鑒定、PCR擴(kuò)增和建基因文庫等。二、實驗材料大腸桿菌JM

7、109(或DH5a)含有pUC18(或pGEM )三、溶液與緩沖液1 LB液體培養(yǎng)基：精解蛋白胨 3.0 g酵母浸出粉 1.5 g氯化鈉 3.0 g葡萄糖 0.6 g按上述配方用餾蒸水溶解至300 mL。用10 mol/L NaOH調(diào)pH至7.27.4 。分裝150 mL三角燒瓶中,每瓶30 mL。每組一瓶，然后置高壓蒸汽消毒鍋, 1.1 kg/cm2 滅菌20 min。2抗菌素：(1) 氨芐青霉素（Amp）：用無菌水配制在滅菌有蓋試管中，母液濃度為100 mg/mL。(2) 氯霉素（Cm）：配制在無菌有蓋試管中，先用少量乙醇助溶，再加無菌水至母液濃度為150 mg/mL。3溶液（I）：50

8、mmol/L 葡萄糖10 mmol/L EDTA25 mmol/L TrisHCl，pH 8.02 mg/ml 溶菌酶配制方法：吸取母液 200 mmol/L葡萄糖 25 mL250 mmol/L EDTA 4 mL1 mol/L TrisHCl，pH 8.0 2.5 mL加 ddH2O 至100 mL臨用時再加200 mg溶菌酶4溶液（II）：200 mmol/L NaOH 1% SDS配制方法：吸取母液10 mol/L NaOH 4 mL20% SDS 10 mL加 ddH2O 至200 mL5溶液（III）：3 mol/L NaAc（pH 4.8）溶液：稱取無水乙酸鈉52.2 g，先加1

9、40 mL重蒸水，加熱使溶解，再加冰乙酸約40 mL調(diào)至pH 4.8，加重蒸水定容至200 mL。650 mmol/L TrisHCl，pH 8.0，100 mmol/L NaAc溶液。配制方法：吸取母液1 mol/L TrisHCl，pH 8.0 6 mL3 mol/L NaAc 4 mL加ddH2O 至120 mL1.1 kg/cm2滅菌20 min725 mmol/L TrisHCl（pH 7.5），30 mmol/L EDTA緩沖液：配制方法：吸取母液1 mol/L TrisHCl，pH 7.5 5 mL250 mmol/L EDTA 24 mL加ddH2O 至200 mL1.1 kg

10、/cm2滅菌20 min810 mg/mL RNA酶：稱取10 mg核糖核酸酶A，于滅菌的EP管內(nèi)，加1 mL 100 mmol/L pH 5.0的NaAc溶液，即為10 mg/mL RNA酶，為了破壞脫氧核糖核酸酶，置80水浴中10 min或100水浴2 min，然后存-20保存。920% SDS溶液105 mol/L NaAc溶液：稱取乙酸鉀或NaAc 24.5 g，加40 mL重蒸水，加熱溶解，再加重蒸水置50 mL，1.1 kg/cm2滅菌20 min。11TE緩沖液：10 mmol/L TrisHCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA12TrisHCl（pH 8.0）溶液的飽

11、和酚13氯仿/異戊醇（24:1）：量取240 mL氯仿，加入10 mL異戊醇，充分混勻。145 mol/L NaCl15預(yù)冷70% 乙醇和無水乙醇，保存在4冰箱中備用。16電泳緩沖液：40 mmol/L TrisHCl，pH 8.020 mmol/L NaAc 2 mmol/L EDTA 配制方法：吸取母液100倍的電泳緩沖液5 mL加ddH2O至500 mL17溴酚藍(lán)指示劑溶液：0.2% 溴酚鹽，50% 蔗糖。181 mg/mL的溴化乙錠溶液19瓊脂糖四、儀器設(shè)備及耗材超凈工作臺，電熱恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩器，可見光分光光度計，高速冷凍離心機(jī)(30K)，TGL-16 離心機(jī)，旋渦混合器，電熱恒

12、溫水浴鍋，普通冰箱，低溫冰箱(-40)，真空泵，穩(wěn)壓電泳儀 (500 V，300 mA)；紫外檢測儀(254 nm )，微型水平電泳槽，20 mL、200 mL、1000 mL微量移液器。150 mL三角燒瓶，100 mL、250 mL燒杯，50 mL量筒，1.5 mLP管，10 mL試管，120 mL、20200 mL、1000 mL吸頭。五、實驗方法1取含質(zhì)粒的單一菌落一環(huán)，接在2 mL LB液體培養(yǎng)基（加入2 mL Amp）中，于10 mL試管中，37振蕩過夜。2取200 mL母液，加入到30 mL含30 mL Amp的LB液體培養(yǎng)基，37C振蕩培養(yǎng)，16 h后加入30 mL 150 U

13、/mL氯霉素（Cm），37C振蕩過夜。3取1.5 mL培養(yǎng)物吸入EP管，4，12000 r/min離心30 s，去上清。4再向管內(nèi)加入1.5 mL培養(yǎng)物，重復(fù)步驟3。5取沉淀，重懸于100 mL預(yù)冷的溶液I，完全分散。6加入新配的溶液II 200 mL，立即反復(fù)倒置5次。7加入冰冷的溶液III 150 mL，倒置混勻。84，12000 r/min 5 min離心，取上清，計算體積，不計算沉淀。9加入等體積的酚和氯仿/異戊醇（24:1），4，12000 r/min 2 min，取上清加入另一只EP管。10加入2倍體積100% 冷乙醇，室溫混勻-20放置30 min。114，12000 r/min

14、離心5 min，小心除去上清，除盡壁液。12 加70% 冷乙醇300 mL，清洗沉淀。4，12000 r/min離心5 min。13取沉淀，充分干燥，除盡壁液。14加19 mL TE，1 mL RNA酶。冰箱保存?zhèn)溆?。如要進(jìn)行檢測可繼續(xù)做方法1517。15制取1%的瓊脂糖凝膠板（含0.5 mg/mL溴化乙錠），插好點樣梳。16凝膠冷卻，加緩沖液使微沒平板，抽出點樣梳。17加1 mL溴酚藍(lán)，點樣10 ml ，接通電源，電壓50 V/cm，約12 h，將點樣膠在紫外燈下觀察DNA譜帶。注意：1抗菌素必須保存在-20冰箱中，青霉素一次性使用。2溶液II現(xiàn)用現(xiàn)配。3管壁殘液必須除盡。4注意防止紫外光燒

15、傷眼睛。5注意不要沾染上EB，它有致癌性。六、作業(yè)與思考題1加上溶液II后出現(xiàn)什么現(xiàn)象，為什么？2提取的質(zhì)粒DNA溶液中還可能有什么物質(zhì)？方法二 煮沸法提取質(zhì)粒DNA一、原理和用途細(xì)菌懸浮于含有Triton X-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶的緩沖液中，加熱到100使其裂解。加熱除了破壞細(xì)菌外壁，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA雙鏈彼此不會徹底分離，因為它們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又相互配對復(fù)位，形成超螺旋分子。離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì)，就可從上清液中回收質(zhì)粒DNA。煮沸裂解提取細(xì)菌質(zhì)粒DNA

16、與堿變性法提取質(zhì)粒DNA質(zhì)量基本相同，均可用于酶切、連接、重組鑒定、PCR擴(kuò)增和建基因文庫等。二、實驗材料 大腸桿菌JM109(或DH5a)含有pUC18(或pBR322)。三、溶液與緩沖液 1主要溶液同堿裂解法2 STET溶液：8 % 蔗糖10 mmol/L TrisHCl，pH 8.050 mmol/L EDTA0.5 % Triton X1003溶菌酶溶液4異丙醇 55 mol/L乙酸鈉，pH 5.2670% 乙醇7RNA酶（20 mg/mL）8TE緩沖液，pH 8.0四、儀器設(shè)備及耗材恒溫培養(yǎng)箱，恒溫振蕩器，TGL-16離心機(jī)，旋渦混合器，普通冰箱，低溫冰箱(-20)，真空泵，沸水浴，

17、穩(wěn)壓電泳儀(500 V，300 mA)，紫外檢測儀(254 nm)，微型水平電泳槽，20 mL、200 mL、1000 mL微量移液器，50 mL三角燒瓶，100 mL燒杯，50 mL量筒，1.5 mLP管，120 mL、20200 mL、1000 mL吸頭，牙簽。五、實驗方法1同堿法步驟14。2將細(xì)菌沉淀重懸于350 mL STET溶液中。加25 mL新配制的溶菌酶溶液，振蕩3 s鐘，混勻。3將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40 s。4室溫12000 g離心10 min。5用無菌牙簽從離心管中去除細(xì)菌碎片。6在上清中加入40 mL 5 mol/L乙酸鈉（pH 5.2）和420 mL異丙醇，

18、振蕩混勻，室溫下放置5 min。7于412000 g離心5 min，回收核酸沉淀。8小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡；9加0.5 mL 70% 乙醇，于4以12 000 g離心2 min, 去上清液。10去除管壁上所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無可見的液體為止或用真空泵干燥。11用20 mL含RNA酶（20 mg/mL）TE（pH 8.0）溶解核酸，稍加振蕩，貯存于-20。12電泳觀查結(jié)果。注意：1煮沸的時間應(yīng)準(zhǔn)確掌握40 s，用鑷子夾住，不要燙手。2異丙醇沉淀核酸放置冰箱中半小時效果更好。六、作業(yè)與思考題1異丙醇和乙醇

19、沉淀核酸有什么異同?2為什么要將附于管壁的液滴除盡？3殘留的乙醇對質(zhì)粒有什么影響?實驗三 動物組織樣品DNA的分離提取一、原理和用途提取液中的SDS能溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。EDTA可抑制DNA酶的活性，同時用蛋白酶K消化細(xì)胞，降解蛋白質(zhì)。然后用酚、氯仿抽提去除溶液中的蛋白質(zhì)，得到含DNA的水溶液。由于DNA不溶于乙醇，然后用乙醇沉淀DNA。用此方法得到的DNA長度為100150 kb，適用于Southern雜交分析、以噬菌體為載體構(gòu)建基因組文庫和DNA多態(tài)分析等。二、實驗材料鮮或冷凍的動物組織，如脾臟，肝臟，心臟，腎臟等。三、溶液與緩沖液1 勻漿緩沖液STE：100

20、mmol/L NaCl10 mmol/L TrisHCl，pH 8.025 mmol/L EDTA，pH 8.0。2 消化緩沖液：100 mmol/L NaCl10 mmol/L TrisHCl，pH 8.025 mmol/L EDTA，pH 8.00.5% SDS0.1 mg/mL 蛋白酶K（臨用前加）。3 無DNA酶的RNA酶(10 mg/L)：將胰RNA酶溶于10 mmol/L TrisHCl，pH 7.5，15 mmol/L NaCl溶液中，使?jié)舛葹?0 mg/L，于100 水浴處理15 min，以降解DNA酶，緩慢冷卻到室溫，20保存。4 TE緩沖液：10 mmol/L TrisHC

21、l，pH 8.01 mmol/L EDTA，pH 8.05 平衡酚:氯仿:異戊醇25:24:1（體積比）。6 3 mol/L NaAc，pH 5.2：稱取408 g NaAc3H2O溶于水，用3 mol/L乙酸調(diào)節(jié)至pH 5.2。7 無水乙醇。8 70冷乙醇四、儀器設(shè)備及耗材臺式離心機(jī)，組織勻漿器，高壓滅菌鍋，恒溫水浴鍋，微量取液器，一次性過濾器，1.5 mL離心管，20 mL、200 mL、1000 mL微量移液器及吸頭，五、實驗方法1 先將動物組織進(jìn)行預(yù)處理：大的器官應(yīng)該切成易處理的小塊（1 cm3）以便凍存（用液氮）及處理。任何組織都可采用，但是，如需肝臟，在殺動物之前應(yīng)該禁食24 h，

22、可提高DNA的質(zhì)量。收集的組織可以在70下保存幾年。2 取0.2 g組織塊剪碎后，加入2.0 mL勻漿緩沖液，用組織勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在（冰浴操作）。3 將組織細(xì)胞的勻漿液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 5000 r/min離心3060 s。棄上清液，沉淀物中再加2倍體積的勻漿緩沖液，離心，收集沉淀。4 沉淀中加入0.4 mL消化緩沖液，輕輕反轉(zhuǎn)混勻，5055 溫育1218 h。5 加入RNA酶至終濃度200 mg/mL，37水浴1 h。6 加入等體積酚氯仿異戊醇，緩慢顛倒離心管使兩相均勻混合形成乳濁液，3500 r/min，4離心10 min。7 用擴(kuò)口吸頭小心吸出離心管中的上層液

23、體，即為含DNA的水相，注意不要吸中間界面上一層厚的白色物質(zhì)（蛋白質(zhì)沉淀）。然后加入等體積氯仿異戊醇，3500 r/min，4離心10 min。(如果界面或水相中含蛋白質(zhì)沉淀較多，可重復(fù)操作67)8 用擴(kuò)口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加入1/10體積NaAc，充分混勻，然后加入2倍體積的無水乙醇，充分混勻，置202 h。9 12000 r/min，4離心15 min，棄上清液，得到的沉淀加入1 mL 70冷乙醇洗滌，離心，獲得沉淀，室溫干燥。加入50 mL TE緩沖液溶解，即可得到基因組DNA。20冰箱保存。如果要對提取的DNA進(jìn)行完整性鑒定，可通過瓊脂糖凝膠。方法是取1 ml溶解的DNA

24、樣品，在0.8的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用溴化乙錠染色觀察結(jié)果。六、作業(yè)與思考題1 從動物組織中分離總DNA時，應(yīng)采取哪些措施獲得高分子量的DNA？2 分離DNA時，使用的酚溶液應(yīng)如何處理，為什么？實驗四 動物全血樣品中DNA的分離提取一、原理和用途通過蛋白酶K和SDS消化破碎細(xì)胞，用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)，用乙醇或異丙醇沉淀出DNA。此法獲得的DNA分子量較大，約為150200 kb，純度較高，可以用于構(gòu)建以噬菌體為載體的基因組文庫、PCR實驗和DNA多態(tài)分析等。二、實驗材料動物全血血樣。三、溶液與緩沖液1磷酸鹽緩沖液（PBS）：NaCl 4 g Na2HPO4 0.72 gKCl 0.1 g K

25、H2PO4 0.12 g 依次溶解后，用HCl調(diào)pH 7.4，定容至500 mL，高壓滅菌。2DNA提取緩沖液：10 mmoll/L TrisHCl ，pH 7.80.1 mol/L EDTA ，pH 8.020 mg/mL 胰RNA酶0.5 SDS 3蛋白酶K，20 mg/mL4飽和酚，pH 8.05氯仿（Chloroform）610 mol/L NH4Ac7TE溶液：10 mmol/L TrisHCl，pH 7.81 mmol/L EDTA870、100乙醇9透析液：50 mmol/L TrisHCl，pH8.010 mmol/L EDTA，pH8.010ACD：檸檬酸 0.48 g檸檬酸

26、鈉 1.32 g右旋葡萄糖 1.47 g加水至 100 mL四、儀器設(shè)備及耗材制冰機(jī)，冰箱，冷凍離心機(jī)，恒溫水浴鍋，高壓滅菌鍋，旋渦振蕩器，20 mL、100 mL、1000mL微量移液器，吸頭，吸管，50 mL離心管，10mL離心管，EP管。五、實驗方法1 樣品預(yù)處理：將20 mL新鮮血液與3.5 mL ACD抗凝液混勻，0下可保存數(shù)天或70下長期凍貯，備用。2 新鮮血液：將10 mL血液1300 g離心15 min，棄上清液（血漿），將黃色下層小心吸出移至1個新離心管中，再離心1次，吸去上層白細(xì)胞于1個新的離心管。凍貯血液：將10 mL ACD貯凍血液于室溫水浴中解凍后移入1個離心管中，加

27、入等體積PBS混勻后，3500 g離心15 min，棄去含裂解紅細(xì)胞的上清。3 將白細(xì)胞沉淀物懸浮于3.5 mL DNA提取緩沖液中，37保溫1 h后，加入20 mg/mL的蛋白酶K至終濃度為100 mg/mL，邊加邊用玻璃棒輕輕攪拌，使溶液至粘稠狀。4 5055保溫3 h，裂解細(xì)胞，消化蛋白。保溫過程中，應(yīng)不時輕輕搖勻反應(yīng)液。5 將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入等體積飽和酚溶液，溫和地上下轉(zhuǎn)動離心管混勻兩相，反復(fù)該動作10 min，直至水相與酚相混勻成乳狀液，若沒有達(dá)到這種效果，可用多角度搖蕩混勻器溫和地混勻1 h。6 室溫5000 g離心15 min，使用大口徑（直徑0.3 cm）吸管小心吸出上層

28、粘稠水相，移至另一個干凈離心管中，重復(fù)步驟5、6，用酚抽提2次，氯仿抽提1次。7 透析處理：為了提取200 kb左右的高分子量DNA，在酚、氯仿抽提后，將DNA溶液裝入透析袋中（留出大于樣品體積1.52倍的空間）于4透析，每次透析液1 L，換4次透析液，直至透析物OD270小于0.05。8 沉淀處理：對于100150 kb大小的DNA提取，在3次酚、氯仿抽提后，將上層水相移入1個新離心管中，加入0.2倍容積的10 mol/L乙酸銨和2倍容積100乙醇，室溫下輕慢搖動搖勻，當(dāng)即可看到乳白色絲狀DNA沉淀出現(xiàn)，用1個自制前端為鉤狀的玻璃棒撈出DNA纖維，立刻放入70乙醇中漂洗2次。室溫5000 g

29、離心，棄上清液，室溫?fù)]發(fā)痕量乙醇，不要使DNA沉淀完全干燥，按5106個細(xì)胞DNA提取物加入1 mL TE（pH 8.0）溶解DNA，一般需要1224 h后。9 在用之前，須測定DNA樣品的濃度。測定DNA樣品在260 nm和280 nm的OD值，計算DNA含量和A260A280的比值，判斷DNA的純度，若有必要可用脈沖場電泳（PFGF）觀察DNA片段的大小。20冰箱保存注意：1 ACD抗凝液的配方由Gustafaon于1987年報道，對于高分子量DNA的分離，該溶液保貯血液的效果優(yōu)于EDTA。用做抗凝劑時，每6 mL新鮮血液加1 mL ACD液。2 飽和酚的pH值應(yīng)接近8.0，這樣可以減少離

30、心后水酚雙相的交界面（主要是蛋白質(zhì)）上有DNA滯留，有利于在下一步吸出水相時不帶動界面中的蛋白質(zhì)。酚的pH太低，DNA也會溶于有機(jī)相中。六、作業(yè)與思考題1 用于構(gòu)建基因組文庫的DNA在質(zhì)量上有什么要求？2 對于高分子量DNA的分離，哪種抗凝劑保貯血液的效果好？實驗五 從動物組織中提取線粒體DNA一、原理和用途動物的線粒體DNA是一個約為16.5 kb大小的環(huán)狀DNA分子。在哺乳動物中，mtDNA的遺傳過程嚴(yán)格遵守單性母性遺傳方式。由于mtDNA的結(jié)構(gòu)簡單，一級結(jié)構(gòu)的堿基替代率高，世代間沒有重組。它以成為研究生物起源進(jìn)化、探討生物群體間遺傳關(guān)系的一個重要研究對象。動物線粒體DNA(mtDNA)的

31、提取采用差速離心的方法。先將細(xì)胞破碎，使線粒體從細(xì)胞中釋放出來，通過低速離心使大的細(xì)胞碎塊和細(xì)胞核沉淀，含有線粒體的上清液再高速離心分離出線粒體，用堿性溶液作用破壞線粒體膜，用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)，用乙醇或異丙醇沉淀出DNA。此DNA可用于PCR分析、序列分析和限制酶切分析。二、實驗材料動物各種內(nèi)臟組織或血液。三、溶液與緩沖液1. Homo緩沖液：0.25 mol/L Sucrose0.01 mol/L EDTA0.03 mol/L TrispH 8.0 高壓滅菌2. Lysis緩沖液：0.01 mol/L Tris0.15 mol/L NaCl0.01 mol/L EDTApH 8.0 高壓滅

32、菌3. NaOH/SDS溶液：0.18 N NaOH0.1% SDS(由2 N NaOH und 10% SDS新鮮配制)4. KAC溶液：6.00 mL 5 mmol/L KAC1.15 mL 冰乙酸2.85 mL H2O deion.5. 酚（Phenol）pH 8.06. 氯仿（Chloroform） 7. 100和70 乙醇8. TE緩沖液:10 mmol/L Tris1 mmol/L EDTApH 8.0 高壓滅菌四、儀器設(shè)備及耗材制冰機(jī)，冰箱，高壓滅菌鍋，冷凍高溫超速離心機(jī)，常溫高速離心機(jī)，旋渦振蕩器，組織勻漿器，離心管架，真空干燥器，燒杯，試劑瓶，1.5 mL、15 mL離心管，

33、20L、200 L、1000 L微量移液器，20L、200 L、1000 L吸頭，吸頭盒等。五、實驗方法1. 0.51.0 g 的組織勻漿在510倍體積的Homo-緩沖液中，300 g離心 90 s。2. 上清液轉(zhuǎn)到一個新的離心管，18000 g 4離心15 min。3. 上清液小心地到掉，給沉淀物中加入400 mL Lysis-緩沖液，用加樣槍混勻。4. 加入 800 mL NaOH/SDS-溶液，瞬時振蕩混勻，冰上放置5 min。5. 加入600 mL冰冷的KAC，瞬時振蕩，冰上放置5 min，11750 g離心5 min。6. 上清液轉(zhuǎn)入一個新試管，向上清液中加入1 mL酚（pH8.0）

34、和1 mL氯仿，短時振蕩。7. 11750 g，離心 3 min，上清液轉(zhuǎn)入一個新試管。8. 為使mtDNA沉淀，加入2倍體積100乙醇，多次口底搖動，20或冰上放置15 min1 h。9. 11750 g，4離心30 min。10. 棄去上清液。加500 mL 70乙醇，勿搖動。11. 11750 g，4離心10 min，上清液傾倒，7 min真空干燥。12. mtDNA沉淀物溶解在20 mL TE緩沖液中，4 冰箱過夜保存。注意： 1 NaOH/SDS-溶液處理嚴(yán)格控制5min，時間過短或過長都會影響提取效果。2 加酚最好在抽風(fēng)櫥下操作！六、作業(yè)與思考題1 為什么動物線粒體DNA常常用于動

35、物親緣關(guān)系與進(jìn)化分析？2 在動物線粒體DNA提取中哪一步很重要的？實驗六 植物組織中DNA的分離提取方法一 SDS法提取植物總DNA一、原理和用途該方法是利用高濃度的SDS在較高溫度（5565）條件下裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸。然后，采用提高鹽濃度及降低溫度的做法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀。離心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。主要用于Southern雜交、PCR擴(kuò)增、RFLP及RAPD分析以及基因組克隆，分離純化目的基因等。二、實驗材料植物的根、莖、葉。三、溶液與緩沖液1提取緩沖液：100 mmol/L TrisHCl (pH 8

36、.0)50 mmol/L EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L NaCl10 mmol/L 巰基乙醇210或者20SDS。33 mol/L NaAc。4氯仿/異戊醇24：15酚/氯仿1：16異丙醇770的乙醇、無水乙醇81mg/mL RNase9TE緩沖液四、儀器設(shè)備及耗材離心機(jī)，水浴鍋，液氮罐，天平，20 mL、200 mL、1000 mL微量移液器，研缽，EP管，120 mL、200 mL、1000 mL吸頭，吸水紙。五、實驗方法（微量提取及純化）1取10 g新鮮葉片，置液氮中研磨成粉。2每人取凍粉0.5 g 置1.5 mL的離心管中，加入提取緩沖液900 mL，輕輕攪動，使粉

37、末充分散開。3各加入100 mL 10SDS，充分混勻，于65水浴中保溫1015 min（間隔晃動23次）。44，12000 r/min離心5 min。5上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置片刻。64，12000 r/min離心5 min。7上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積、20預(yù)冷的異丙醇，混勻，放置30 min，觀察DNA生成。84，12000 r/min離心5 min，傾去上清液，將離心管倒置于吸水紙上，控干上清液。9 用70的乙醇洗滌沉淀，4，12000 r/min離心5 min，傾去上清，吹干1015 min。10加入100 mL TE緩沖液充分

38、溶解沉淀（若溶解不好，可置37水浴中保溫，促進(jìn)溶解）。11將溶液轉(zhuǎn)入EP管中，加入1 mL RNase液，于37保溫1 h。12加入等體積的酚/氯仿，混勻，室溫放置10 min。134，12000 r/min離心5 min。14上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒管混勻，室溫放置幾分鐘后，12000 r/min離心5 min。15轉(zhuǎn)移并量出上清液體積，置新離心管中，加入3 mol/L NaAC溶液，使其終濃度為0.3 mol/L（也可加終濃度為0.2 mol/L NaCl），混勻，加入2倍體積的無水乙醇，輕緩混勻，室溫放置數(shù)分鐘。1612000 r/min離心5 min，去盡

39、上清液。17用70乙醇洗滌沉淀1次，吹干。18加入50 mL TE或dH2O溶解DNA，備用。注意：1. 從步驟11起以后是純化DNA，可以不作，只是提純的DNA含有RNA和其它的物質(zhì)。2. 植物的任何組織均可，以鮮嫩組織為好。六、思考題1植物總DNA都包括那些種類DNA?2為什么把鮮嫩組織在液氮中研磨成粉?3不能用玻璃研缽，為什么？方法二 CTAB法提取植物總DNA 一、原理和用途CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)是一種去污劑，可溶解細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液(0.7 mol/L NaCl)中是可溶的，當(dāng)降低溶液的濃度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)時,從溶液中沉淀，通

40、過離心就可以將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)，多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇沉淀DNA，CTAB能溶解于乙醇。二、實驗材料植物的根、莖、葉。三、溶液與緩沖液1 2CTAB提取緩沖液：100 mmol/L TrisHCl (pH 8.0)20 mmol/L EDTA1.4 mol/L NaCl2% (W/V) CTAB40 mmol/L -巰基乙醇210CTAB： 10CTAB，0.7 mol/L NaCl。31CTAB沉淀緩沖液：50 mmol/L TrisHCl (pH 8.0)10 mmol/L EDTA0.7 mol/L NaCl1% (W/V

41、 ) CTAB20 mmol/L -巰基乙醇4氯仿/異戊醇（24:1）51 mol/L乙酸銨。67.5 mol/L乙酸銨。7異丙醇870%乙醇9TE緩沖液101 mg/mL RNase，四、儀器設(shè)備及材料 離心機(jī)，水浴鍋，液氮罐，天平，微量移液器20 mL，200 mL，1000 mL各一只。五、實驗方法1取10 g新鮮葉片在液氮中研磨成粉末，每人取0.5 g樣品。2將凍粉倒入EP管中，立即加入500 mL 65預(yù)熱的2CTAB提取緩沖液，充分的混勻，65水浴保溫1020 min，其間不斷的搖動。3加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1）輕緩顛倒混勻，室溫12000 r/min，離心10 min。

42、4上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/10體積的10CTAB，混勻，加等體積氯仿/異戊醇（24:1）輕緩顛倒混勻，室溫12000 r/min，離心10 min。5取上清液，重復(fù)步驟4操作一次。6將上清液轉(zhuǎn)入新的經(jīng)硅烷化處理的離心管中，加1倍體積的1CTAB沉淀緩沖液，混勻，室溫放置30 min，觀察沉淀生成。轉(zhuǎn)入物明顯沉淀生成，延長放置時間，隨放置時間延長，沉淀量增加。74000 r/min離心510 min，棄上清液，沉淀吹干。8按0.5 mL/g材料的比例加1 mol/L乙酸銨溶液時，沉淀溶解完全，再加入7.5 mol/L乙酸銨溶液至終濃度為2.5 mol/L。9加入兩倍體積的異丙醇，混勻，室溫

43、放置10 min。10用細(xì)玻璃棒纏出核酸沉淀或12000 r/min 離心5 min，棄去上清液。11用70%乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于TE（50 mL）。12加1 mL濃度1mg/mL RNase，4放置，備用。注意：1上述兩種方法效果都很好，純化的DNA均可用于PCR等實驗。2新鮮葉片在液氮中研磨時，注意不要濺到手上，以免凍傷。六、作業(yè)與思考題1. 沉淀DNA時加入終濃度為2.5 mol/L乙酸銨有什么用途？2. 樣品加入新的經(jīng)硅烷化處理的離心管，為什么？實驗七 植物線粒體DNA的分離提取一、原理和用途通過差速離心除去細(xì)胞核與葉綠體，再離心沉淀獲線粒體，用核酸酶降解纏繞的部分染色體DNA，除

44、去膜后即可獲得線粒體DNA（mtDNA）。該方法獲得的產(chǎn)物可用于遺傳分析，雄性不育的研究，線粒體基因的獲得和線粒體遺傳轉(zhuǎn)化等。二、實驗材料 植物莖葉。三、溶液與緩沖液1線粒體DNA提取液:緩沖液A：30 mmol/L甘露醇50 mmol/L TrisHCl3 mmol/L EDTA0.1% BSA10 mmol/L巰基乙醇，pH 8.0緩沖液B：1.25 mol/L NaCl50 mmol/L TrisHCl20 mmol/L EDTA，pH 8.0緩沖液C：50 mmol/L TrisH Cl10 mmol/LEDTA ，pH 8.0緩沖液D：100 mmol/L NaCl100 mmol/

45、L TrisHCl50 mmol/L EDTA100 mmol/L -巰基乙醇，pH 8.02 裂解緩沖液：4% Sarkosyl0.1 mol/L TrisHCl10 mmol/L EDTA，pH 8.03TE緩沖液：10 mmol/L TrisHCl，pH 8.01 mmol/L EDTA4TAE電泳緩沖液：50TAE儲存液：每1 L含Tris 242.0 g冰乙酸 57.1 mL0.5 mol/L EDTA，pH 8.0， 100 mL5溴化乙錠：1000儲存液： 0.5 mg/mL溴化乙錠溶液 1工作液： 0.5 g/mL溴化乙錠溶液6瓊脂糖凝膠加樣緩沖液： 0.25%（W/V）溴酚藍(lán)

46、，40%（W/V）蔗糖。71 mol/L MgCl2溶液80.7% 瓊脂糖凝膠9苯酚，苯酚/氯仿10異丙醇四、儀器設(shè)備及耗材恒溫振蕩器，高速冷凍離心機(jī)(30K)，TGL-16離心機(jī)，臺式離心機(jī)（4 K），恒溫水浴鍋，普通冰箱( 4.C)，低溫冰箱(20.C )，穩(wěn)壓電泳儀(500 V，300 mA)，紫外檢測儀( 254 nm )，微型水平電泳槽。100 mL燒杯，50 mL量筒，1.5 mLP管，20200 mL、1000 mL吸頭，10 mL吸頭，刻度離心管，50 mL塑料離心管，乳缽，剪刀，紗布，吸水紙。五、實驗方法1線粒體的分離(1) 植物莖葉50 g剪碎，加入100 mL預(yù)冷的緩沖液

47、A（按1：2比例），搗碎后，四層無菌紗布過濾。(2) 液體1000 g離心10 min，棄沉淀。(3) 上清液12000 g離心15 min，棄上清液。(4) 加入10 mL緩沖液A懸浮沉淀，2000 g離心10 min，棄沉淀。(5) 給上清液中加入1 mol/L MgCl2使終濃度為10 mmol/L，DNase至100 mg/mL，冰上放置1 h。(6) 然后加入3倍體積的緩沖液B，輕輕混勻，12000 g離心15 min，棄上清液。(7) 沉淀懸浮于50 mL緩沖液C中，12000 g離心15 min，棄上清液。(8) 重復(fù)此步驟3次，沉淀用于mtDNA的提取。2線粒體DNA的分離(1

48、) 上述沉淀用600 mL緩沖液D，抽提一次，12000 g，離心15 min取上清液。(2) 用600 mL苯酚、苯酚/氯仿各抽提一次，12000 g，離心15 min，取上清液。(3) 然后加入2/3體積異丙醇，于-20放置大約20 min沉淀DNA。(4) 12000 g離心15 min收集沉淀。(5) 70%乙醇12000 g離心5 min洗滌沉淀。(6) 去乙醇，干燥。(7) 溶解于20 mL TE中。(8) 0.7%瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA譜帶。注意：1植物莖葉以鮮嫩為好，菠菜，洋蔥較常用。2核酸酶降解纏繞的染色體DNA步驟是獲得純線粒體DNA的關(guān)鍵。六、作業(yè)與思考題1為什么用0.

49、7%瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA譜帶？2加入3倍體積的緩沖液B的作用是什么?實驗八 植物葉綠體DNA提取一、原理和用途 葉綠體是綠色植物特有的進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，是核外相對獨立的遺傳體系，但又受到核基因組的控制。目前已用于高等植物葉綠體DNA提取的方法有DNase I法、蔗糖密度梯度離心法。研究葉綠體DNA（CpDNA）的結(jié)構(gòu)和功能，對作物改良、提高光合效率、探索細(xì)胞器的起源、進(jìn)化和基因組結(jié)構(gòu)分析及細(xì)胞器遺傳轉(zhuǎn)化都具有重要的意義。提取植物葉綠體DNA用于細(xì)胞器基因組結(jié)構(gòu)分析及細(xì)胞器遺傳轉(zhuǎn)化。二、實驗材料 植物葉片、愈傷組織、原生質(zhì)體等。三、溶液與緩沖液1. 細(xì)胞器分離緩沖液：300 mmol/L

50、山梨醇50 mmol/L TrisHCl，pH 8.05 mmol/L EDTA0.1% BSA0.1% -巰基乙醇2. DNase緩沖液：細(xì)胞器分離緩沖液中含有13 mmol/L MgCl2，使用前加入DNase至250 mg/L。3. 沖洗緩沖液：150 mmol/L NaCl50 mmol/L TrisHCl，pH 8.025 mmol/L EDTA，pH 8.0。4. 裂解緩沖液：150 mmol/L TrisHCl，pH 7.220 mmol/L EDTA。5. 20% Sarkosyl溶液（溶解于裂解緩沖液中）。6. 0.5 mol/L EDTA，pH 8.07. 52% 及30%

51、 蔗糖液：將蔗糖溶于50 mmol/L TrisHCl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA，0.1% BSA混合液中。8. 1.6 mol/L、1.2 mol/L、0.6 mol/L蔗糖液：將蔗糖溶解于50 mmol/L TrisHCl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA，0.1% BSA混合液中。9. 1 mol/L CsCl/EB溶液：1 mol/L CsCl50 mmol/L TrisHCl，pH 8.010 mmol/L EDTA0.2 mg/L EB。10. 7 mol/L CsCl/EB溶液：7 mol/L CsCl，0.1% Sarkosyl0.2 mg/L EB

52、。11. CsCl飽和的異丙醇：0.5 mol/L EDTA，pH 8.0，3 mol/L NaAc。12. 二乙醚13. 3 mol/L NaAc14. 無水乙醇四、儀器設(shè)備及耗材高速冷凍離心機(jī)(30 K)，超速離心機(jī)，TGL-16 離心機(jī)(20 K)，旋渦混合器，勻漿器，電熱恒溫水浴鍋，普通冰箱，低溫冰箱(-80)，穩(wěn)壓電泳儀(500 V，300 mA)，微型水平電泳槽，真空抽干機(jī)，可見光分光光度計。150 mL燒杯，250 mL燒杯，1000 mL無菌燒杯，50 mL離心管，200 mL離心管，1000 mL吸頭，超速離心管，透析袋，硅化離心管，4層無菌細(xì)布。五實驗方法1材料預(yù)處理及勻漿

53、(1) 取100 g葉片或5070 g愈傷組織，二乙醚處理，冷蒸餾水洗滌后切割成小塊，置勻漿器中，加入400 mL 4預(yù)冷的細(xì)胞器分離緩沖液，中速勻漿12 min。(2) 用4層無菌細(xì)布將勻漿過濾到1 L無菌燒杯中。2差速離心分離細(xì)胞器(1) 勻漿液轉(zhuǎn)入無菌分離管中，4、700 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液至另一個離心管中。(2) 上清液于4、2000 g離心10 min，去上清液，沉淀置冰浴中放置，準(zhǔn)備進(jìn)行葉綠體DNA提取。3 DNase處理除核DNA污染(1) 將上述沉淀懸浮于25 mL DNase緩沖液中，于冰上放置1 h，其間不時搖動。(2) 加入EDTA溶液至終濃度為20 mmol/L，終止反應(yīng)。