1、高效液相色譜講解1. 高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較高速：高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時。典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時。高效：高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？商畛湮镱w粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：高靈敏度：檢測器靈敏度極高：檢測器靈敏度極高：UV10-9g

2、, 熒光檢測器熒光檢測器10-11g。2. HPLC與與GC的比較的比較分析對象及范圍：分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有機物總數(shù)的機物總數(shù)的20%；HPLC可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機物總數(shù)的物質(zhì)占有機物總數(shù)的80%。流動相的選擇：流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種采用的流動相中為有限的幾種“惰性惰性”氣體，只起運載作用，氣體，只起運載作用，對組分作用??；對組分作用?。籋PLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，

3、可供選擇的機會多。采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機會多。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。操作溫度：操作溫度：GC需高溫；需高溫；HPLC通常在室溫下進行。通常在室溫下進行。結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來看，結(jié)論：從色譜分析的發(fā)展來看，HPLC比比GC更為有用、更具發(fā)展前途！更為有用、更具發(fā)展前途！3. 應(yīng)用應(yīng)用 由于由于HPLC分離分析的高靈分離分析的高靈敏度、定量的準確性、

4、適于非敏度、定量的準確性、適于非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定組分的分析，因此，在工業(yè)、科學研究，尤因此，在工業(yè)、科學研究，尤其是在生物學和醫(yī)學等方面應(yīng)其是在生物學和醫(yī)學等方面應(yīng)用極為廣泛。如氨基酸、蛋白用極為廣泛。如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、質(zhì)、核酸、烴、碳水化合物、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、藥品、多糖、高聚物、農(nóng)藥、抗生素、膽固醇、金屬有機物抗生素、膽固醇、金屬有機物等分析，大多是通過等分析，大多是通過HPLC來來完成的。完成的。 右圖是各種右圖是各種HPLC方法的應(yīng)方法的應(yīng)用范圍及對象用范圍及對象極性增極性增加加不溶于不溶于水水溶于水溶于水非極性非極性離子離子非

5、離子極性非離子極性吸附吸附反向分反向分配配分配分配正向分正向分配配離子交離子交換換尺寸排尺寸排阻阻凝膠滲凝膠滲透透凝膠過凝膠過濾濾分分子子量量17.2 HPLC儀器儀器 HPLC儀器包括：儀器包括： 高壓輸液裝置高壓輸液裝置; 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng); 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng); 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng); 此外還配有梯度淋洗、此外還配有梯度淋洗、自動進樣和數(shù)據(jù)處理裝置。自動進樣和數(shù)據(jù)處理裝置。 其工作過程如圖所示。其工作過程如圖所示。He儲液瓶儲液瓶分布器分布器過濾過濾2 m高壓泵高壓泵入口檢查入口檢查出口檢查出口檢查脈流消除脈流消除抽氣抽氣過濾器過濾器反壓調(diào)節(jié)反壓調(diào)節(jié)壓力計壓力計注樣閥注樣閥分離柱分離柱到檢測器

6、到檢測器HPLC儀器詳解儀器詳解1. 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金合金)，其孔很約，其孔很約2 m，可防止，可防止顆粒物進入泵內(nèi)。顆粒物進入泵內(nèi)。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去（氣泡會影響檢測）。子量小的氣體透過膜從溶劑中除去（氣泡會影響檢測）。3）高壓泵：）高壓泵：對輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動、可調(diào)范圍寬、耐腐蝕。對輸液泵的要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動、可

7、調(diào)范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。 恒壓泵恒壓泵(類似于風箱類似于風箱)可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復推動時，會引起脈動，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充大，在往復推動時，會引起脈動，且輸出流量隨色譜系統(tǒng)阻力（主要是柱填充物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。物）變化而變化，現(xiàn)已較少使用。 恒流型恒流型溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機械注射式和機溶劑流量恒定，與柱填充情況無關(guān)，使用較多。有機械注射式和機械往復式兩種。應(yīng)用最多的是機械往復式恒流泵械往復式兩種。應(yīng)用最多的是機

8、械往復式恒流泵(見下圖。每分鐘往復見下圖。每分鐘往復25100次，因此脈動小。對流量變化敏感的檢測器也會有噪聲干擾，此時可連接一脈次，因此脈動小。對流量變化敏感的檢測器也會有噪聲干擾，此時可連接一脈動阻尼器動阻尼器)。馬達馬達往復式拉動往復式拉動密封密封溶劑溶劑球閥球閥脈動阻脈動阻尼器尼器到色譜柱到色譜柱機械往復柱塞泵示意圖機械往復柱塞泵示意圖4）梯度淋洗裝置：在分離過程中逐漸改變流動相組成的裝置。如果只有一）梯度淋洗裝置：在分離過程中逐漸改變流動相組成的裝置。如果只有一個泵，可采用低壓混合設(shè)計（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合，再由高個泵，可采用低壓混合設(shè)計（將兩種或以上的溶劑按一定比例混合

9、，再由高壓泵輸出）；如果有兩個或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。壓泵輸出）；如果有兩個或以上泵，調(diào)節(jié)各自的流量，在高壓下混合。2. 進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng) 與與GC相比，相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對要小些。柱要短得多，因此由于柱本身所產(chǎn)生的峰形展寬相對要小些。即，即，HPLC的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進樣系統(tǒng)、連接管道及的展寬多因一些柱外因素引起。這些因素包括：進樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器的死體積。進樣裝置包括兩種。檢測器的死體積。進樣裝置包括兩種。1）隔膜注射進樣：使用微量注射器進樣。裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重）隔膜注射進樣：使用微量注射

10、器進樣。裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。現(xiàn)性差。2）高壓進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣）高壓進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，重復性好，如圖。準確，重復性好，如圖。裝入樣品裝入樣品出口出口進樣進樣采樣環(huán)采樣環(huán)泵入溶劑泵入溶劑進色譜柱進色譜柱3. 色譜柱色譜柱1）對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。）對色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為柱長多為1030cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為45mm(尺寸排阻色譜柱常大于尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)，制備色譜柱內(nèi)

11、徑更大徑更大)；2）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為：）柱的填充：主要采用勻漿法。根據(jù)使用勻漿試劑的性質(zhì)不同可分為：平衡密度法平衡密度法： 使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法非平衡密度法： 采用粘度較大的試劑，如采用粘度較大的試劑，如CCl4，CH3OH, 丙酮，二氧雜環(huán)已烷、丙酮，二氧雜環(huán)已烷、THF等。等。填充方法：填充方法： 填充時，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中

12、，然填充時，按上述方法制作勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無空氣進入、且無空氣進入(影響填充均勻性影響填充均勻性)。4. 檢測器檢測器 液相色譜檢測器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、液相色譜檢測器包括紫外吸收、熒光發(fā)射、示差折光和安培檢測器等。示差折光和安培檢測器等。1）紫外檢測器）紫外檢測器 其檢測原理和其檢測原理和UV-Vis方法一樣。只是此時方法一樣。只是此時所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程

13、所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為為2-10mm, 體積約為體積約為110 L。 HPLC分析中，約有分析中，約有80%的物質(zhì)可以在的物質(zhì)可以在254 nm或或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測器應(yīng)用很廣。器應(yīng)用很廣。 在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓在選擇測量波長時注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑所選擇的光透過，即所選波長不能小于溶劑的最低使用波長。的最低使用波長。石英窗石英窗接色譜柱接色譜柱UV光電倍增管光電倍增管廢液廢液波長波長可的松可的松氟美松氟美松皮質(zhì)酮皮質(zhì)酮快速掃描快速掃描光電二極管陣列（光電二極管陣列（PDA）檢測所

14、獲得的三維色譜）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖光譜圖2）熒光檢測器）熒光檢測器 許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一許多有機物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強的活性。熒光檢測器是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高檢測器高23個數(shù)量級。個數(shù)量級。3）示差折光檢測器）示差折光檢測器原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因為發(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強

15、度差溶劑相）光因為發(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強度差發(fā)生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。發(fā)生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。 為通用型檢測器，靈敏度為為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源光源調(diào)零調(diào)零光學零光學零參比參比樣品樣品平面鏡平面鏡透鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換光電轉(zhuǎn)換記錄儀記錄儀放大器放大器遮光板遮光板4）安培檢測器）安培檢測器 由恒電位儀和一薄層反應(yīng)由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為池（體積為15 L）組成。如）組成。如圖。圖。 該檢測器是利用待測物流該檢測器是利用待測物流入反應(yīng)池時在工

16、作電極表面發(fā)入反應(yīng)池時在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過，此電流大小與就有電流通過，此電流大小與待測物濃度成正比。待測物濃度成正比。 采用安培檢測器時，流動采用安培檢測器時，流動相必須含有電解質(zhì)，且呈化學相必須含有電解質(zhì)，且呈化學隋性。它最適于與反相色譜匹隋性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測器只能檢測具有配。但此檢測器只能檢測具有電活性的物質(zhì)。電活性的物質(zhì)。接參比電極接參比電極和對電極和對電極接色譜柱接色譜柱Teflon塑料塊塑料塊1 cm工作電極工作電極(Pt, Au, 碳糊碳糊)5）電導檢測器）電導檢測器 電導檢測器主要用于離子色譜的檢測。電

17、導檢測器主要用于離子色譜的檢測。 其原理是基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導（電阻的倒數(shù)）其原理是基于待測物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質(zhì)的含量。變化來測量電離物質(zhì)的含量。 電導檢測器的主要部件是電導池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導檢測器的主要部件是電導池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導池置于恒溫箱中。另外，當電導池置于恒溫箱中。另外，當pH7時，該檢測器不夠靈敏。時，該檢測器不夠靈敏。 其它檢測器還包括：其它檢測器還包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector(光光散射散射)、極譜等。、極譜等

18、。17.3 HPLC流動相和固定相簡介流動相和固定相簡介一、流動相一、流動相 與與GC流動相不同，流動相不同，HPLC流動相為溶劑，它既有運載作用，又和固定相一樣，流動相為溶劑，它既有運載作用，又和固定相一樣，參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇對分離十分重要。參予對組分的競爭，因此溶劑的選擇對分離十分重要。 理想的溶劑應(yīng)有下列特性：理想的溶劑應(yīng)有下列特性：1）對待測物具一定極性和選擇性；）對待測物具一定極性和選擇性；2）使用）使用UV檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長檢測器時，溶劑截止波長要小于測量波長(為什么？為什么？) ；使用折光率檢；使用折光率檢 測器，溶劑的折光率要與待測物的折光率有較

19、大差別；測器，溶劑的折光率要與待測物的折光率有較大差別；3）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時可使截止波長增加；）高純度。否則基線不穩(wěn)或產(chǎn)生雜峰，同時可使截止波長增加；4）化學穩(wěn)定性好；）化學穩(wěn)定性好；5）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，易產(chǎn)生氣泡。）適宜的粘度。粘度過高，柱壓增加；過低，易產(chǎn)生氣泡。二、固定相載體二、固定相載體 由于各種由于各種HPLC分離方法的流動相均為液體，因此，分離方法的流動相均為液體，因此，HPLC通常是按照固定通常是按照固定相載體或固定液的不同來分類的。相載體或固定液的不同來分類的。1. 按承受壓力分按承受壓力分剛性固體：剛性固體：SiO2為基質(zhì)，耐壓為為基

20、質(zhì)，耐壓為7.01081.0109 Pa。可制成直徑、形狀和孔隙。可制成直徑、形狀和孔隙 深度不同的顆粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜；深度不同的顆粒；主要用于吸附、分配和鍵合色譜；硬硬 膠：以聚合物為基質(zhì)膠：以聚合物為基質(zhì)(常用苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成常用苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成)，耐壓上限為，耐壓上限為3.5 108 Pa, 主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。主要用于離子交換和尺寸排阻色譜。2. 按孔隙深度分按孔隙深度分表面多孔型：以實心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料表面多孔型：以實心玻璃珠為基體，在基體表面覆蓋一層多孔活性材料(如硅膠、如硅膠、 氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚

21、酰胺等氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的。表面多孔型固定相的 顆粒大顆粒大(易裝柱易裝柱)、多孔層厚度小且孔淺、多孔層厚度小且孔淺(滲透性好，出峰快滲透性好，出峰快)；但交；但交 換容量小。適于常規(guī)分離分析。換容量小。適于常規(guī)分離分析。全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細，因而孔徑小、傳全多孔型：全部由硅膠或氧化鋁微粒聚集而成，因顆粒極細，因而孔徑小、傳 質(zhì)快、質(zhì)快、 柱效高。特別適于復雜混合物的分離。柱效高。特別適于復雜混合物的分離。3. 按分離原理分：按分離原理分： 分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等分配色譜、吸附色譜、離子交

22、換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等17.4 高效液相色譜方法各論高效液相色譜方法各論 按分離原理可將按分離原理可將HPLC分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等?，F(xiàn)在作分別介紹。阻色譜和親和色譜等?，F(xiàn)在作分別介紹。一、分配色譜一、分配色譜 原理：原理： 根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進行多次，造成各配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進行多次，造成各待測物的遷移速率不同

23、，從而實現(xiàn)分離的過程。待測物的遷移速率不同，從而實現(xiàn)分離的過程。2. 流動相流動相:1. HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或分析中，為防止固定相的流失，流動相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，者說二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為可將液液色譜分為正相分配色譜正相分配色譜（流動相極性小于固定相極性，極性小的先流（流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和出，適于極性組分分離）和反相分配色譜反相分配色譜（流動相極性大于固定相極性，極性（流動相極

24、性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。大的先流出，適于非極性組分分離）。2. 固定相固定相 原則上，用于原則上，用于GC的固定相也可用于的固定相也可用于HPLC作固定相。但作固定相。但HPLC固定液固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為： , -氧二丙腈氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇、聚乙二醇(PEM)、三甲撐二醇、三甲撐二醇(TMG)、十八烷、十八烷(C18)、角鯊烷、角鯊烷(SQ)。 根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機械涂漬型和化學鍵合型，后根據(jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機械涂漬型和化學鍵合型，后者應(yīng)用更為廣

25、泛。者應(yīng)用更為廣泛。1）機械涂漬固定相：）機械涂漬固定相：將固定液通過機械混合的方法涂漬到表面多孔型將固定液通過機械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量涂布量)或全多孔型載體或全多孔型載體(5-10%涂布量涂布量)上形成的液液色譜固定相上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。合梯度淋洗。 為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱前置柱，該柱涂有與，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進入分析柱之前

26、，預(yù)先被固分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動相進入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。定液飽和。2）化學鍵合固定相）化學鍵合固定相 化學鍵合固定相是通過化學反應(yīng)將有機分子鍵合在載體表面所形成的柱填化學鍵合固定相是通過化學反應(yīng)將有機分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點。這種固定相分離機理既不是充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點。這種固定相分離機理既不是簡單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之。化學鍵合的表面覆簡單的吸附，也不是單一的液液分配，而是二者兼而有之?；瘜W鍵合的表面覆蓋度決定哪種機理起主要作用。對多數(shù)鍵合相來說，以分配機理為主。蓋度決定

27、哪種機理起主要作用。對多數(shù)鍵合相來說，以分配機理為主。 通常，化學鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：通常，化學鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：Si-O-R：對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強極性會水解，使酯鏈斷裂，因此只適于對熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強極性會水解，使酯鏈斷裂，因此只適于 以不含水或醇的流動相。以不含水或醇的流動相。Si-R(或或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使 用水溶液作流動相時，其用水溶液作流動相時，其pH應(yīng)在應(yīng)在4-8之間。之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在不水解，熱穩(wěn)

28、定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。范圍內(nèi)對水穩(wěn)定。HClSiROSiiClSROHSi)(RSiClSiOHSi)(ROSiOHROHSi)(33RMgClRLiSOClSOCl22 硅硅烷烷化化方方法法三三先先氯氯化化方方法法二二硅硅酯酯化化方方法法一一或或固定相極性小固定相極性小 如硅膠如硅膠-C18，硅膠硅膠-苯基；苯基； 流動相極性大流動相極性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和無機鹽的緩沖液。水、水和無機鹽的緩沖液。 反相鍵合色譜法反相鍵合色譜法 分析對象分析對象 多用于多環(huán)芳烴多用于多環(huán)芳烴(PAHs)等低極性化合物分離；改變流等低極性化合物分離；改變流動相配比，動相配比，也

29、可分離極性化合物；緩沖液可用于易離也可分離極性化合物；緩沖液可用于易離解的化合物，如有機解的化合物，如有機有機酸、有機酸、有有機機堿和酚堿和酚類類。 固定相極性固定相極性大大 硅膠硅膠-OH(或雙或雙-OH)，硅膠硅膠-CN 流動相極性流動相極性小小 烴類烴類+適量極性溶劑適量極性溶劑(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相鍵合色譜法相鍵合色譜法 分析對象分析對象 多用于極性或中等極性化合物的分離。多用于極性或中等極性化合物的分離。還可用于分離還可用于分離異構(gòu)體、異構(gòu)體、極性不同的化合物以及不同類型的化合物。極性不同的化合物以及不同類型的化合物。 3. 正相和反相鍵合色譜法正相和反相鍵合

30、色譜法 正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加，組分分配比正相鍵合色譜中，隨流動相極性增加，組分分配比k增加。增加。 在在HPLC分析中，有時要在流動相中加入適量的鹽分析中，有時要在流動相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽碳酸銨、四烷基銨鹽)或酸，為或酸，為什么？答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留什么？答：都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。 何為正相色譜，何為反相色譜？何為正相色譜，何為反相色譜？正相色譜正

31、相色譜低極性流動相低極性流動相反相色譜反相色譜高極性流動相高極性流動相中等極性流動相中等極性流動相中等極性流動相中等極性流動相時間時間時間時間時間時間時間時間待測物極性：待測物極性：ABC正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系時間，時間，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅膠硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。可見：

32、反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。二、離子交換色譜二、離子交換色譜 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽離子的此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測定各類陰、陽離子的分離分析方法。它既適于無機離子，也適于有機物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、分離分析方法。它既適于無機離子，也適于有機物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。核酸等。1. 原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂固定相上帶電荷基團或游離的離子發(fā)生實現(xiàn)分離的。待測離子與離子交換樹脂

33、固定相上帶電荷基團或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：可逆交換反應(yīng)： 對陽離子，滯留順序為：對陽離子，滯留順序為： Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, UO22+, Tl+, Ag+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+, Li+ 對陰離子，滯留順序為：對陰離子，滯留順序為：檸檬酸根檸檬酸根, SO42-, C2O4, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- 思考：待測陽離子電荷越小、其水合離子的

34、半徑越大，則越先出峰？對嗎？思考：待測陽離子電荷越小、其水合離子的半徑越大，則越先出峰？對嗎？ ClXNRRXClNR-R:HMSORMHSO-R:33-3-3陰陰離離子子交交換換陽陽離離子子交交換換2. 固定相固定相 按離子交換劑類型分四種：按離子交換劑類型分四種： 按固定相制作方法可分為：按固定相制作方法可分為： 多孔型離子交換樹脂多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹脂；包括薄膜型）離子交換樹脂； 離子交換鍵合型。離子交換鍵合型。 類型類型 官官能能團團 強強陽陽離離子子交換交換劑劑 -SO3- 陽陽離離子子交換交換劑劑

35、 弱弱陽陽離離子子交換交換劑劑 -CO2- 強強陰陰離離子子交換交換劑劑 -NR3+ 陰陰離離子子交換交換劑劑 弱弱陰陰離離子子交換交換劑劑 -NH2+ 1）多孔型：）多孔型： 聚苯乙烯聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團多和大孔型。交換基團多交換容量大，交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。析速度慢。2）表面多孔型：）表面多孔型： 薄膜型薄膜型=惰性核惰性核+樹脂薄層樹脂薄層(1-2 m) 多孔型多孔型=惰性核惰性核+硅膠微球硅膠微球+樹脂薄層。樹脂薄層。 克服了多孔型離子交換樹脂的不足，克服了多孔型離子

36、交換樹脂的不足，但交換容量低，柱子易超負荷。但交換容量低，柱子易超負荷。3）離子交換鍵合相：利用化學反應(yīng)將離）離子交換鍵合相：利用化學反應(yīng)將離子交換基團鍵合到惰性載體表面。載體子交換基團鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子。耐壓、高柱效的柱子。微孔型微孔型 大孔型大孔型微孔微孔微孔微孔薄膜型薄膜型 表面多孔型表面多孔型離子交換層離子交換層惰性核惰性核惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆離子交換劑硅膠層涂覆3. 流動相流動相 離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶

37、液離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液(有一定有一定pH和離子強度和離子強度) ，通過改變，通過改變pH、緩、緩沖劑類型、離子強度、加入有機試劑和配位劑等條件來控制分配比沖劑類型、離子強度、加入有機試劑和配位劑等條件來控制分配比k，改變交換劑，改變交換劑的選擇性，進而影響樣品待測物的分離。的選擇性，進而影響樣品待測物的分離。pH值：值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分數(shù)。當組分以分子形影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分數(shù)。當組分以分子形式存在時，則不被保留；離子分數(shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、式存在時，則不被保留；離子分數(shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽

38、、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。離子強度離子強度I：對保留值的影響比對保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。更大。組分保留值受流動相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽離子將增加它們對增加外加陰或陽離子將增加它們對R+或或R-的競爭能力，使組分保留值減小。通的競爭能力，使組分保留值減小。通過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因為不同物質(zhì)對交換劑的親和能力不同。過加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因為不同物質(zhì)對交換劑的親和能力不同。有機溶劑：有機溶劑：外加有機溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用外加有機溶劑通常減小組分的保留值。其

39、極性越小，保留值越小。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。的有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。配離子配離子L：當大量當大量L、組分、組分X隨流動相進入柱后，發(fā)生配位劑交換：隨流動相進入柱后，發(fā)生配位劑交換：RM-L+X RM-X+L該法用于分離各種氨基酸或堿類。該法用于分離各種氨基酸或堿類。思考：離子交換色譜法中，流動相常以無機鹽的緩沖液為流動相。請問緩沖液的思考：離子交換色譜法中，流動相常以無機鹽的緩沖液為流動相。請問緩沖液的pH值及離子強度對分離各有何影響？值及離子強度對分離各有何影響？三、離子色譜三、離子色譜 離子色譜離子色譜(IC)是是70年代發(fā)展的新方法。其分

40、離原理與離子交換色譜原理一樣，年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導檢測器檢測。但由于流動相都是強電解質(zhì)，其電導率比只是流出的各種離子用電導檢測器檢測。但由于流動相都是強電解質(zhì)，其電導率比待測離子約高待測離子約高2個數(shù)量級，這種強背景電導會完全掩蓋待測離子信號。個數(shù)量級，這種強背景電導會完全掩蓋待測離子信號。 為解決此問題，為解決此問題，1975年年Small 提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹脂

41、。通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼У牧鲃酉?，從而可用電導檢測器柱，使具有高背景電導的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼У牧鲃酉?，從而可用電導檢測器檢測各種離子的含量。檢測各種離子的含量。例如：分析陽離子時，以無機酸為流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換樹例如：分析陽離子時，以無機酸為流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+OH + HCl(流動相流動相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待測物待測物) R+Cl + M+OH-可見，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿?？梢姡粌H

42、大量酸轉(zhuǎn)化為低電導的水，而且待測離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。 該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離度。因此有人提出了使用電導率很低的溶液分離度。因此有人提出了使用電導率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液如苯甲酸鹽稀溶液)作流動相。作流動相。思考：思考：IC分離中，何為抑制柱？分析陰離子時，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹脂？分離中，何為抑制柱？分析陰離子時，抑制柱中應(yīng)填充何種離子交換樹脂？四、離子對色譜法（四、離子對色譜法（IPC） 離子對色譜主要用來分離強極性有機酸和有機堿。離子對色譜主要用來分離強

43、極性有機酸和有機堿。1. 原理：將與待測物離子原理：將與待測物離子A電荷相反的離子電荷相反的離子B（稱為對離子或反離子）加入到（稱為對離子或反離子）加入到流動相（常為有機相）中，使待測離子流動相（常為有機相）中，使待測離子A與對離子與對離子B形成離子對形成離子對AB，該，該AB離離子對子對的性質(zhì)與的性質(zhì)與A離子離子或或B離子離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離子的保留特性。的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離子的保留特性。例如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，于流動相中加入與待測離子例如：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，于流動相中加入與待測離子A-有相反電荷的離子有相反電荷的離子B+： 由

44、于離子對由于離子對AB具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測離子具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測離子A1，A2，A3.因與因與B離子間的成對能力不同，而形成不同疏水性的離子對，使離子間的成對能力不同，而形成不同疏水性的離子對，使得各待測物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達到分離的目的。得各待測物在柱內(nèi)的保留值不同，從而達到分離的目的。思考：有一強極性有機酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流動相中應(yīng)加入陰離思考：有一強極性有機酸混合物，若用離子對色譜法分離，請問在流動相中應(yīng)加入陰離子還是陽離子來開成離子對？子還是陽離子來開成離子對？ 有有機機相相水水相相水水相相BABA五、尺寸排阻色譜法五、尺寸排阻色譜法 尺寸排阻色譜又稱凝膠尺寸排阻色譜又稱凝膠(滲透滲透)色譜，主要用于大分子的分子分離