1、淺談PCR技術(shù)的發(fā)展與創(chuàng)新歷程姓名：婁旭學號：201218010015088單位：植物逆境生物學研究中心PCR又稱聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction),是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷。PCR的問世，引起了一場分子生物學的革命，它大大加快了各種生物基因組結(jié)構(gòu)研究的過程，有力地推動了現(xiàn)代生物學由細胞水平向分子水平、基因水平的發(fā)展，在分子生物學史上具有跨時代的意義。首先，我們來了解一下PCR

2、技術(shù)的基本原理。PCR技術(shù)是一種選擇性體外擴增DNA片段的方法，其特異性是由兩個人工合成的引物序列決定的。所謂引物就是與待擴增DNA片段兩翼互補的寡核甘酸。待擴增DNA模板加熱變性后，兩引物分別與兩條DNA的兩翼序列特異復性。在合適的條件下，由DNA聚合酶催化引物介導的DNA合成，即引物的延伸。一個變性，退火，延伸的過程就是一個循環(huán)，PCR就是在合適條件下這種循環(huán)的不斷重復，每一循環(huán)所得到的產(chǎn)物又可作為下一循環(huán)的模板，以此類推，以后每一循環(huán)模板均比前一循環(huán)增加一倍，理論上講，PCR擴增DNA產(chǎn)物是呈指數(shù)上升的。簡單來說，PCR就是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點

3、，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。接下來，我們來了解一下PCR技術(shù)產(chǎn)生白背景。20世紀70年代，遺傳工程”、重組DNA”和克隆”等科學技術(shù)進步產(chǎn)物的興起，使生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)炙手可熱，它以效率和創(chuàng)造性為標志，為科學和商業(yè)提供了聲望和商機，在科學進展與新產(chǎn)品開發(fā)和衛(wèi)生保健行業(yè)發(fā)展直接掛鉤的投資氛圍下，分子生物學在美國蓬勃發(fā)展起來，也產(chǎn)生了孕育PCR技術(shù)的大環(huán)境：(1)重組工程”和其他分子技術(shù)的重大突破；(2)具備了鼓勵科研成果快速向應(yīng)用問題轉(zhuǎn)化的法規(guī)環(huán)境；(3)政府資助的研究與尋求投資的風險資本密切結(jié)合，為分子生物學的研究和開發(fā)奠定了雄厚的基礎(chǔ)。由此，在對

4、核酸研究了將近100年后，人們開始致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設(shè)想：經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。但由于當時很難進行測序和合成寡核甘酸引物，且當時Smith等發(fā)現(xiàn)了DNA限制性內(nèi)切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設(shè)想被人們遺忘。1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈式反應(yīng)：在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件-模板DNA,寡核甘酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸

5、的溫度與時間，并推出了第一臺熱循環(huán)PCR儀。Mullis也由此獲得了1993年的諾貝爾化學獎。從最初技術(shù)設(shè)想的提出到目前各種PCR方法的應(yīng)用，PCR技術(shù)在分子生物學中已經(jīng)有了四十多年的歷史，短短四十年中，PCR及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展速度是驚人的。國際上分別于1988年和1990年在美國和英國召開了第一屆和第二屆PCR技術(shù)專題研討會。第一屆會議主要討論了PCR的應(yīng)用與技術(shù)本身的優(yōu)化問題；第二屆會議的主要議題是人類基因組計劃與PCR的最新進展。這充分體現(xiàn)了生物學家對PCR的重視。接下來，本人就PCR技術(shù)PCR技術(shù)的方法和手段，可以將其發(fā)展的發(fā)展歷程和技術(shù)創(chuàng)新做簡要的介紹。根據(jù)各階段歷程分為以下四個階段

6、。（一）初創(chuàng)期Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點是：（1）引物鏈延伸反應(yīng)在37c下進行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。（2）Klenow酶不耐高溫，90c會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴增具備許多突出的優(yōu)點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4

7、DNA聚合酶進行PCR,其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。技術(shù)創(chuàng)新過程：1988年Saiki等從美國黃石公園溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌（thermusaquaticus）中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：（1）在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。（2）耐高溫，在70c下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%,在93c下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%,在95c下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。（3）大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度（2.0Kb）。由于提高了擴增的特異性和效率，因而

8、其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶（TaqDNAPolymerase）,此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR得到更為廣泛的應(yīng)用。（二）奠基期此階段的PCR技術(shù)由于沒有可以自動升降溫的儀器裝置而采用手動或機械操作，三個恒溫水浴箱，分別恒定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94C）,低溫復性溫度（如58C）,適溫延伸溫度（如72C）。再用一個裝有PCR標本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴，標本在每個水浴箱中恒溫的時間用秒表計時。這樣PCR標本就能完成下述形式的熱循環(huán)：94C30S,58C45S,72C60S,進行40次循環(huán)。這種方法的特點是：

9、實驗人員勞動強度大，容易因疲勞引起差錯；而優(yōu)點是：設(shè)備簡單，投資少，與自動化基因擴增儀相比，它無須升降溫過程，實驗時間短，試驗更接近理想PCR反應(yīng)條件，事實表明實驗效果還是不錯的，但由于標本試管從一個水浴箱往另一個水浴箱移動中要較短暫暴露于空氣中，因此如移動速度不夠快時也會對標本形成溫度干擾，影響結(jié)果。本方法的另外一些缺點包括只能局限三個溫階（某些PCR反應(yīng)需要多于三個溫階）、液體污染以及在低氣壓地區(qū)水溫難以燒到94C變性溫度等。創(chuàng)新過程：為改進提高本方法的自動化水平，有人設(shè)計了機械手裝置，替代上述手工移動標本過程，形成了機械手水浴式基因擴增儀，該改進解決了實驗人員的高強度勞動問題，但又帶來了

10、一個機械手部件大行程頻繁相對運動而引起的高故障。這種類型的基因擴增儀曾為我國的分子生物學的發(fā)展做出過積極貢獻。(三)發(fā)展期此階段的PCR技術(shù)是發(fā)展過程中的經(jīng)典時期，是目前應(yīng)用最為廣泛最為普遍的PCR技術(shù)，之后發(fā)展起來的新技術(shù)都是在此基礎(chǔ)上進行的擴展。在此階段，具有代表性的就是自動化控制型定性基因的擴增儀即PCR儀的應(yīng)用。PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴增儀。它的要求是要使體積不大的PCR反應(yīng)液在盡可能短的時間內(nèi)迅速實現(xiàn)變溫，既要保證反應(yīng)液達到要求的溫度，又要使它迅速轉(zhuǎn)換到下一溫度，轉(zhuǎn)換時間越短則擴增的特異性越高。目前國內(nèi)外使用做多的PCR儀的主要變溫方式有變溫鋁塊和變溫氣流式。創(chuàng)新過程：隨

11、著PCR技術(shù)的發(fā)展，PCR儀也在不斷改進：用加熱蓋取代油封的加熱塊型儀器，可防止在管蓋上的冷凝作用，并能顯著降低微量管中樣品內(nèi)的溫度梯度；反應(yīng)加熱塊的構(gòu)造和外形也在不斷改進，加熱蓋在許多儀器上已經(jīng)標準化，用于冷卻的帕爾帖元件也更可靠；多種形式的載樣系統(tǒng)不斷出現(xiàn)，如微量管、微量滴定板、毛細管甚至載玻片都已用于PCR反應(yīng)。與第二階段的水浴式擴增儀相比，也有人稱該種擴增儀為干式基因擴增儀，它是最具代表性的擴增儀，是后續(xù)各種擴增儀發(fā)展的基礎(chǔ)。(四)成熟期PCR技術(shù)經(jīng)歷了各種創(chuàng)新與改進后在最近十來年成為一種成熟的分子生物學手段。它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定；從原先只能擴增幾個Kb的基因到目前已能

12、擴增長達幾十個Kb的DNA片段，PCR技術(shù)已越來越被人們所掌握。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，下面主要就免疫PCR、反向PCR、原位PCR和實時定量PCR來介紹PCR技術(shù)在這一階段的發(fā)展及應(yīng)用。(1)免疫PCR免疫PCR是一種抗原檢測系統(tǒng)，將一段已知序列的DNA片段標記到抗原抗體復合物上，再用PCR方法將這段DNA擴增，然后用常規(guī)方法檢測PCR產(chǎn)物。免疫PCR結(jié)合了免疫反應(yīng)和PCR的特點，集PCR的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性于一體。與常規(guī)PCR和普通ELAS相比，免疫PCR優(yōu)勢明顯，其突出的特點是指數(shù)級的擴增效率帶來了極高的敏感度，能檢測出濃度低至2ng/L的抗原物質(zhì)，為現(xiàn)行任何一

13、種免疫定量方法所不及。免疫PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)在醫(yī)學免疫學領(lǐng)域的主要擴展，它常被用于激素和細胞因子的檢測、生化酶類的檢測、治病微生物的檢測、寄生蟲感染的檢測機其他毒素或蛋白的檢測，因其檢測效率高，在醫(yī)學科研工作者中備受青睞。(2)反向PCR反向PCR又稱為染色體緩移，可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，利用在已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對此段DNA進行酶切，在DNA連接酶的作用下自然形成環(huán)狀DNA分子，然后利用方向合適并與已知序列兩端互補的引物，以連接成環(huán)的DNA為模板，這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3'端是相互反向的，經(jīng)PCR擴增，

14、得到已知序列上下游的旁側(cè)DNA片段。反向PCR技術(shù)在檢測病毒、轉(zhuǎn)座子等在基因組中的整合位點，建立基因組步移文庫及研究基因的上游調(diào)控元件等方面優(yōu)勢明顯?，F(xiàn)已制備了酵母人工染色體(YAC)大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。與常規(guī)PCR相比，反向PCR優(yōu)勢突出，但它需要從許多酶中選擇一種合適的限制性內(nèi)切酶進行酶切，另外，由于大多數(shù)真核基因組含有大量中度和高度重復序列，從而導致反向PCR得到的探針與多個基因序列雜交，影響擴增效果。(3)原位PCR與原位反轉(zhuǎn)錄PCR原位PCR技術(shù)是將PCR高效擴增與原位雜交的細胞定位相結(jié)合，在組織細胞水

15、平原位檢測單拷貝的特定DNA或RNA序列。原位發(fā)轉(zhuǎn)錄PCR是指先將細胞核組織進行處理以獲得濕度的細胞通透性，再通過逆轉(zhuǎn)錄使mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后把載玻片放入熱循環(huán)機，對靶DNA等細胞內(nèi)靶目標在原位進行PCR擴增，最后通過檢測標記產(chǎn)物的方法檢測擴增產(chǎn)物。原位PCR技術(shù)是細胞學科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù)。它既能分辯鑒定帶有靶序列的細胞，又能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置，于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)歸有重大的實用價值。原位反轉(zhuǎn)錄PCR常被用于擴增和檢測標本中罕見的mRNA,如定量細胞表達特殊mRNA的豐度。檢測擴增產(chǎn)物的細胞起源及檢測細胞群中基因表達的

16、趨勢等。(4)實時定量PCR實時PCR又稱熒光定量PCR或TaqManPCR,是美國PE公司(PerkinElmer)于1995年研制出的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上運用熒光能量傳遞(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術(shù)，加入熒光標記探針，巧妙地把核算擴增、雜交、光譜分析和實時檢測技術(shù)結(jié)合在一起，借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物。一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5'

17、;核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導致實時定量PCR方法在研究工作中的運用。PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)方式增加的，隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統(tǒng)的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終擴增產(chǎn)物，因此用此終點法對PCR產(chǎn)物定量存在不可靠之處。在實時熒光定量PCR中，對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的監(jiān)測和連續(xù)地分析擴增相關(guān)的熒光信號，隨著

18、反應(yīng)時間的進行，監(jiān)測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應(yīng)早期，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，而后熒光的產(chǎn)生進入指數(shù)期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測PCR產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在實時熒光定量PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個域值是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達

19、到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR的優(yōu)勢：設(shè)備由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設(shè)備相連的計算機收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實時設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進行正?；幚韥韽浹a背景熒光的差異。正?；罂梢栽O(shè)定域值水平，這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。樣品到達域

20、值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（限制點的循環(huán)數(shù)）。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴增效率為最大，這樣可以獲得最準確，可重復性的數(shù)據(jù)。如果同時擴增的還有標有相應(yīng)濃度的標準品，線性回歸分析將產(chǎn)生一條標準曲線，可以用來計算未知樣品的濃度。實時熒光定量PCR要用定量PCR儀，目前常見的儀器有PE公司的PE系列，羅氏公司的Lightcycle系列，Robbett公司的RG系列。而根據(jù)熒光化學原理不同可分為DNA結(jié)合染色、TaqMan技術(shù)、Amplisensor、分子燈塔、復合探針法、雜交探針、自身淬滅技術(shù)等。目前，熒光定量PCR已被應(yīng)用與病原體測定、免疫分析、腫瘤基因測定、基因表達、突變和多態(tài)性研究。除以上所介

21、紹的四種新型PCR技術(shù)外，多重PCR,兼并引物PCR和重組PCR等其他的PCR技術(shù)均在各自的領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用，小結(jié)從Mullis發(fā)明PCR技術(shù)我們可以看到：開發(fā)創(chuàng)造性思維的求異性關(guān)鍵在于一個思”字。分子生物學處于生命科學中的前沿學科地位，這就決定了每個分子生物學工作者面對的是一條前人所沒有走過的路，肩負著在荊棘叢生的知識荒野上開辟新路的重任?，F(xiàn)有的書本和理論盡管一般說來是正確的，但畢竟只是對現(xiàn)階段研究成果的總結(jié)，并非毫無紙漏可言，百分之百地絕對正確。迷信書本理論，有可能成為開發(fā)創(chuàng)造性思維的障礙。我們應(yīng)該保持思維的開放性，既不受各種思維框框，如傳統(tǒng)、權(quán)威、書本等束縛，又要善于吸收新的信息，容忍不同的見解，使自己的思維處于活躍、靈敏、兼容并蓄和實事求是的狀態(tài)。而縱觀PCR技術(shù)發(fā)展的這四十多年，每一次的飛躍都不開技術(shù)的創(chuàng)新和改革。Taq酶的發(fā)現(xiàn)從本質(zhì)上突破了PCR技術(shù)發(fā)展的瓶頸，自動式PCR儀