1、2. 離子對色譜離子對色譜(針對強極性的有機酸、有機堿的分離）針對強極性的有機酸、有機堿的分離） 離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱為對離子或反離子）相反的離子（稱為對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對，從而控制溶質(zhì)離子的保留值而對溶質(zhì)離子進行分離的色譜法。 離子對色譜法其分離原理與離子對萃取原理萃取原理相似： Baq+ + Paq- （B+P-）aq 離子對的體積大，又無靜電荷，所以有顯著的疏水性，能優(yōu)先地溶于極性的有機相中。如果選擇合適的反選擇合適的反離子，并調(diào)節(jié)至合適的濃度，就能夠?qū)㈦x子，并調(diào)節(jié)至合適的濃度，就能夠?qū)a

2、q+ 有效地萃取有效地萃取到有機相中。到有機相中。3 3 離子色譜法離子色譜法( (Ion Chromatography,簡稱IC)以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象, 在七十年代出現(xiàn)、八十年代迅速發(fā)展。傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個難于解決的問題：1.需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時間很長；2.洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的再線檢測方法。原理: 采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相，在分離柱后，用另外一支抑制柱來消除淋洗液的高本底電導;采用電導檢測器檢測流出組分?？焖俜蛛x分析微量無機離子混合物;各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速.離子色譜連續(xù)抑制裝置圖（離子色譜連續(xù)抑制裝置圖（

3、分析陰離子，洗脫液分析陰離子，洗脫液NaOH)R-OH(陰離子交換樹脂)+NaBr=R-Br+NaOH(交換、洗脫)R-H(陽離子交換樹脂)+NaOH =R-Na+H2O R-H +NaBr=R-Na+HBr（H離子淌度大） 電導值小 離子色譜的應用離子色譜的應用陰離子分析陰離子分析: : 雙柱：薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3250mm),流動相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在350 ppm，五五. . 空間排阻色譜空間排阻色譜 空間排阻色譜也稱空間排阻色譜也稱凝

4、膠滲透色譜，它是基于試樣分凝膠滲透色譜，它是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來實行分離的。子的尺寸和形狀不同來實行分離的。 填充劑是凝膠。填充劑是凝膠。它是一種表面惰性，含有許多不同它是一種表面惰性，含有許多不同尺寸的孔穴或立體網(wǎng)狀物質(zhì)。凝膠的孔穴或立體網(wǎng)孔的尺寸的孔穴或立體網(wǎng)狀物質(zhì)。凝膠的孔穴或立體網(wǎng)孔的大小與被分離的試樣分子的大小相當。大小與被分離的試樣分子的大小相當。太大的分子由于不能進入孔穴而被排斥，先隨流動相流太大的分子由于不能進入孔穴而被排斥，先隨流動相流出。出。小分子則完全相反，它能進入孔穴而完全不受排斥，小分子則完全相反，它能進入孔穴而完全不受排斥，所以最后流出。所以最后流出。中等

5、大小的物質(zhì)分子則可以滲到較大的空隙中，但受到中等大小的物質(zhì)分子則可以滲到較大的空隙中，但受到較小空隙的排斥，所以介于兩者之間。較小空隙的排斥，所以介于兩者之間。 凝膠是一種多孔性的高分子聚合體，表面布滿孔隙，能被流動相浸潤，吸附性很小。凝膠色譜法的分離機制是根據(jù)分子的體積大小和分子的體積大小和形狀不同形狀不同而達到分離目的。凝膠色譜法的作用機制體積大于凝膠孔隙的分子，由于不能進入孔隙而被排阻，直接從表面流過，先流出色譜柱；小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受排阻，然后又從孔隙中出來隨載液流動，后流出色譜柱；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。

6、凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進行分離的一種色譜分析方法。凝膠色譜法的固定相軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠和硬質(zhì)凝膠三種。凝膠色譜法的應用特點 保留時間是分子尺寸的函數(shù)，適宜于分離相對分子分離相對分子 質(zhì)量大的化合物，質(zhì)量大的化合物，相對分子質(zhì)量在4008105的任 何類型的化合物保留時間短，色譜峰窄，容易檢測固定相與溶質(zhì)分子間的作用力極弱，趁于零，柱的 壽命長不能分辨分子大小相近的化合物，分子量相差需在 10%以上時才能得到分離 化學鍵合固定相一般利用化學鍵合固定相一般利用硅膠硅膠為基體，利用硅膠表為基體，利用硅膠表面的硅醇基與有機分子之間成鍵，即可得到各種極性的面的硅醇基與有機分子之間成鍵，即

7、可得到各種極性的固定相。固定相。鍵合上去的有機基團主要有三類：鍵合上去的有機基團主要有三類： 疏水基團疏水基團 極性基團極性基團 離子交換基團離子交換基團3.4 3.4 化學鍵和固定相化學鍵和固定相鍵合的途徑主要有：鍵合的途徑主要有： 用用醇醇或胺與硅醇基反應或胺與硅醇基反應 -Si-Si-OH + -OH + ROHROH- - -Si-Si-OR-OR + H + H2 2O O 用用有機氯硅烷有機氯硅烷與硅醇基反應與硅醇基反應 -Si-Si-OH + -OH + R R3 3SiClSiCl- - -Si-OSiR-Si-OSiR3 3 + HCl + HCl 通過氯化硅膠與有機鋰或格式

8、試劑反應通過氯化硅膠與有機鋰或格式試劑反應 -Si-Si-OH + SOCl-OH + SOCl2 2- - -Si-Cl-Si-Cl -Si-Cl + Rli -Si-Cl + Rli或或RMgCl-RMgCl-Si-RSi-R（一）反相鍵合相色譜法（一）反相鍵合相色譜法 固定相 極性小極性小 -C18H37 -C6H5 -C8H17等 流動相 極性大 甲醇/水，乙睛/水，水和無機鹽的緩沖液（二）極性鍵合相色譜法（二）極性鍵合相色譜法 固定相 極性基團 -CN -NH2 -OH -極性大極性大 流動相 非極性或極性小的溶劑-極性小（三）離子性鍵合相色譜法（三）離子性鍵合相色譜法 -SO3H，

9、-CO2H，-N+R3，-NH 2 固定相 極性大 流動相 極性小鍵合相色譜法的特點：鍵合相色譜法的特點：*鍵合到載體上的基團不易流失*適合于梯度洗脫*可以有效地分離非極性，極性和離子型的化合物。*不適于酸堿度過大或存在氧化劑的體系。 液相色譜法的流動相液相色譜法的流動相*純度*不能引起柱效損失*對試樣有適宜溶解度*粘度小*與檢測器匹配*極性（先選中等極性，按保留時間，多次實驗確定）3.5 3.5 高效液相色譜儀高效液相色譜儀儲液器高壓泵梯度洗脫裝置餾分收集器記錄儀檢測器色譜柱進樣器高效液相色譜儀的方框圖高效液相色譜儀的方框圖五個部分：五個部分：高壓輸液系統(tǒng)、高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色進樣系統(tǒng)

10、、色譜柱、檢測系譜柱、檢測系統(tǒng)、附屬系統(tǒng)。統(tǒng)、附屬系統(tǒng)。一一. 高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng) 色譜柱細，固定相填料粒度小-阻力大-要達到快速高效的分離-高壓泵輸送流動相。要求：流量穩(wěn)定 壓力平穩(wěn)無脈動 流速有一定的可調(diào)范圍 恒壓泵 恒流泵 梯度洗提裝置應用梯度洗提，可以提高分離效果。梯度洗提法：在分離的過程中，應用梯度洗提裝置，按一定的程序按一定的程序改變兩種或兩種以上不同極性的溶劑之間的比例，使流動相的成分和極性產(chǎn)生相應的變化，從而改變復雜物質(zhì)中不同極性的組分的相對保留值，提高分離效果，加快分析速度。 要將試樣“濃縮地”瞬時地注入。 1.注射器進樣（隔膜進樣） 2.高壓定量進樣閥 帶壓進樣 停流

11、進樣 六通進樣閥六通進樣閥 泵柱進樣排放泵排放進樣柱二. 進樣系統(tǒng)三三. 色譜柱色譜柱發(fā)展趨勢： 填料粒度小 柱徑小標準柱型： 4.6mm或 3.9mm l: 15-30cm填料粒度：5-10m裝柱技術(shù)：干法：填料粒度大于20m時可用。 濕法（勻漿法）1. 1. 要求要求 靈敏度高 噪音低 線性范圍寬 響應快 死體積小，對溫度和流速變化不敏感四四. 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)2. 2. 分類分類 溶質(zhì)型檢測器：對組分組分的物理或物理化學特性的物理或物理化學特性有響應紫外、熒光、電化學 總體檢測器：對試樣或洗脫液試樣或洗脫液總的物理或物理化學總的物理或物理化學特性特性有響應示差折光、介電常數(shù)、蒸發(fā)光散射檢

12、測器4.檢測器應具有：靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、定量準確、適應范圍廣等特點，同時還應該對溫度和載液流速的變化不敏感。v可用的檢測器有：紫外、折光、電導、熒光、極譜等v常用的檢測器有：紫外-可見光度檢測器和差示折光檢測器紫外-可見光度檢測器一種小型的裝有流動池的雙光束光度計紫外-可見光度檢測器靈敏度很高，檢測限可達10-9gmL-1優(yōu)點：這種檢測器對溫度和流速不 敏感，適宜于梯度洗提缺點：不能用于對紫外-可見光完全不吸收的試樣的檢測差示折光檢測器 一種濃度型檢測器，是通過連續(xù)測定測量池中溶液折射率的變化來測定組分的濃度。優(yōu)點：凡與流動相折射率不同的組分，都可以用差示折 光檢測器來檢測，所以差

13、示折光檢測器是一種 通用型通用型檢測器。差示折光檢測器的靈敏度可達 10-7gmL-1。缺點：對溫度和流速的波動很敏感。表表3-1 液相色譜檢測器液相色譜檢測器 一覽表一覽表規(guī)格 紫外 折光 氫火焰氫火焰 熒光 放射性 極譜 電導 紅外類型 選擇型 普通 普通 選擇型 選擇型 選擇型 選擇型 選擇型可否梯度洗脫 能 否 能 能 能 否 否 能線性動態(tài)范圍上限 2.56 10-3 10-8 - - 210-5 1000 1.5線性范圍 510-4 10-4 10-5 10-3 大 104 210-4 104 %噪音下標靈敏度 0.005 10-5 10-11 0.005 - 210-6 0.00

14、5 0.01對適當樣品的靈敏度510-10 510-7 10-8 10-9-10-10 50 10-10 10-8 10-6 g/mL g/mL g/mL g/mL Ci /Ml g/mL g/mL g/mL 對流速的敏感性 無 無 有 無 無 有 有 無對溫度的敏感性 低 10-4/ 可忽略 低 可忽略 1.5%/ 2%/ 低五. 附屬系統(tǒng) 脫氣裝置 梯度洗脫裝置* 再循環(huán)裝置 恒溫裝置 自動進樣裝置 餾分收集裝置 數(shù)據(jù)處理裝置五個部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、五個部分：高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱、檢測系統(tǒng)、附屬系統(tǒng)。色譜柱、檢測系統(tǒng)、附屬系統(tǒng)。（四）高效液相色譜分離的選擇1.高效液相色

15、譜法的運用范圍氣相色譜法適用于分析相對分子質(zhì)量較小，容易揮 發(fā)成氣體的物質(zhì)。氣相色譜法控制溫度可達300，熱穩(wěn)定性差的物質(zhì) 在此溫度下將發(fā)生分解，但高沸點物質(zhì)在此溫度下 也不能完全氣化高沸點、熱穩(wěn)定性差的有機化合物、以及相對分子 質(zhì)量大(大于400)的有機物(約占有機物總數(shù)的 70%80%)，均不宜應用氣相色譜法進行分析，但可 以應用高效液相色譜法進行分析。高效液相色譜法在常溫下常溫下進行分離與分析，不會導致 被測物質(zhì)的熱分解，其流動相是液體，所以只要試樣 能制備成溶液，原則上都可以用高效液相色譜法分離 與分析，如離子型化合物、不穩(wěn)定天然產(chǎn)物以及氨基 酸、蛋白質(zhì)等高分子化合物均可用高效液相色譜

16、法獲 得較好的分離效果。 2.高效液相色譜分離方法的選擇選擇的基本依據(jù)相對分子質(zhì)量的大?。合鄬Ψ肿淤|(zhì)量的大?。簩τ谙鄬Ψ肿淤|(zhì)量在200以下、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好的化合物，可采用氣相色譜法；相對分子質(zhì)量在2002000的化合物，可用液-固色譜法、液-液色譜法、離子交換色譜法相對分子質(zhì)量大于2000的試樣，適宜用凝膠色譜法進行分離試樣的溶解性能迅速溶于水的樣品，可采用反相液-液色譜法；若試樣全部或大部分能溶于HCl或NaOH溶液，表示試樣屬于離子型化合物，可采用離子交換色譜法來分離；溶于非水溶性溶劑(如己烷、異辛烷、苯、甲苯等烴類)的試樣，可選用液-固吸附色譜法;溶于二氯甲烷或三氮申烷的試祥，選用常

17、規(guī)的液-液色譜(正相色譜)法和吸附色譜法；溶于甲醇等溶劑的試樣，則可以用反相液-液色譜法進行分離與分析。紙層析和薄層層析法紙層析和薄層層析法( (介紹）（制備、電泳不講介紹）（制備、電泳不講) ) 紙層析和薄層層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動力源。不使用動力源。一、紙層析和薄層層析分離過程一、紙層析和薄層層析分離過程 紙層析和薄層層析流動相的移動是依靠毛細作用。將試樣點在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢?，并將該端浸在作為流動相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經(jīng)過試樣點時，帶動試樣向上運動。操作技術(shù)操作技術(shù)層析紙和層析板層析紙和層析板: : 特制的色層濾紙。按需要剪裁成長條形（或筒型）。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200250目）均勻地涂在長條形玻璃板上（厚度0.150.5mm）。干燥后即可使用。展開劑：展開劑：由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1。點樣點樣: : 用微量注射器或玻璃毛細管吸取一定量試樣點在原點上。試樣點的直徑一般應小于5mm?？刹⑴劈c多個試樣同時展開。顯色檢測：顯色檢測：有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點描繪出來。常用的顯色方