1、短命植物對(duì)鹽脅迫的生理響應(yīng) 組長(zhǎng)：吳凱凱組長(zhǎng)：吳凱凱 組員：張玲、楊春艷、組員：張玲、楊春艷、 禹飛雄、翟鵬飛禹飛雄、翟鵬飛過氧化物酶活性的測(cè)定f一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膄 過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，其活性高過氧化物酶是植物體內(nèi)重要的呼吸酶類，其活性高低與酶類物質(zhì)代謝，植物抗性密切相關(guān)。通過實(shí)驗(yàn)掌握提低與酶類物質(zhì)代謝，植物抗性密切相關(guān)。通過實(shí)驗(yàn)掌握提取取PODPOD和測(cè)定其活性方法和原理。和測(cè)定其活性方法和原理。 f二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理f 過氧化物酶催化過氧化物酶催化H H2 2O O2 2氧化酶類，生成醌類化合物，氧化酶類，生成醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合或與其它分子縮合，產(chǎn)

2、生顏色較深產(chǎn)此化合物進(jìn)一步縮合或與其它分子縮合，產(chǎn)生顏色較深產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為底物，過氧化物酶催化物。本實(shí)驗(yàn)以愈創(chuàng)木酚為底物，過氧化物酶催化H2O2H2O2將愈將愈創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物，次產(chǎn)物在創(chuàng)木酚氧化成茶褐色產(chǎn)物，次產(chǎn)物在470nm470nm波長(zhǎng)處有最大波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故可通過測(cè)定吸收峰，故可通過測(cè)定470nm470nm波長(zhǎng)下的吸收光度變化得知波長(zhǎng)下的吸收光度變化得知過氧化物酶的活性。過氧化物酶的活性。 f三、材料與試劑及儀器三、材料與試劑及儀器 f材料：馬鈴薯材料：馬鈴薯 試劑：試劑：20m mol/L KH20m mol/L KH2 2PO4,PO4,反應(yīng)混合液反應(yīng)混合液

3、f儀器：分光光度計(jì)，研缽，恒溫水浴鍋，儀器：分光光度計(jì)，研缽，恒溫水浴鍋， 100 mL 100 mL 容量瓶，吸管，容量瓶，吸管， 離心機(jī)。離心機(jī)。 f四、方法步驟：四、方法步驟： f 1 1、 酶液制備：稱取材料酶液制備：稱取材料1.079g1.079g，加入，加入20m mol/L KH20m mol/L KH2 2PO4 5ml,PO4 5ml,于研于研缽中研磨成勻漿，在缽中研磨成勻漿，在 3000r/min 3000r/min，下離心，下離心10min,10min,上清液轉(zhuǎn)入上清液轉(zhuǎn)入25ml,25ml,容量瓶，容量瓶，殘?jiān)儆脷堅(jiān)儆?ml, KH5ml, KH2 2PO4,PO4

4、,提取一次，定容，混勻，貯于冷涼處備用。提取一次，定容，混勻，貯于冷涼處備用。 f（反應(yīng)混合液：（反應(yīng)混合液： 100 mol 100 mol L L 磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（ pH6.0 pH6.0 ） 50 mL 50 mL 于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚 28 l 28 l ，于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入 30 % 30 % 過氧化氫過氧化氫 19 l 19 l ，混合均，混合均勻，保存于冰箱中。）勻，保存于冰箱中。）f疑問為什么制備方法不一樣疑問為什么制備方法不一樣2 2、 比色測(cè)

5、定：光徑比色測(cè)定：光徑1cm1cm比色杯兩只，比色杯兩只，1 1只先加只先加1ml KH2PO41ml KH2PO4，再加，再加3ml3ml混合混合液作參比液；液作參比液； 另一只加另一只加1ml,1ml,酶液，酶液，3ml3ml混合液，立即計(jì)時(shí)并置于分光光混合液，立即計(jì)時(shí)并置于分光光度計(jì)中，在度計(jì)中，在470nm470nm下測(cè)定光密度，每隔下測(cè)定光密度，每隔1min1min讀數(shù)一次，連續(xù)測(cè)讀數(shù)一次，連續(xù)測(cè)8min8min，每次，每次測(cè)定前重新對(duì)照校準(zhǔn)。測(cè)定前重新對(duì)照校準(zhǔn)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果f吸光度變化值吸光度變化值A(chǔ)= A2-A1A= A2-A1fV1V1提取酶液的總量提取酶液的總量 fV2V2測(cè)

6、定取酶液的量測(cè)定取酶液的量 f酶活力（酶活力（0.01 A470/L0.01 A470/L）=(A2-A1)/0.01(t2-t1)=(A2-A1)/0.01(t2-t1)* *(V2/V1) (V2/V1) f =328.2 =328.2f 酶的比活力（酶的比活力（/g/g） = =酶活力酶活力/ /樣品重樣品重 f =304.2/g =304.2/g 過氧化氫酶活性測(cè)定（高錳酸鉀滴定法）f一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康膄 過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植過氧化氫酶普遍存在于植物的所有組織中，其活性與植物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有一定關(guān)系，故常加以測(cè)物的代謝強(qiáng)度及抗寒、抗病能力有

7、一定關(guān)系，故常加以測(cè)定。定。f二、原理二、原理 f 過氧化氫酶（過氧化氫酶（catalasecatalase）屬于血紅蛋白酶，含有）屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？蓚鬟f電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑?？筛鶕?jù)根據(jù)H2O2H2O2的消耗量或的消耗量或O2O2的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反的生成量測(cè)定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的過氧化氫溶液，經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性

8、條件下）滴定多促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的過氧化氫。即可求出消耗的余的過氧化氫。即可求出消耗的H H2 2O O2 2的量。的量。三、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料：小麥葉片（一）材料：小麥葉片 （二）儀器設(shè)備：（二）儀器設(shè)備：1. 1. 研缽；研缽；2. 2. 三角瓶；三角瓶；3. 3. 酸式滴定管；酸式滴定管；4. 4. 恒溫水恒溫水??；浴；5. 5. 容量瓶。容量瓶。（三）試劑：（三）試劑：1. 10%H2SO41. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.82. 0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液；磷酸緩沖液；3. 0.1mol/L 3. 0

9、.1mol/L 高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液稱：取高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液稱：取KMnO4KMnO4（ARAR）3.1605g3.1605g，用新煮沸冷卻蒸餾水配制成用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml1000ml，再用，再用0.1mol/L 0.1mol/L 草酸溶草酸溶液液標(biāo)定；標(biāo)定；4. 0.1mol/L H2O24. 0.1mol/L H2O2（30%H2O230%H2O2大約等于大約等于17.6mol/L17.6mol/L）?。┤?0%H2O230%H2O2溶液溶液5.68ml5.68ml，稀釋至，稀釋至1000ml1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)，用標(biāo)準(zhǔn)0.1mol/L KMnO40.1mol/L KMnO4溶液溶液

10、（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；（在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定；5. 0.1mol/L 5. 0.1mol/L 草酸：稱取優(yōu)級(jí)純草酸：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4.2H2O 12.607gH2C2O4.2H2O 12.607g，用，用蒸餾水溶解后，定容至蒸餾水溶解后，定容至1000ml1000ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 1. 酶液提?。好敢禾崛。?取小麥葉片取小麥葉片2.5g2.5g加入加入pH7.8pH7.8的磷酸緩沖液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至的磷酸緩沖液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml25ml容量瓶中，將研缽沖洗干凈，沖洗液轉(zhuǎn)容量瓶中，將研缽沖洗干凈，沖洗液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，并用同一緩沖液定容，移至容量瓶中，并

11、用同一緩沖液定容，4000rpm4000rpm離心。離心。（上清液即為過氧化氫酶粗提液上清液即為過氧化氫酶粗提液） 2. 2. 取取50ml50ml三角瓶三角瓶4 4個(gè)個(gè) （兩個(gè)測(cè)定兩個(gè)對(duì)（兩個(gè)測(cè)定兩個(gè)對(duì)照）照） ， 測(cè)定加入酶液測(cè)定加入酶液2.5ml2.5ml， 對(duì)照為煮死對(duì)照為煮死酶液酶液2.5ml2.5ml； 再加入再加入2.5ml 0.1mol/l H2O22.5ml 0.1mol/l H2O2，同時(shí)計(jì)時(shí)間，于同時(shí)計(jì)時(shí)間，于3030恒溫水浴中保溫恒溫水浴中保溫1010分鐘，分鐘，立即加入立即加入1010H2SO4 2.5mlH2SO4 2.5ml。 3. 3. 用用0.1mol/l K

12、MnO40.1mol/l KMnO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2H2O2，至出現(xiàn)粉紅色（在至出現(xiàn)粉紅色（在3030分鐘內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。分鐘內(nèi)不消失）為終點(diǎn)。五、結(jié)果計(jì)算f酶活性用每克鮮重樣品在酶活性用每克鮮重樣品在1010分鐘內(nèi)分解分鐘內(nèi)分解H2O2H2O2的毫克數(shù)表示：的毫克數(shù)表示： 酶活（酶分解的酶活（酶分解的H2O2 mg/gH2O2 mg/g鮮重）鮮重） f式中：式中： -對(duì)照用對(duì)照用KMnO4 mlKMnO4 ml數(shù)數(shù) -酶反酶反應(yīng)后應(yīng)后KMnO4KMnO4滴定滴定mlml數(shù)數(shù)f t-t-酶液總量酶液總量ml ml 1-1-反應(yīng)所反應(yīng)所用酶液量用酶液量ml ml -樣品鮮重樣品

13、鮮重(g)(g)f 1.7-1ml 0.1mol/l KMnO4 1.7-1ml 0.1mol/l KMnO4相當(dāng)于相當(dāng)于1.7mg 1.7mg H2O2H2O2f 注意注意 所用所用KMnO4KMnO4溶液及溶液及H2O2H2O2溶液使用前要經(jīng)過標(biāo)溶液使用前要經(jīng)過標(biāo)定，定，0.1mol/l H2O20.1mol/l H2O2要新配制。要新配制。 脯氨酸含量的測(cè)定f一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?f1.1.了解植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性生理作用，及植物對(duì)脅迫的影了解植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性生理作用，及植物對(duì)脅迫的影響機(jī)制；響機(jī)制； 2. 2.了解脯氨酸對(duì)植物水分脅迫下的抗性生理。了解脯氨酸對(duì)植物水分脅迫下的抗

14、性生理。f二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 f 在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸（氨酸（prolineproline，ProPro）的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含）的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測(cè)定脯氨酸含量可以作為抗旱育種積累較多的脯氨酸。因此測(cè)定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能

15、降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫膠體及組織內(nèi)的代謝過程，因而能降低冰點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。 在在酸性條件下，茚三酮和脯氨酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色化合物，酸性條件下，茚三酮和脯氨酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色化合物，產(chǎn)物在產(chǎn)物在520nm520nm波長(zhǎng)下具有最大吸收峰。用磺基水楊酸提取植波長(zhǎng)下具有最大吸收峰。用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸

16、性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。三、材料、儀器及試劑f1.1.實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：f小麥幼苗：對(duì)照；小麥幼苗：對(duì)照；100mM100mM、200mM NaCl200mM NaCl處理處理48h48h；5%5%、15% PEG-600015% PEG-6000處理處理48h 48h f2.2.儀器：儀器：f天平，燒杯天平，燒杯 ，分光光度計(jì)，研缽，容量瓶，具塞試管，移液管，膠頭，分光光度計(jì)，研缽，容量瓶，具塞試管，移液

17、管，膠頭滴管，水浴鍋滴管，水浴鍋 f3.3.主要試劑：主要試劑：f3%3%磺基水楊酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿棄入下水道，請(qǐng)回收）、磺基水楊酸、冰醋酸、甲苯（使用完勿棄入下水道，請(qǐng)回收）、 f2.5% 2.5% 酸性茚三酮溶液（酸性茚三酮溶液（60 ml60 ml冰醋酸、冰醋酸、16.4 ml16.4 ml磷酸加蒸餾水定容至磷酸加蒸餾水定容至100 100 mlml，再加入，再加入2.5 g2.5 g茚三酮，溶解后避光保存）、茚三酮，溶解后避光保存）、f脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液：精確稱取脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液：精確稱取25 mg25 mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后

18、倒入水溶解，然后倒入500 ml500 ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中脯氨酸濃度脯氨酸濃度50 g /ml50 g /ml。四、實(shí)驗(yàn)步驟 f（一）、樣品的測(cè)定一）、樣品的測(cè)定 f 1. 1. 脯氨酸的提?。簻?zhǔn)確稱取不同處理的待脯氨酸的提?。簻?zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)植物葉片各測(cè)植物葉片各0.2g0.2g（每種處理至少做三個(gè)平行），（每種處理至少做三個(gè)平行），用用3%3%磺基水楊酸研磨提取，分別轉(zhuǎn)移至試管中，磺基水楊酸研磨提取，分別轉(zhuǎn)移至試管中，然后向各試管分別加入然后向各試管分別加入5ml 35ml 3的磺基水楊酸溶液，的磺基水楊酸溶液，在沸水

19、浴中提取在沸水浴中提取10min10min，（提取過程中要經(jīng)常搖，（提取過程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液用動(dòng)），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液用3%3%磺磺基水楊酸定容至基水楊酸定容至5mL5mL，即為脯氨酸的提取液（預(yù)先，即為脯氨酸的提取液（預(yù)先濕潤(rùn)濾紙，盡量全部收集濕潤(rùn)濾紙，盡量全部收集ProPro提取液）。提取液）。 f 2.2.吸取吸取2ml2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入中，加入 2ml2ml冰醋酸及冰醋酸及2ml2ml酸性茚三酮試劑，封口酸性茚三酮試劑，封口以防過分蒸發(fā)，在沸水浴中加熱以防過分蒸發(fā)，在沸水浴中加熱30min30

20、min，溶液即呈，溶液即呈紅色。紅色。f3. 3. 冷卻后加入冷卻后加入4ml4ml甲苯，搖蕩甲苯，搖蕩30s30s，靜置，靜置2h2h。 f4.4.用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上520nm520nm波長(zhǎng)處比色，求得吸光度值（注意甲苯有毒，波長(zhǎng)處比色，求得吸光度值（注意甲苯有毒，盡量防止揮發(fā)；盡量防止揮發(fā)；OD520OD520大小為大小為0.2-0.80.2-0.8之間為佳，之間為佳，若值太高，應(yīng)適當(dāng)用甲苯稀釋）。若值太高，應(yīng)適當(dāng)用甲苯稀釋）。f（二）、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪

21、制（二）、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 f1.1.在分析天平上精確稱取在分析天平上精確稱取25mg25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml250ml容量瓶中，加蒸餾水定容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每mlml含脯氨酸含脯氨酸100g100g。 f2.2.系列脯氨酸濃度的配制取系列脯氨酸濃度的配制取6 6個(gè)個(gè)50ml50ml容量瓶，分別盛入脯容量瓶，分別盛入脯氨酸原液氨酸原液0.50.5，1.01.0，1.51.5，2.02.0，2.52.5及及 3.0ml3.0ml，用蒸餾水，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，

22、各瓶的脯氨酸濃度分別為定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1 1，2 2，3 3，4 4，5 5及及6g/ml6g/ml。 f3.3.取取6 6支試管，分別吸取支試管，分別吸取2ml2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2ml2ml冰醋酸和冰醋酸和2ml2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min30min。 f 4.4.冷卻后各試管準(zhǔn)確加入冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4ml4ml甲苯，振蕩甲苯，振蕩30S30S，靜，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。 f 5 .5 .用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液

23、用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于520nm520nm波波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。長(zhǎng)處進(jìn)行比色。 f6.6.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y Y）依脯氨）依脯氨酸濃度（酸濃度（X X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2ml2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量測(cè)定液中脯氨酸的含量（g/2mlg/2ml）。）。五、結(jié)果計(jì)算 f根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出2ml2ml樣品液中脯氨酸的濃度樣品液中脯氨酸的濃度, ,然后換算然后換算出樣品

24、中脯氨酸的含量（出樣品中脯氨酸的含量（g g脯氨酸脯氨酸/gFW/gFW）。）。f計(jì)算公式如下：計(jì)算公式如下： 脯氨酸含量（脯氨酸含量（g.g-1g.g-1） c c (v(va)a)w w fc c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得脯氨酸含量為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得脯氨酸含量g g、V V為提取液總體積為提取液總體積mlml、a a為測(cè)定液體積為測(cè)定液體積mLmL、W W為樣品質(zhì)量為樣品質(zhì)量g.g.f脯氨酸含量（脯氨酸含量（g/gg/g）（）（c c 5 / 2 5 / 2）/ /樣重（樣重（g g） 丙二醛含量的測(cè)定f 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膄 植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，往往

25、發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（往往發(fā)生膜脂過氧化作用，丙二醛（MDAMDA）是膜脂過）是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，氧化的最終分解產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放出后，與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征；使纖維素分子與蛋白質(zhì)、核酸起反應(yīng)修飾其特征；使纖維素分子間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的合成。間的橋鍵松馳，或抑制蛋白質(zhì)的合成。MDAMDA的積累可的積累可能對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害。能對(duì)膜和細(xì)胞造成一定的傷害。f二、二、 原理原理f 丙二醛（丙二醛（MDAMDA）是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在）是常用的膜脂過氧化指標(biāo)，在f酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（酸性和高溫度條件下，可以與

26、硫代巴比妥酸（TBATBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3,5,5-3,5,5-三甲基惡唑三甲基惡唑2,4-2,4-二酮），其最大吸收波長(zhǎng)在二酮），其最大吸收波長(zhǎng)在532nm532nm。但是測(cè)定。但是測(cè)定植物組織中植物組織中MDAMDA時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要時(shí)受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與的是可溶性糖，糖與TBATBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在波長(zhǎng)在450nm450nm，532nm532nm處也有吸收。植物遭受干旱、處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定

27、植物組織中定植物組織中MDATBAMDATBA反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排反應(yīng)物質(zhì)含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增除可溶性糖的干擾。低濃度的鐵離子能夠顯著增加加TBATBA與蔗糖或與蔗糖或MDAMDA顯色反應(yīng)物在顯色反應(yīng)物在532532、450nm450nm處的處的消光度值，所以在蔗糖、消光度值，所以在蔗糖、MDAMDA與與TBATBA顯色反應(yīng)中需顯色反應(yīng)中需一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量一定量的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為為100100300g/g DW300g/g DW，根據(jù)植物樣品量和提取液，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入的體積，加入Fe3Fe3

28、的終濃度為的終濃度為0.5mol/L0.5mol/L。f A. A. 直線回歸法直線回歸法f MDA MDA與與TBATBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm450nm波長(zhǎng)下的消光度值為波長(zhǎng)下的消光度值為零。不同濃度的蔗糖（零。不同濃度的蔗糖（0 025mmol/L25mmol/L）與）與TBATBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物顯色反應(yīng)產(chǎn)物在在450nm450nm的消光度值與的消光度值與532nm532nm和和600nm600nm處的消光度值之差成處的消光度值之差成正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與正相關(guān)，配制一系列濃度的蔗糖與TBATBA顯色反應(yīng)后，測(cè)定顯色反應(yīng)后，測(cè)定上述三個(gè)波長(zhǎng)的消光度值，求其直線方程，

29、可求算糖分在上述三個(gè)波長(zhǎng)的消光度值，求其直線方程，可求算糖分在532nm532nm處的消光度值。處的消光度值。UV-120UV-120型紫外可見分光光度計(jì)的直型紫外可見分光光度計(jì)的直線方程為：線方程為：fY532Y5320.001980.001980.088D450 0.088D450 B雙組分分光光度計(jì)法f據(jù)朗伯據(jù)朗伯- -比爾定律：比爾定律：D DkCLkCL，當(dāng)液層厚度為，當(dāng)液層厚度為1cm1cm時(shí)，時(shí)，fk=D/Ck=D/C，k k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。當(dāng)某一溶液中有f數(shù)種吸光物質(zhì)時(shí)，某一波長(zhǎng)下的消光度值等于此混合液數(shù)種吸光物質(zhì)時(shí)，某一波長(zhǎng)下的消

30、光度值等于此混合液f在該波長(zhǎng)下各顯色物質(zhì)的消光度之和。在該波長(zhǎng)下各顯色物質(zhì)的消光度之和。f 已知蔗糖與已知蔗糖與TBATBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm450nm和和532nm532nm波波f長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)分別為長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)分別為85.4085.40，7.407.40。MDAMDA在在f450nm450nm波長(zhǎng)下無(wú)吸收，故該波長(zhǎng)的比吸收系數(shù)為波長(zhǎng)下無(wú)吸收，故該波長(zhǎng)的比吸收系數(shù)為0 0，f532nm532nm波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)為波長(zhǎng)下的比吸收系數(shù)為155155，根據(jù)雙組分分光度，根據(jù)雙組分分光度f(wàn)計(jì)法建立方程組，求解方程得計(jì)算公式：計(jì)法建立方程組，求解方程得計(jì)算公式：fC1(mm

31、ol/L)=11.71D450 C1(mmol/L)=11.71D450 fC2(mol/L)=6.45(D532C2(mol/L)=6.45(D532D600)D600)0.56D450 0.56D450 式中式中 C1 C1為可溶性糖的濃度；為可溶性糖的濃度；C2C2為為MDAMDA的濃度；的濃度；D450D450、D532D532、D600D600分別代表分別代表450nm450nm、532nm532nm和和600nm600nm波長(zhǎng)下的波長(zhǎng)下的消光度值。消光度值。f三、儀器設(shè)備三、儀器設(shè)備f紫外可見分光光度計(jì)紫外可見分光光度計(jì)1 1臺(tái)；離心機(jī)臺(tái)；離心機(jī)1 1臺(tái)；電子天平臺(tái)；電子天平1 1臺(tái)；臺(tái)；10ml10ml離心管離心管4 4f支；研缽兩套；試管支；研缽兩套；試管4 4支；刻度吸管：支；刻度吸管：10ml 110ml 1支，支，2ml 12ml 1支；支；剪刀剪刀1 1把。把。f 【試劑】【試劑】f10%10%三氯乙酸（三氯乙酸（TCATCA）；）；