1、 長(zhǎng) 沙 醫(yī) 學(xué) 院 教 案課程名稱生物信息學(xué)授課題目（章節(jié)或主題）第11章 生物芯片授課教師唐亮所屬系（部）基礎(chǔ)系所屬教研室生技教研室職稱助教授課時(shí)間 年 月 日第 周星期 第 節(jié)第 次課授課時(shí)數(shù)2學(xué)時(shí)授課班級(jí) 生物技術(shù)專業(yè)（本科 ?？疲?2010 級(jí) 1 班教學(xué)課型 理論課 實(shí)驗(yàn)課 見習(xí)課 習(xí)題課 討論課 其它教材名稱、作者、出版社及出版時(shí)間生物信息學(xué)概論，羅靜初等譯，北京大學(xué)出版社教學(xué)目的要求：對(duì)生物芯片作了簡(jiǎn)要介紹，從生物芯片的分類、基本原理幾個(gè)角度學(xué)習(xí)生物芯片有關(guān)的基本知識(shí)重點(diǎn)與難點(diǎn)：重點(diǎn)：芯片基本原理難點(diǎn)：芯片操作技術(shù) 教學(xué)方法（請(qǐng)打選擇）：講授法 討論法 啟發(fā)式 自學(xué)輔導(dǎo)法 練習(xí)

2、法(習(xí)題或操作) 讀書指導(dǎo)法 （以問題為中心的教學(xué)法） 其他教學(xué)手段（請(qǐng)打選擇）：板書 實(shí)物 標(biāo)本 掛圖 模型 投影 幻燈 錄像 CAI（計(jì)算機(jī)輔助教學(xué)）教學(xué)過程設(shè)計(jì)和教學(xué)內(nèi)容：生物芯片(Biochip) 又稱微陣列(microarray)。這一名詞是20世紀(jì)80年代初提出來的，把有機(jī)功能分子或生物活性分子進(jìn)行組裝，構(gòu)建微功能單元，實(shí)現(xiàn)信息的獲取、儲(chǔ)存、處理和傳輸功能。真正的生物芯片出現(xiàn)于20世紀(jì)90年代，DNA微陣列技術(shù)自1995年誕生之時(shí)，就被預(yù)言為具有劃時(shí)代意義的技術(shù)，將從根本上改變生物科技的面貌。生物芯片將生命科學(xué)研究中所涉及的不連續(xù)的分析過程（如樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析測(cè)試），利用微

3、電子、微機(jī)械、化學(xué)、物理技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，使之集成化、微型化。生物芯片主要是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等技術(shù)，將大量生物分子如核酸片斷、多肽片斷、組織切片、細(xì)胞等有序地固定于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺、尼龍膜等）的表面，組成密集、有序的二維分子陣列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝像機(jī)（CCD）對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效的檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。微陣列的主要應(yīng)用在于對(duì)基因表達(dá)問題的研究，特別是從全基因組水平定量或定性檢測(cè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA。通過對(duì)該數(shù)據(jù)矩陣的分析，可以回答一系

4、列的生物學(xué)問題：基因的功能是什么？在不同條件或不同細(xì)胞類型中，哪些基因的表達(dá)存在差異？在特定條件下，哪些基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，這些基因受到哪些基因的調(diào)節(jié)，或控制哪些基因的表達(dá)？微陣列廣泛應(yīng)用的另一個(gè)重要原因是為了理解基因網(wǎng)絡(luò)（network）或通路（pathway）。微陣列可以在單一芯片上同時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)基因組的變化，因而可以同時(shí)理解成千上萬個(gè)基因之間的相互作用，對(duì)整個(gè)表達(dá)譜有一全面理解。生物芯片會(huì)對(duì)21世紀(jì)的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響，可以大大促進(jìn)后基因組計(jì)劃的各項(xiàng)研究。通過比較不同個(gè)體或物種之間以及同一個(gè)體在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，正常和疾病狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄及其表達(dá)的差異，尋找和發(fā)現(xiàn)新基因

5、，研究它們?cè)谏矬w發(fā)育、遺傳、進(jìn)化等過程中的功能。生物芯片還將在研究人類重大疾病如癌癥、心血管病等相關(guān)基因及其相互作用機(jī)理方面發(fā)揮重要作用。在預(yù)防醫(yī)學(xué)方面，生物芯片可以使人們盡早認(rèn)識(shí)自身潛在的疾病，并實(shí)施有效的防治生物芯片的分類1、根據(jù)支持介質(zhì)劃分2、根據(jù)制備方法劃分3、根據(jù)芯片上固定的探針劃分幾種常見的生物芯片1、基因芯片基因芯片稱DNA芯片（DNA Chip）或DNA微陣列（DNA microarray）?；蛐酒@一技術(shù)方法是1991年首次提出的，該技術(shù)將成千上萬的探針同時(shí)固定于支持物上，所以一次可以對(duì)大量的DNA分子或RNA分子進(jìn)行檢測(cè)分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交等技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化

6、程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、低通量等不足。而且，通過設(shè)計(jì)不同的探針陣列（array），還可以用于序列分析，稱為雜交測(cè)序（SBH）。基因芯片以其無可比擬的信息量、高通量、快速、準(zhǔn)確的分析基因的能力，在基因功能研究、基因診斷及藥物篩選等方面顯示了巨大的威力，被稱為是基因功能研究領(lǐng)域的最偉大發(fā)明之一?；蛐酒云涓咄?、并行檢測(cè)等特點(diǎn)適應(yīng)了分析人類基因組計(jì)劃對(duì)海量生物信息提取、分析的需要。深入研究基因突變和基因表達(dá)的有效方法的需求是基因芯片發(fā)展的動(dòng)力。由于基因芯片高速度、高通量、集約化和低成本的特點(diǎn)，誕生以后就受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注。2、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片，又稱蛋白質(zhì)微陣列（protein micr

7、oarray）是指固定于支持介質(zhì)上的蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列，是在一個(gè)基因芯片大小的載體上，按使用目的的不同，點(diǎn)布相同或不同種類的蛋白質(zhì)，然后再用標(biāo)記了熒光染料的蛋白質(zhì)結(jié)合，掃描儀上讀出熒光強(qiáng)弱，計(jì)算機(jī)分析出樣本結(jié)果。從理論上講，蛋白質(zhì)芯片可以對(duì)各種蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，彌補(bǔ)基因芯片檢測(cè)的不足，不僅適合于抗原、抗體的篩選，同樣也可用于受體配體的相互作用的研究，具有一次性檢測(cè)樣本巨大、相對(duì)低消耗、計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析結(jié)果以及快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。許多功能蛋白質(zhì)還有翻譯后修飾和加工，如磷酸化、羰基化、乙?；?、蛋白質(zhì)水解等修飾，直接進(jìn)行蛋白質(zhì)分析是蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。3、組織芯片組織芯片是將多種組織切片代替核酸或

8、蛋白質(zhì)，按照一定順序固定在玻片上。其優(yōu)點(diǎn)在于可以原位檢測(cè)信號(hào)發(fā)生的位置，缺點(diǎn)是切片較大，因而不能在一張片子上大規(guī)模固定多個(gè)樣品。同時(shí)，由于組織切片的樣品來源很不穩(wěn)定，每張玻片之間都不相同，重復(fù)性和穩(wěn)定性一直是一主要問題。不過，將芯片概念引入免疫組化和原位雜交中確實(shí)是一概念和技術(shù)上的突破?；蛐酒幕驹砘蛐酒驹砗突玖鞒袒蛐酒幕驹戆▋煞N模式：一是將靶DNA固定于支持物上，適合于同一探針對(duì)不同靶DNA的分析；二是將大量探針分子固定于支持物上，適合于對(duì)同一靶DNA進(jìn)行不同探針序列的分析?；蛐酒幕玖鞒袒蛐酒夹g(shù)包括四個(gè)主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應(yīng)、信號(hào)檢測(cè)和結(jié)果

9、分析。首先提出基因芯片所要解決的問題，確定研究目標(biāo)，例如，研究基因的SNP。檢測(cè)或分析DNA的變異或者進(jìn)行基因差異表達(dá)的研究。根據(jù)所要解決的問題，選擇一組特定的基因?qū)ο?。其次，根?jù)所選擇的基因序列，設(shè)計(jì)探針序列以及探針在芯片上的分布。然后根據(jù)設(shè)計(jì)結(jié)果制備基因芯片，制備方法大致分為在片合成法和點(diǎn)樣法。接下來就是對(duì)靶基因即待測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記，然后進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，并對(duì)基因芯片的雜交結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，最后根據(jù)獲得的熒光圖譜，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，報(bào)告檢測(cè)結(jié)果，并將相應(yīng)的數(shù)據(jù)存入數(shù)據(jù)庫。生物芯片的應(yīng)用生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，它是集微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算

10、機(jī)科學(xué)為一體高度交叉的高薪技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。由于使用該技術(shù)可以將大量的探針同時(shí)固定于支持物上，所以可以對(duì)大量生物分子進(jìn)行檢測(cè)分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、低通量等不足。使用該技術(shù)有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如測(cè)序、基因表達(dá)譜測(cè)定、基因診斷、藥物篩選等。為后基因組計(jì)劃時(shí)代基因功能的研究及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的工具，將會(huì)使新基因的發(fā)現(xiàn)、基因診斷、藥物篩選、給藥個(gè)性化等方面取得重大突破，為人類社會(huì)帶來巨大變革。測(cè)序采用生物芯片測(cè)序方法有芯片毛細(xì)血管電泳測(cè)序和寡核苷酸微陣列雜交測(cè)序兩種。1999年，加利福

11、尼亞大學(xué)伯克利分校Mathies小組首先報(bào)道芯片毛細(xì)血管電泳測(cè)序結(jié)果。他們?cè)?0分鐘內(nèi)完成了對(duì)433個(gè)堿基對(duì)序列的測(cè)定工作。用芯片測(cè)序的另一種方法是寡核苷酸微陣列測(cè)序法，又稱雜交測(cè)序法（Sequencing by hybridization，SBH）。所謂SBH，就是利用固定探針與樣品進(jìn)行分子雜交產(chǎn)生的雜交圖譜從而排列出待測(cè)DNA的序列順序。SBH的原理可以通過下面的例子來說明，設(shè)有DNA片段AGCCTAGCTGAA，探針為所有的8核苷酸（48=65536種）。將待測(cè)DNA和探針按一定比例在適宜溫度下混合雜交，完全匹配的序列有5種，TCGGATCG，CGGATCGA，GGATCGAC，GATC

12、GACT和ATCGACTT。這些探針只相差一個(gè)核苷酸，由它們可得到待測(cè)DNA的互補(bǔ)序列為TCGGATCGACTT，待測(cè)DNA序列為AGCCTAGCTGAA。最初SBH法是在液相中進(jìn)行的，因此雜交信號(hào)的讀取非常困難，而且限制了序列分析的速度。采用DNA探針陣列方法有較大優(yōu)越性。把一組寡核苷酸探針有序地排列在硅、玻璃等基片表面，組成一二維陣列。在這一陣列中，每一探針都有確定的坐標(biāo)位置，只要確定了位置就確定了探針，探針與待測(cè)DNA雜交，沖洗去非特異性DNA，檢測(cè)在哪些位點(diǎn)上有雜交信號(hào)。再通過一定的計(jì)算就可以得到待測(cè)DNA的序列。Mark Chee等用含135000個(gè)寡核苷酸探針的高密度微陣列分析了黑

13、猩猩和人BRCA1基因序列差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子11約3.4kb長(zhǎng)度范圍內(nèi)的核酸序列同源性在98.2%到83.5%之間，揭示了二者有高度相似性。目前SBH還存在若干問題，有待進(jìn)一步改進(jìn)。比如，由于眾多寡核苷酸組成各不相同，很難找到最佳雜交條件。錯(cuò)配問題，特別是G-T和G-A，難于檢測(cè)。SBH不適合于重復(fù)序列和簡(jiǎn)單序列單元DNA的測(cè)序等?；虮磉_(dá)分析由于DNA芯片技術(shù)可直接檢測(cè)mRNA的種類及豐度，因而成為研究基因表達(dá)的有力工具。檢測(cè)基因差異表達(dá)的操作流程見圖8-1。cDNA微陣列是在1995年由斯坦福大學(xué)率先研制成功并應(yīng)用于基因表達(dá)分析的。首先將細(xì)胞內(nèi)的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并分離，然后將分

14、離得到的所有或部分cDNA（其長(zhǎng)度通常大于200bp)作為探針，用機(jī)器手按照陣列的形式點(diǎn)到玻璃片上。玻璃片上的每一個(gè)點(diǎn)只包含一種cDNA分子，這樣就制成了cDNA微陣列。一般，探針的序列是已知的。在使用cDNA微陣列時(shí)，首先提取組織或細(xì)胞系中的mRNA樣本，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并用熒光素標(biāo)記；然后把標(biāo)記混合物加到cDNA微陣列上，與探針雜交，雜交過程完成后，清洗微陣列；最后用激光掃描儀掃描并獲取熒光圖像，對(duì)圖像進(jìn)行分析，得到cDNA芯片上每一個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值。熒光強(qiáng)度值定量地反映了樣本中存在的與探針互補(bǔ)的mRNA豐度，也就是反映了探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)基因的表達(dá)水平?；蛟\斷基因芯片目前最主要的應(yīng)用之一就是疾

15、病診斷。從正常人的細(xì)胞中分離出mRNA后與DNA芯片雜交就可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的細(xì)胞中分離出mRNA后與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過分析比較這兩種圖譜，就可以得出病變的mRNA表達(dá)的信息，即DNA突變發(fā)生在何部位，屬于什么樣的序列突變。藥物篩選如何分離和鑒定藥的有效成分是目前中藥產(chǎn)業(yè)和傳統(tǒng)的西藥開發(fā)遇到的重大問題，基因芯片是解決這一問題的有效手段，它能夠大規(guī)模地篩選、通用性強(qiáng)，能夠從基因水平解釋藥物的作用機(jī)理，即可以利用基因芯片分析用藥前后機(jī)體的不同組織、器官基因表達(dá)的差異。如果再以cDNA表達(dá)文庫得到的肽庫來制作肽芯片，則可以從眾多的藥物成分中篩選到起作用的部分物質(zhì)。利用RNA

16、、單鏈DNA有很大的柔性，能形成復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，更有利于與靶分子相結(jié)合的特點(diǎn)，可將核酸庫中的RNA或單鏈DNA固定在芯片上，然后與靶蛋白結(jié)合，形成蛋白質(zhì)-RNA或蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，可以篩選特異的藥物蛋白或核酸，因此，芯片技術(shù)和RNA庫的結(jié)合在藥物篩選中有廣泛應(yīng)用。數(shù)據(jù)處理和分析數(shù)據(jù)處理丟失數(shù)據(jù)和極端值的處理丟失數(shù)據(jù)（missing data）和極端值（outlier）是微陣列實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)質(zhì)量控制（quality control )的兩個(gè)基本問題。數(shù)據(jù)丟失的原因很多，包括分辨率不夠、圖像失敗或只是由于芯片上的灰塵或劃痕所引起。數(shù)據(jù)丟失還可能由于自動(dòng)化方法中的系統(tǒng)誤差產(chǎn)生。cDNA微陣列中數(shù)據(jù)丟

17、失的含義是由于空點(diǎn)（empty spot），其熒光強(qiáng)度為零，或者由于其背景強(qiáng)度高于樣品點(diǎn)。最簡(jiǎn)單的數(shù)據(jù)替換方法是根據(jù)同一芯片上其他點(diǎn)的情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析而得到一個(gè)預(yù)計(jì)值。對(duì)于雙色cDNA微陣列，如果某個(gè)基因有重復(fù)點(diǎn)，這些點(diǎn)的平均值可用來代替丟失數(shù)據(jù)。如果沒有重復(fù)點(diǎn)，可用統(tǒng)計(jì)方法預(yù)測(cè)丟失數(shù)據(jù)（如EM算）。一種簡(jiǎn)易方法是計(jì)算該樣品點(diǎn)用不同染料標(biāo)記時(shí)在整個(gè)芯片強(qiáng)度的分布位置，并以此為參照，推算出相應(yīng)位置上的丟失值而加以替換。極端數(shù)據(jù)是指那些偏離群體的數(shù)據(jù)。微陣列實(shí)驗(yàn)中，極端值的出現(xiàn)和消除可在不同水平。極端值可在一塊芯片上出現(xiàn)，但重復(fù)片子上不出現(xiàn)；也可以是同一片子上某個(gè)基因的重復(fù)點(diǎn)，而不管這些重復(fù)點(diǎn)鄰近

18、與否；還可以是同一片子上任意點(diǎn)所產(chǎn)生的偏離近與否；還可以是同一片子上任意點(diǎn)所產(chǎn)生的偏離?，F(xiàn)有微陣列技術(shù)中，多種因素可導(dǎo)致不同芯片間的變異性。已有不同方法減少這些芯片間的變異和系統(tǒng)誤差（如下文將要敘述的正態(tài)化）。同一類型的芯片中，那些變異性大的片子應(yīng)當(dāng)去除，這種片子又稱極端片子（outlier slide）。片間變異可能由于點(diǎn)樣濃度和體積、加到芯片上的標(biāo)記靶分子數(shù)目、雜交條件和其他因素等所引起。最簡(jiǎn)單的去除極端片子的方法是靠視覺觀察圖像。一種簡(jiǎn)單而有效的消除方法是通過提高實(shí)驗(yàn)自動(dòng)化程度而消除。另一種去除極端片子的方法是如前面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中討論的那樣，進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，并用統(tǒng)計(jì)方法評(píng)估片間變異。重復(fù)片子上對(duì)