1、RNA Interference (RNAi) RNA干擾（干擾（RNA interference, RNAi）是指將外源雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后引起與其序列同源的特異基因mRNA降解導(dǎo)致基因表達(dá)抑制的現(xiàn)象，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)的一種形式。 它是真核生物中存在的一種抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制，具有重大生物學(xué)意義 。定義：RNAi的發(fā)現(xiàn) 1995年，Guo S等試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C. elegans）中的par-1基因的表達(dá)。 設(shè)計(jì)： 反義RNA特異性阻斷par-1基因的表達(dá)； 正義RN

2、A以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)。 結(jié)果： 二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋不相符合。RNAi的提出 1998年2月，F(xiàn)ire A 和Mello C將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱；而經(jīng)過(guò)純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。 他們證實(shí)，Guo S博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。 該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾（RNA interference, 簡(jiǎn)稱RNAi）RNAi廣泛存在于自然界 隨后，RNAi現(xiàn)象被廣泛地發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、

3、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物鐘。 這種存在揭示了RNAi很可能是出現(xiàn)于生命進(jìn)化的早期階段。 隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具，RNAi也越來(lái)越為人們所重視。RNAi作用機(jī)制作用機(jī)制 RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，不同來(lái)源的dsRNA通過(guò)各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入植物或線蟲細(xì)胞內(nèi)，與 Dicer酶 (dsRNA-specific endonucleaes, Dicer ) 的 C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合產(chǎn)生 21-23nt siRNAs 片斷( small inte

4、rfering RNA, 即siRNA ) 。每個(gè)片斷的3端都有 2nt 核苷酸突出。 在效應(yīng)階段， Dicer酶通過(guò) PAZ結(jié)構(gòu)域與含有 PAZ結(jié)構(gòu)域的 Argonaute蛋白互相作用， 核酸內(nèi)外切酶、解旋酶與 Argonaute蛋白相連進(jìn)而與siRNA一起形成具有多個(gè)亞單元的核糖核苷酸蛋白復(fù)合物 ( RNA-inducing silencing complex, RISC ) 。 RISC中的解旋酶應(yīng)用 ATP解開 siRNA雙鏈 ，使其反義鏈互補(bǔ)結(jié)合到靶向mRNA上與之相匹配的特異性序列， RISC中的核酸酶降mRNA ， 降解的 mRNA隨后迅速地被細(xì)胞其他的RNA酶所降解。從而使 目

5、的基因沉默，產(chǎn)生 R N A i 現(xiàn)象。 如何進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)？ RNAi的設(shè)計(jì) RNAi目標(biāo)序列的選取原則、陰性對(duì)照 siRNA的制備化學(xué)合成 、體外轉(zhuǎn)錄、RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA、體內(nèi)表達(dá) 、siRNA表達(dá)載體、siRNA表達(dá)框架 RNAi轉(zhuǎn)染磷酸鈣共沉淀、電穿孔法 、機(jī)械法 、DEAE-葡聚糖和polybrene 、陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑RNAi目標(biāo)序列的選取原則目標(biāo)序列的選取原則(1)從轉(zhuǎn)錄（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。 (2)將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較

6、，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。 (3)選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 陰性對(duì)照陰性對(duì)照 一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性。siRNA的制備方法及特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用不適用化學(xué)合成方便質(zhì)量高價(jià)格高定制周期長(zhǎng) 已找到最有效的siR-NA的情況下，需大量siRNA進(jìn)行研究篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素 體外

7、轉(zhuǎn)錄 性價(jià)比高、快規(guī)模受到限制 篩選siRNAs，特別是制備多siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí) 實(shí)驗(yàn)需大量且特定的siRNA長(zhǎng)期研究 用RNasc消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA跳過(guò)檢測(cè)和篩選siRNA序列的步驟，節(jié)省時(shí)間和金錢可能引發(fā)非特異的基因沉默的表型 快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型 需長(zhǎng)時(shí)間研究或需一個(gè)特定的iRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療 siRNA表達(dá)載體 唯一可進(jìn)行長(zhǎng)期研究的方法 耗時(shí)長(zhǎng)，工作繁瑣 可用于長(zhǎng)期研究 篩選siRNA序列 siRNA表達(dá)框架 直接由PCR得到，速度快，操作簡(jiǎn)便 PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中 篩選siRNA序列，在克隆到載體前啼選最佳啟動(dòng)子 長(zhǎng)期抑制研究

8、 比較項(xiàng)目化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄RNase III降解dsRNAsiRNA表達(dá)載體PCR表達(dá)框材料需求材料需求 21-mer RNAoligos(一對(duì)一對(duì))29-mer DNA oligos(一對(duì)一對(duì))轉(zhuǎn)錄模版轉(zhuǎn)錄模版 (200-1000bp，兩側(cè)帶，兩側(cè)帶T7 啟動(dòng)子啟動(dòng)子)55-60-mer DNA oligos(一對(duì)一對(duì)) 50-mer DNA oligos(一對(duì)一對(duì))全部制備全部制備/合成時(shí)間所需合成時(shí)間所需時(shí)間時(shí)間4天天2周周24 小時(shí)小時(shí) + DNA oligo合合成時(shí)間成時(shí)間1 天天 + 轉(zhuǎn)錄模版制轉(zhuǎn)錄模版制備時(shí)間備時(shí)間5天以上天以上 + DNA oligo合成時(shí)間合成時(shí)間 6 小時(shí)小

9、時(shí) + DNA oligo合成時(shí)間合成時(shí)間個(gè)人所需操作時(shí)間個(gè)人所需操作時(shí)間幾乎不需要幾乎不需要*中等中等中等中等多多中等中等是否需要驗(yàn)證和尋找最是否需要驗(yàn)證和尋找最有效有效siRNA需要需要需要需要不需要不需要需要需要需要需要能否標(biāo)記能否標(biāo)記siRNA (例如例如用于熒光顯微鏡分析用于熒光顯微鏡分析siRNA進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程或進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程或者在細(xì)胞中的定位）者在細(xì)胞中的定位）能能能能能能不能不能不能不能轉(zhuǎn)染的相對(duì)難易程度轉(zhuǎn)染的相對(duì)難易程度好好好好好好差差差差可篩選性可篩選性 (例如抗生素例如抗生素篩選篩選) 不可以不可以不可以不可以不可以不可以可以可以不可以不可以能否用于長(zhǎng)效抑制能否用于長(zhǎng)效抑制不

10、可以不可以不可以不可以不可以不可以可以（抗生素篩可以（抗生素篩選）選）不可以不可以能否大規(guī)模制備能否大規(guī)模制備可以可以有限有限有限有限可以可以有限有限檢測(cè)總體轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)總體轉(zhuǎn)染效率不可以不可以不可以不可以不可以不可以可以可以不可以不可以每個(gè)基因的相對(duì)費(fèi)用每個(gè)基因的相對(duì)費(fèi)用高高中等中等低低中等中等中等中等*取決于合成后是否包含純化、去保護(hù)，以及廠家提供的是已經(jīng)退火的即用型雙鏈還是凍干的單鏈取決于合成后是否包含純化、去保護(hù)，以及廠家提供的是已經(jīng)退火的即用型雙鏈還是凍干的單鏈RNAi轉(zhuǎn)染將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下五種： 磷酸鈣共沉淀磷酸鈣共沉

11、淀將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗x最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì)導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。電穿孔法電穿孔法電穿孔通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過(guò)程都伴

12、隨高水平（50%或更高）的毒性。 DEAE-葡聚糖和葡聚糖和polybrene帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。機(jī)械法機(jī)械法轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑在優(yōu)化條件下將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水

13、中時(shí)，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒(méi)有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞。現(xiàn)存對(duì)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來(lái)源于內(nèi)吞體和溶酶體。RNAi的應(yīng)用前景的應(yīng)用前景 研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中滅活或降低特異性基

14、因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以隨意控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。線蟲和果蠅的全部基因組序列已測(cè)試完畢，發(fā)現(xiàn)大量未知功能的新基因，RNAi將大大促進(jìn)對(duì)這些新基因功能的研究。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來(lái)RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。 研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑 聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系，Clemensy等應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑,取得

15、了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果,在此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系, 證實(shí)了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)， 因此認(rèn)為RNAi技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑。 開展基因治療的新策略開展基因治療的新策略 RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)，防止自私基因序列過(guò)量增殖等作用，因此可以利用RNAi現(xiàn)象產(chǎn)生抗病毒的植物和動(dòng)物，并可利用不同病毒轉(zhuǎn)錄序列中高度同源區(qū)段相應(yīng)的dsRNA抵抗多種病毒。 腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可