1、1化學(xué)毒物的致突變作用2教學(xué)內(nèi)容 基本概念和突變類型 致突變的機(jī)理 突變的后果 致突變性評價方法3教學(xué)目的 了解遺傳學(xué)基礎(chǔ)，致突變實(shí)驗(yàn)中存在問題； 熟悉DNA損傷的修復(fù)，機(jī)體對致突變作用影響； 掌握致突變類型、機(jī)制和后果，常用致突變實(shí)驗(yàn)的原理教學(xué)重點(diǎn)及難點(diǎn) 致突變作用的概念 致突變作用的類型 致突變作用的機(jī)制 致突變作用的后果 Ames試驗(yàn)41 概述（基本概念）1、DNA5678 2、基因93、染色質(zhì)和染色體1011124、細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂細(xì)胞從DNA復(fù)制起，經(jīng)過分裂直到把DNA均等地分配到兩個新的子細(xì)胞的全過程。13細(xì)胞周期G1期S期G2期M期1415165、體細(xì)胞與生殖細(xì)胞體細(xì)胞u多是二

2、倍體u損傷不會遺傳給子代生殖細(xì)胞u單倍體u突變可傳給子代176、遺傳與變異18 自發(fā)變異 DNA的復(fù)制錯誤 自發(fā)的化學(xué)變化誘發(fā)變異 射線 化學(xué)誘變劑197、致突變作用 外源化學(xué)物及其它環(huán)境因素能引起細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，這種改變隨同細(xì)胞分裂過程而傳遞的過程稱為致突變作用202 致突變作用的類型21突變基因突變(點(diǎn)突變)染色體畸變?nèi)旧w數(shù)目異常堿基置換移碼突變大段損傷倒位易位缺失重復(fù)轉(zhuǎn)換顛換插入丟失22堿基置換堿基置換2324移碼25大段損傷 大片段損傷是指DNA鏈大段缺失或插入。這種損傷有時可跨越兩個或數(shù)個基因，但所缺失的片段仍遠(yuǎn)小于光鏡下所能觀察到的染色體變化，故又可稱為小缺失。 26

3、倒位（逆位）：染色體在某一片段的位置顛倒了180 27易位（轉(zhuǎn)座）：染色體的某一片段移接到另一非同源染色體上28缺失：染色體中某一片段的缺失 29重復(fù)：染色體中增加了某一片段 30卵圓眼超棒眼棒狀眼X染色體某一區(qū)段的重復(fù)，會導(dǎo)致果蠅由正常的卵圓眼變?yōu)榘魻钛鄣淖儺?，或眼睛更窄小的“超棒眼”?31染色體數(shù)目異常323 致突變的機(jī)理一、DNA的損傷 以DNA為靶的直接誘變 不以DNA為靶的間接誘變 二、DNA損傷的修復(fù) 光復(fù)活 切除修復(fù) 重組修復(fù) SOS修復(fù)33（一）以（一）以DNA為靶的直接誘變?yōu)榘械闹苯诱T變（1）烷化劑的影響l 烷化劑所致的堿基損傷可表現(xiàn)為錯配。 烷化劑提供烷基與DNA共價化合

4、； 烷化堿基引起DNA二級結(jié)構(gòu)改變。34（一）以（一）以DNA為靶的直接誘變?yōu)榘械闹苯诱T變（2）平面大分子嵌入DNA鏈 有些大分子能以靜電吸附形式嵌入DNA單鏈的堿基之間或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的相鄰多核苷酸鏈之間，稱為嵌入劑嵌入劑(intercalating agent)。 它們多數(shù)是多環(huán)的平面結(jié)構(gòu)， 易于嵌入DNA單鏈的堿基之間或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的相鄰多核苷酸鏈之間，造成移碼突變移碼突變。 35（一）以（一）以DNA為靶的直接誘變?yōu)榘械闹苯诱T變（3）堿基類似物的堿基類似物的（base analogue）取代取代取代后的堿基類似物出現(xiàn)異構(gòu)互變,發(fā)生錯誤配對而造成堿基置換。例如：5-溴脫氧尿嘧啶（5

5、-BU）取代T，2- 氨基嘌呤（2-AP）取代G。3637胸腺嘧啶38（一）以DNA為靶的直接誘變（4）改變或破壞堿基化學(xué)結(jié)構(gòu) 有些化學(xué)物可對堿基產(chǎn)生氧化作用，從而破壞堿基的結(jié)構(gòu)，有時還可引起鏈斷裂。還有些物質(zhì)可在體內(nèi)形成有機(jī)氧化物或自由基，可間接使嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)破壞，容易出現(xiàn)DNA鏈斷裂。 39次黃嘌呤4041（一）以（一）以DNA為靶的直接誘變?yōu)榘械闹苯诱T變（5）二聚體的形成42（一）以（一）以DNA為靶的直接誘變?yōu)榘械闹苯诱T變（6）DNA加合物和交聯(lián)分子的形成l 親電子劑極易與蛋白質(zhì)或核酸等大分子物質(zhì)中親核基團(tuán)（如SH、OH、N=等）發(fā)生共價結(jié)合，形成加合物或交聯(lián)分子。如苯并芘代謝產(chǎn)物與

6、DNA形成的加合物分子巨大，使DNA構(gòu)象改變，誘發(fā)突變。l 亞硝酸、絲裂霉素C等使形成DNADNA交聯(lián)使復(fù)制時不能解鏈，DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄完全停止，細(xì)胞死亡。l 烷化劑、苯并芘、砷化物、醛類化合物、一些重金屬等與DNA的核蛋白交聯(lián)形成DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)物對DNA構(gòu)象與功能造成嚴(yán)重影響。l DNA加合物的形成可活化癌基因，影響調(diào)節(jié)基因和抑癌基因的表達(dá)。43（二）不以DNA為靶的間接誘變主要涉及細(xì)胞分裂過程的改變?nèi)缂忓N體、微管蛋白的合成與聚合，微管結(jié)合蛋白的合成與功能發(fā)揮，細(xì)胞分裂紡錘纖維的功能發(fā)揮等。44（1）與微管蛋白二聚體結(jié)合（2）與微管上的巰基結(jié)合（3）破壞已組裝的微管（4）妨礙中心粒移動（5

7、）其它1、紡錘體抑制452、對DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶系統(tǒng)作用 對DNA合成和復(fù)制有關(guān)的酶系統(tǒng)作用也可間接影響遺傳物質(zhì)。 例如，一些氨基酸類似物可使與DNA合成有關(guān)的酶系統(tǒng)遭受破壞而誘發(fā)突變；鈹和錳除可直接作用于DNA外，還可與酶促防錯修復(fù)系統(tǒng)相作用而誘發(fā)突變。 修復(fù)過程中的酶46復(fù)制47切除修復(fù)484 突變的后果 體細(xì)胞突變 僅影響接觸致突變物的個體，不影響下一代。 腫瘤、畸形、動脈粥樣硬化、糖尿病及衰老等。 生殖細(xì)胞突變 可影響下一代，甚至人類的基因。 基因突變對人類的影響程度分為五類。49對機(jī)體無影響，如同義突變；導(dǎo)致對健康無影響的正常人體生化組成的遺傳學(xué)變異；導(dǎo)致遺傳易感性的改變；導(dǎo)致

8、遺傳性疾??；致死性突變，造成配子死亡、死胎及自發(fā)流產(chǎn)等。先天性疾病都是遺傳性疾病嗎？505 化學(xué)毒物致突變作用的研究方法51 基因突變和染色體畸變的檢測可直接反映化學(xué)毒物的致突變性，是評價化學(xué)毒物致突變性唯一可靠的方法。還有許多試驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象并不反映基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，而僅反映致突變過程中發(fā)生的其他事件。因此將試驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件稱為遺傳學(xué)終點(diǎn)。 遺傳學(xué)終點(diǎn)分為：基因突變、染色體畸變、DNA損傷等其他遺傳損傷的檢測52一、主要致突變實(shí)驗(yàn)基因突變微生物哺乳動物細(xì)胞果蠅哺乳動物植物分析53染色體畸變哺乳動物細(xì)胞果蠅哺乳動物真菌植物541、細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn) 美國加州

9、大學(xué)的Ames教授在1979年建立并完善，又稱Ames試驗(yàn)（鼠傷寒沙門菌/組氨酸回復(fù)突變試驗(yàn)）。55（1）什么是細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)？以營養(yǎng)缺陷型的突變體菌株為指示生物檢測基因突變的體外試驗(yàn)。常用的菌株有組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌和色氨酸營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌。56（2）鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗(yàn)原理利用若干不同基因型組氨酸缺陷型菌株，每個菌株具有其獨(dú)特的回復(fù)突變“靶點(diǎn)”順序，可以由不同類型的堿基置換和移碼誘變劑誘發(fā)回復(fù)突變。該菌株在無外源性組氨酸供給的情況下不能生長繁殖，但當(dāng)發(fā)生回復(fù)突變時則可在無外源性組氨酸供給的情況下生長繁殖，計數(shù)誘發(fā)的恢復(fù)菌落數(shù)即可判斷化學(xué)毒物的致突變性。57代謝活化系統(tǒng)

10、一般是S9混合液。S9即將一組雄性大鼠進(jìn)行腹腔注射芳香族化合物如多氯聯(lián)苯油溶液等誘導(dǎo)大鼠肝臟酶系的活性，4d后殺鼠取肝臟，勻漿，經(jīng)9000g離心得到的上清液。再加入一些輔助因子，如輔酶(NADP)、葡萄糖-6-磷酸，K+Mg+及緩沖液等組成S9混合液(S9mix)，構(gòu)成NADPH再生系統(tǒng)。58（3）Ames法原理的依據(jù)法原理的依據(jù)化學(xué)物質(zhì)引起的誘變往往不是直接的，它要經(jīng)過生物的消化、吸收，特別是高等生物肝臟中的有關(guān)酶的作用后再起作用，也許它本來是可以起到誘變作用的，但經(jīng)肝臟中酶作用后失去了誘變能力，也許正好相反，相來它不具有誘變的能力，但經(jīng)肝臟酶作用后，反而獲得了誘變的能力，因此經(jīng)過肝臟中酶的

11、作用才能較真實(shí)地反映在動物活體中某種化學(xué)物的實(shí)際誘變能力。誘變劑僅改變突變的頻率，但不改變突變的方向，那么同樣誘變劑也能導(dǎo)致回復(fù)突變，如果用正突變的話是多方向的，所以必需采用反方向的選擇方向才行，而用回突變只需用基本的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選即可，步驟就要簡單的多。59（4）測試菌株 TA 98、TA 97（檢測移碼突變） 、 TA100（檢測堿基置換突變）及TA102（對醛、過氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感）等。 測試菌株含有組氨酸基因突變（his），脂多糖屏障丟失（rfa），紫外線切除修復(fù)系統(tǒng)缺失，抗藥性標(biāo)記R。60（5）Ames檢測方法61（6） 622、哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗(yàn) 體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正

12、向突變試驗(yàn)。原理是在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使細(xì)胞暴露于受試物一定時間，然后將細(xì)胞再傳代培養(yǎng)，突變細(xì)胞在含有6硫代鳥嘌呤或三氟胸苷的選擇性培養(yǎng)液中能繼續(xù)分裂并形成集落。基于突變集落數(shù)，計算突變頻率以評價受試物的致突變性。突變頻率是指觀察到的突變細(xì)胞數(shù)與存活細(xì)胞數(shù)的比值。633、果蠅伴性隱性致死試驗(yàn) 原理：根據(jù)隱性基因在伴性遺傳中的交叉遺傳特征，即雄性的X染色體傳給F1代雌蠅。又通過F1代傳給F2代雄蠅。X染色體的隱性突變基因在F1代為雜合體，不能表達(dá)，而在F2代雄蠅為半合體，能表達(dá)出來，如果雄蠅接觸受試物后X染色體出現(xiàn)隱性致死性突變，結(jié)果其F2代雄蠅數(shù)目較雌蠅少一半。由此推斷致死突變

13、的存在。644、轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗(yàn) 轉(zhuǎn)基因動物指基因組中整合有用實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遺傳給后代的一類動物。目前，用于致突變作用研究的轉(zhuǎn)基因動物主要有商品化的BigBlue小鼠和MutaMouse小鼠。 轉(zhuǎn)基因動物致突變試驗(yàn)時，染毒后先抽提純化不同器官或組織的基因組DNA，把純化的基因組DNA與噬菌體體外包裝抽提物混合，而將導(dǎo)入的基因載體包裝進(jìn)噬菌體中，用這些噬菌體感染大腸菌，可形成噬菌斑，通過噬菌斑顏色變化進(jìn)行突變的判斷并獲得突變子。655、染色體畸變分析試驗(yàn) 體外染色體畸變分析試驗(yàn)(in vitro )常用的分析細(xì)胞為中國倉鼠卵巢(CHO

14、)細(xì)胞、中國倉鼠肺(CHL、V79)細(xì)胞及外周血淋巴細(xì)胞等。 體內(nèi)染色體畸變分析試驗(yàn)主要有嚙齒類動物睪丸細(xì)胞染色體畸變和骨髓細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)。 染色體結(jié)構(gòu)異常主要可觀察到裂隙、斷裂、斷片、缺失、微小體、著絲點(diǎn)環(huán)、無著絲點(diǎn)環(huán)及各種輻射體等。 染色體數(shù)目異常包括多倍體及非整倍體。66676、微核試驗(yàn)(micronucleus assay) 微核試驗(yàn)是通過觀察有微核的細(xì)胞率()，用于檢測DNA斷裂劑及非整倍體誘發(fā)劑。 用于微核檢測的細(xì)胞很多，現(xiàn)已建立了植物細(xì)胞(如蠶豆根尖等)、哺乳類動物細(xì)胞(如骨髓細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、精子等)、非哺乳類動物細(xì)胞(如魚紅細(xì)胞、蟾蜍紅細(xì)胞等)的微核

15、試驗(yàn)方法。687、程序外DNA合成試驗(yàn) 當(dāng)DNA受損后，DNA的修復(fù)合成可發(fā)生在正常復(fù)制合成期(S期)以外的其他時期，稱為程序外DNA合成。 用同步培養(yǎng)將細(xì)胞阻斷于Gl期，并將正常的DNA半保留復(fù)制阻斷，然后用受試物處理細(xì)胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。如果受試物引起DNA損傷，并啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制，培養(yǎng)液中的3H-胸腺嘧啶核苷就會摻人到DNA鏈中。利用放射自顯影法或液閃計數(shù)法測定摻入DNA的放射活性，檢測DNA修復(fù)合成，從而間接反映DNA的損傷程度。許多哺乳動物及人類細(xì)胞可用于UDS的檢測。698、姐妹染色單體交換試驗(yàn) 在DNA合成期，所有染色體均進(jìn)行復(fù)制，復(fù)制后形成兩

16、條姐妹染色單體。姐妹染色單體交換(sister chromatid exchange，SCE)可能與DNA的斷裂和重接有關(guān)，故可間接反映DNA損傷。 SCE的觀察方法是采用姐妹染色單體的差別染色,在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)，5-BrdU是嘧啶類似物，在DNA合成期可與胸苷競爭摻人DNA中。DNA復(fù)制是半保留復(fù)制，經(jīng)過一次有絲分裂后，5-BrdU摻入后，對染料的親合力下降，染色后會出現(xiàn)一深一淺兩條姐妹染色單體。如果有交換發(fā)生就可在光鏡下計數(shù)SCE。7071二、應(yīng)注意的一些問題1、體外試驗(yàn)的活化系統(tǒng)l無細(xì)胞系統(tǒng)l哺乳動物細(xì)胞l宿主介導(dǎo)試驗(yàn)722、陽性對照和陰性對照的設(shè)立l 陰性對照目的是獲得實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)l 陽性對照目的是證明實(shí)驗(yàn)方法的可靠；實(shí)驗(yàn)者在本實(shí)驗(yàn)條件下完成技術(shù)和鑒定致突變物的能力；證實(shí)經(jīng)一段時間后，本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。733、致突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定l 首先應(yīng)檢查試驗(yàn)的質(zhì)量控制情況：試驗(yàn)程序、操作的正確性、pH、滲透壓、代謝