1、產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選Page 2實(shí)驗(yàn)?zāi)康?以橄欖油作為唯一碳源篩選出能產(chǎn)生出脂肪酶的菌株。 橄欖油乳化法是測定脂肪酶活性的常用方法，其測定的原理是天然油脂被水解產(chǎn)生的游離脂肪酸可以被氫氧化鈉中和。 橄欖油乳化：聚丙烯醇3:1橄欖油乳化，水包油型，然后裝在合適的瓶子里。 Page 3實(shí)驗(yàn)原理： 脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，產(chǎn)脂肪酶的微生物廣泛的分布，主要以各類真菌為主；在富含油脂的地方進(jìn)行采樣，利用稀釋平板分離法篩選產(chǎn)脂肪酶菌株，再以乳化橄欖油為底物。脂肪酶作用于橄欖油乳化液，催化酯鍵水解，生成脂肪酸，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉滴定脂肪酸，利用酚酞滴定終點(diǎn)，記錄消耗的氫氧化鈉體積，根據(jù)氫氧化鈉的用量來計(jì)算脂肪

2、酶的活力。Page 4土壤采集：n 在土門菜市場油污重地進(jìn)行土壤采樣。材料：n 燒杯、玻璃棒、錐形瓶、試管、平板、接種環(huán)、制備乳化狀態(tài)的針筒等。Page 5富集培養(yǎng)基配置：n 硫酸銨0.1% 磷酸氫二鉀0.1% 七水硫酸鎂 0.05% 七水硫酸亞鐵0.001% 酵母膏0.5% 橄欖油乳化液12% 氯化鈉l% PH自然，115滅菌30minPage 6選擇培養(yǎng)基平板：n 乳化橄欖油 12% 蛋白胨 1% 硫酸銨0.2% 磷酸氫二鉀0.1% 磷酸二氫鉀0.3% 七水硫酸亞鐵0.1% 維多利亞藍(lán)0.004% 瓊脂1.5% PH=8.0滅菌11530min復(fù)篩培養(yǎng)基平板：n 乳化橄欖油12% 蛋白胨1

3、% 硫酸銨0.2% 磷酸氫二鉀0.1% 磷酸二氫鉀0.3% 七水硫酸亞鐵0.1% 瓊脂1.5% PH=8 115滅菌30minPage 7實(shí)驗(yàn)方法：n 1、取土樣2g懸于20ml無菌水中，震蕩，在100ml培養(yǎng)基中加入5ml的懸液，30 180r/m 培養(yǎng)3d。n 2、取富集液稀釋分別涂布于選擇培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)觀察菌落周圍的藍(lán)色圈，然后挑取該菌落于富集培養(yǎng)基斜面上。30培養(yǎng)箱3dn 3、將初篩得到的菌株在復(fù)篩培養(yǎng)基平板劃線，然后放于30培養(yǎng)箱中3dn 4、挑取單菌落，鏡檢并純化，得到純菌株保存n 5、活力測定：U=(V-V.)/t50nn 6、U=酶活（微摩爾/min）V=樣品耗堿量（ml

4、),V.=空白耗堿量（ml),50=1ml0.05mol/l氫氧化鈉的微摩爾數(shù)，t=反應(yīng)時(shí)間（min),n=稀釋倍數(shù)Page 8脂肪酶的活力的測定：n 測定方法很多: 酸堿滴定法，電位滴定法，濁度測定法，甘油測定法，色譜分析法等。n 常用的檢測手段為酸堿滴定，在酸堿滴定的方法中，有直接進(jìn)行滴定的，也有先用疏水有機(jī)溶劑抽提出脂肪酸，再進(jìn)行滴定的。Page 9活性測定選擇時(shí)注意哦！n 由于反應(yīng)體系中存在緩沖液的緩沖作用，因此直接滴定法的合理性常令人懷疑，更容易給科研人員造成困惑，而且直接滴定法的穩(wěn)定性一般都不十分理想。n 根據(jù)脂肪酸和銅離子形成銅皂的原理利用分光光度法(715nm附近)進(jìn)行脂肪酶活

5、力的檢測，但是由于實(shí)驗(yàn)中使用大量苯進(jìn)行銅皂的萃取，容易造成污染和對(duì)人體造成傷害，因此使用該方法的人少。n 三丁酸甘油醋和三油酸甘油酷作為底物的時(shí)候，脂肪酶活力檢測的結(jié)果比較穩(wěn)定，但是由于三丁酸甘油醋和三油酸甘油酷價(jià)格比較昂貴，因此使用的人很少。Page 10n 辛酸對(duì)硝基苯酚酷自水解的速度比較快，因此檢測脂肪酶活力的時(shí)候，誤差比較大;而乙酸對(duì)硝基苯酚醋水解的速度比較緩慢，因此實(shí)驗(yàn)誤差相對(duì)較小，但是辛酸對(duì)硝基苯酚醋和乙酸對(duì)硝基苯酚醋都不是脂肪酶的天然底物，一般認(rèn)為不適合作為脂肪酶活力檢測的底物，尤其用乙酸對(duì)硝基 苯酚酷作為底物，其檢測的活力作為醋酶活力似乎更合理一些。n 本實(shí)驗(yàn)篩選得到的野生菌株產(chǎn)胞外脂肪酶活性較小，采用將傳統(tǒng)的直接酸堿滴定法加以改進(jìn)的方法來檢測脂肪酶活性。Page 11應(yīng)用：n 中國食品質(zhì)量報(bào)脂肪酶是酶制劑中的一員，在酒類釀造、蔬菜加工、面包生產(chǎn)、乳品生產(chǎn)