1、細(xì)胞凋亡及檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞凋亡及檢測(cè)技術(shù)第一節(jié)第一節(jié)概概 述述一、細(xì)胞凋亡的概念一、細(xì)胞凋亡的概念細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(apoptosis(apoptosis，這是，這是19721972年年KerrKerr等建等建議用來描述伴隨細(xì)胞死亡的一系列形態(tài)學(xué)上固定的議用來描述伴隨細(xì)胞死亡的一系列形態(tài)學(xué)上固定的變化形式的。變化形式的。細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，最后細(xì)胞循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程，最后細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體脫落離體或裂解為若干凋亡小體(apoptotic (apoptotic bodiesbodies，而被

2、其他細(xì)胞吞噬。，而被其他細(xì)胞吞噬?！暗蛲龅蛲觥币辉~來自一詞來自希臘語(yǔ)，希臘語(yǔ)，apo意為意為“分離分離”，ptosis指花瓣或樹葉指花瓣或樹葉的脫落，的脫落，“凋亡凋亡”是由這兩個(gè)詞組合而成，意指細(xì)是由這兩個(gè)詞組合而成，意指細(xì)胞凋亡的形態(tài)類似胞凋亡的形態(tài)類似秋天秋天花瓣或樹葉的凋落一樣?；ò昊驑淙~的凋落一樣。二、研究簡(jiǎn)史二、研究簡(jiǎn)史半個(gè)世紀(jì)前半個(gè)世紀(jì)前: :人們就觀察到在生物的發(fā)生、人們就觀察到在生物的發(fā)生、生長(zhǎng)、發(fā)育以及衰老過程中，一直伴隨著組織生長(zhǎng)、發(fā)育以及衰老過程中，一直伴隨著組織細(xì)胞的生理自發(fā)退化死亡現(xiàn)象細(xì)胞的生理自發(fā)退化死亡現(xiàn)象. .19651965年年: :發(fā)育生物學(xué)家發(fā)育生物學(xué)家

3、LockshinLockshin和和WilliamsWilliams首先提出了首先提出了PCDPCD（程序化死亡）一詞，用于描（程序化死亡）一詞，用于描述蛾的發(fā)育過程，認(rèn)為隨著成年蛾的出現(xiàn)，其述蛾的發(fā)育過程，認(rèn)為隨著成年蛾的出現(xiàn)，其幼蟲死亡是一種發(fā)育調(diào)節(jié)性死亡。幼蟲死亡是一種發(fā)育調(diào)節(jié)性死亡。 1972 1972年年:Kerr:Kerr等首次提出了細(xì)胞凋亡的概等首次提出了細(xì)胞凋亡的概念，從形態(tài)學(xué)角度描述細(xì)胞的生理死亡，并認(rèn)念，從形態(tài)學(xué)角度描述細(xì)胞的生理死亡，并認(rèn)為這是維持組織細(xì)胞動(dòng)力學(xué)平衡的一種基本生為這是維持組織細(xì)胞動(dòng)力學(xué)平衡的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，可能具有十分重要的生物學(xué)意義。物學(xué)現(xiàn)象，可能具

4、有十分重要的生物學(xué)意義。19771977年年: :人們注意到在生理或病理性刺激人們注意到在生理或病理性刺激條件下，淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中的凋亡現(xiàn)象。并條件下，淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中的凋亡現(xiàn)象。并認(rèn)為這是維持組織細(xì)胞動(dòng)力學(xué)平衡的一種基本認(rèn)為這是維持組織細(xì)胞動(dòng)力學(xué)平衡的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，可能具有十分重要的生物學(xué)意義。生物學(xué)現(xiàn)象，可能具有十分重要的生物學(xué)意義。 19801980年年:Wyllie:Wyllie研究胸腺細(xì)胞在糖皮質(zhì)激素作研究胸腺細(xì)胞在糖皮質(zhì)激素作用下引致的細(xì)胞凋亡變化，總結(jié)并建立了細(xì)胞凋用下引致的細(xì)胞凋亡變化，總結(jié)并建立了細(xì)胞凋亡的共同形態(tài)學(xué)特征，包括核固縮和亡的共同形態(tài)學(xué)特征，包括核固縮和

5、DNADNA降解成降解成寡核苷酸片段等。寡核苷酸片段等。19891989年年: 0wen: 0wen及其研究小組在研究胸腺細(xì)胞陰及其研究小組在研究胸腺細(xì)胞陰性選擇過程中，發(fā)現(xiàn)性選擇過程中，發(fā)現(xiàn)T T細(xì)胞受體細(xì)胞受體(TCR)(TCR)與自身抗原與自身抗原相互作用與未成熟相互作用與未成熟T T細(xì)胞的細(xì)胞的PCDPCD發(fā)生有關(guān)，并在體發(fā)生有關(guān)，并在體外證實(shí)剌激外證實(shí)剌激CD3CD3分子可誘導(dǎo)未成熟分子可誘導(dǎo)未成熟T T細(xì)胞細(xì)胞PCDPCD的發(fā)的發(fā)生。證明了信號(hào)傳遞物質(zhì)對(duì)生。證明了信號(hào)傳遞物質(zhì)對(duì)PCDPCD的調(diào)控作用。的調(diào)控作用。 19911991年年:Ellis:Ellis首先發(fā)現(xiàn)了線蟲首先發(fā)現(xiàn)了

6、線蟲(C.elegans)(C.elegans)體內(nèi)體內(nèi)Ced-3Ced-3、4 4兩個(gè)基因與兩個(gè)基因與PCDPCD的發(fā)生密切相關(guān)，的發(fā)生密切相關(guān)，隨后逐漸發(fā)現(xiàn)了多種參與隨后逐漸發(fā)現(xiàn)了多種參與PCDPCD的正相調(diào)節(jié)基因和的正相調(diào)節(jié)基因和負(fù)相調(diào)節(jié)基因，前者包括負(fù)相調(diào)節(jié)基因，前者包括Ced-2Ced-2、p53p53、cmyccmyc、FasFas、糖皮質(zhì)激素受體及白細(xì)胞介素、糖皮質(zhì)激素受體及白細(xì)胞介素11轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(ICE(ICE等基因，后者則有等基因，后者則有Ced-9Ced-9、bcl-2bcl-2、p53p53等等基因基因. .三、細(xì)胞凋亡的特征三、細(xì)胞凋亡的特征n細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死雖然都是

7、細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死雖然都是細(xì)胞死亡，但細(xì)胞凋亡的形態(tài)及生化特征與壞死性但細(xì)胞凋亡的形態(tài)及生化特征與壞死性細(xì)胞死亡的特點(diǎn)則不同細(xì)胞死亡的特點(diǎn)則不同（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變：（一）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變： 組織內(nèi)單個(gè)細(xì)胞或小團(tuán)細(xì)胞的死亡組織內(nèi)單個(gè)細(xì)胞或小團(tuán)細(xì)胞的死亡 不引發(fā)細(xì)胞自溶，也不引起炎癥反應(yīng)不引發(fā)細(xì)胞自溶，也不引起炎癥反應(yīng)電鏡下可見：凋亡細(xì)胞固縮電鏡下可見：凋亡細(xì)胞固縮 胞漿致密，細(xì)胞器密集、退變胞漿致密，細(xì)胞器密集、退變 核染色質(zhì)致密，聚集于核膜處核染色質(zhì)致密，聚集于核膜處 胞核裂解，胞漿形成多發(fā)性芽突胞核裂解，胞漿形成多發(fā)性芽突 凋亡小體形成凋亡小體形成光鏡下：凋亡小體外被以

8、胞膜，圓形或卵圓形，胞光鏡下：凋亡小體外被以胞膜，圓形或卵圓形，胞漿濃縮，強(qiáng)嗜酸性，可有可無固縮深染的核碎片。漿濃縮，強(qiáng)嗜酸性，可有可無固縮深染的核碎片。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在形態(tài)學(xué)上的差別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在形態(tài)學(xué)上的差別 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡 細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死 單細(xì)胞丟失單細(xì)胞丟失細(xì)胞膜發(fā)泡但仍完整細(xì)胞膜發(fā)泡但仍完整,細(xì)胞膜內(nèi)細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞分割成凋亡小體陷將細(xì)胞分割成凋亡小體不發(fā)生炎癥反應(yīng)不發(fā)生炎癥反應(yīng)被臨近正常細(xì)胞或吞噬細(xì)胞吞被臨近正常細(xì)胞或吞噬細(xì)胞吞噬噬溶酶體完整溶酶體完整染色質(zhì)均一凝集染色質(zhì)均一凝集 細(xì)胞成群丟失細(xì)胞成群丟失細(xì)胞膜不完整細(xì)胞膜不完整,細(xì)胞細(xì)胞腫脹、溶解腫脹、溶解發(fā)生嚴(yán)重炎

9、癥反應(yīng)發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)被巨噬細(xì)胞吞噬被巨噬細(xì)胞吞噬溶酶體裂解溶酶體裂解染色質(zhì)凝集成塊、染色質(zhì)凝集成塊、不均一不均一 細(xì)胞壞死時(shí)核的變化細(xì)胞壞死時(shí)核的變化細(xì)胞壞死時(shí)的細(xì)胞壞死時(shí)的炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)(二二)細(xì)胞凋亡的生化改變：凋亡過程中出現(xiàn)的生化細(xì)胞凋亡的生化改變：凋亡過程中出現(xiàn)的生化改變以改變以DNA的片段化及蛋白質(zhì)的降解最為重要。的片段化及蛋白質(zhì)的降解最為重要。1)DNA的片段化的片段化 組成染色質(zhì)的組成染色質(zhì)的DNA鏈被激活的核鏈被激活的核酸內(nèi)切酶切割，可形成酸內(nèi)切酶切割，可形成180200bp或其整倍數(shù)的或其整倍數(shù)的片段，電泳中呈特征灶的片段，電泳中呈特征灶的“梯梯”狀條帶狀條帶，這是判斷，

10、這是判斷凋亡發(fā)生的客凋亡發(fā)生的客 觀指標(biāo)之一。觀指標(biāo)之一。2)蛋白質(zhì)的降解蛋白質(zhì)的降解 凋亡蛋白酶激活，水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)凋亡蛋白酶激活，水解細(xì)胞的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞解體并形成胞解體并形成凋亡小體凋亡小體、水解相關(guān)活性蛋白，從而、水解相關(guān)活性蛋白，從而使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能。使該蛋白獲得或喪失某種生物學(xué)功能。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在生物化學(xué)上的區(qū)別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在生物化學(xué)上的區(qū)別 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死生理因素誘導(dǎo)生理因素誘導(dǎo)非生理因素造成的意非生理因素造成的意外損傷外損傷受大分子合成和激活過程的嚴(yán)受大分子合成和激活過程的嚴(yán)格調(diào)控格調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)喪失離子穩(wěn)態(tài)調(diào)

11、節(jié)喪失需要能量需要能量不需要能量不需要能量需要大分子合成需要大分子合成不需要核酸和蛋白質(zhì)不需要核酸和蛋白質(zhì)的合成的合成有新基因從頭轉(zhuǎn)錄有新基因從頭轉(zhuǎn)錄沒有新基因轉(zhuǎn)錄沒有新基因轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)非隨機(jī)降解為染色質(zhì)非隨機(jī)降解為DNA“梯帶梯帶” 染色質(zhì)染色質(zhì)DNA隨機(jī)降隨機(jī)降解解四、細(xì)胞凋亡的過程與調(diào)控四、細(xì)胞凋亡的過程與調(diào)控 凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡基因激活凋亡基因激活細(xì)胞凋亡的執(zhí)行細(xì)胞凋亡的執(zhí)行凋亡細(xì)胞的清除凋亡細(xì)胞的清除(一一)凋亡的四個(gè)階段：凋亡的四個(gè)階段： 凋亡誘導(dǎo)因素凋亡誘導(dǎo)因素+ 受體受體cAMPCa2+神經(jīng)酰胺神經(jīng)酰胺死亡信號(hào)死亡信號(hào)凋亡基因激活凋亡基因激活DNase激活激活Caspa

12、se激活激活巨噬細(xì)胞吞噬巨噬細(xì)胞吞噬分解凋亡細(xì)胞分解凋亡細(xì)胞（二）細(xì)胞凋亡的調(diào)控（二）細(xì)胞凋亡的調(diào)控1 . 細(xì)胞凋亡的相關(guān)因素細(xì)胞凋亡的相關(guān)因素（1） 誘導(dǎo)性因素誘導(dǎo)性因素激素和生長(zhǎng)因子失衡：缺乏（激素和生長(zhǎng)因子失衡：缺乏（IL-2，淋巴細(xì)胞凋，淋巴細(xì)胞凋亡）或過多（糖皮質(zhì)激素亡）或過多（糖皮質(zhì)激素，淋巴細(xì)胞凋亡），淋巴細(xì)胞凋亡） 理化因素：射線、高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醇、抗癌理化因素：射線、高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醇、抗癌藥物等藥物等 免疫性因素：如，免疫性因素：如，CTL分泌粒酶分泌粒酶靶細(xì)胞凋亡靶細(xì)胞凋亡微生物因素：細(xì)菌、病毒及毒素。（微生物因素：細(xì)菌、病毒及毒素。（HIV） （2）抑制性因素

13、：）抑制性因素： 細(xì)胞因子：細(xì)胞因子：IL-2、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子激素：激素：ACTH、睪丸酮、雌激素等、睪丸酮、雌激素等二價(jià)金屬陽(yáng)離子：二價(jià)金屬陽(yáng)離子：Zn2+藥物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、中性藥物：苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、中性氨基酸氨基酸病毒：病毒：EB病毒、牛痘病毒病毒、牛痘病毒CrmA2 .細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核DNA片段化片段化斷裂及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)。斷裂及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)。凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的特點(diǎn)：凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的特點(diǎn)：多樣性：不同種類細(xì)胞有不同系統(tǒng)多樣

14、性：不同種類細(xì)胞有不同系統(tǒng)耦聯(lián)性：凋亡與增殖分化系統(tǒng)在某些環(huán)節(jié)交、耦聯(lián)，耦聯(lián)性：凋亡與增殖分化系統(tǒng)在某些環(huán)節(jié)交、耦聯(lián)，同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)同一性：不同凋亡誘導(dǎo)因素可通過同一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可通過不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)多途性：同一凋亡誘導(dǎo)因素可通過不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)研究較多的系統(tǒng)：研究較多的系統(tǒng)：依據(jù)：依據(jù)：細(xì)胞凋亡時(shí)胞內(nèi)游離細(xì)胞凋亡時(shí)胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著上升濃度顯著上升用用Ca2+載體載體A23187人為升高人為升高B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞Ca2+水水平，平，B淋巴細(xì)胞凋亡淋巴細(xì)胞凋亡用用Ca2

15、+絡(luò)合劑降低胞內(nèi)絡(luò)合劑降低胞內(nèi)Ca2+水平，阻止細(xì)胞凋亡水平，阻止細(xì)胞凋亡 激活激活Ca2+依賴谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶依賴谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶Ca2+ 活化核轉(zhuǎn)錄因子活化核轉(zhuǎn)錄因子1胞內(nèi)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)系統(tǒng)（信號(hào)系統(tǒng)（Ca2+為第二信使）為第二信使）2cAMP/PKA信號(hào)系統(tǒng)（信號(hào)系統(tǒng)（cAMP為第二信使）為第二信使）依據(jù)：依據(jù)：雙丁酰雙丁酰cAMP可引起培養(yǎng)的髓樣白血病細(xì)胞及胸腺可引起培養(yǎng)的髓樣白血病細(xì)胞及胸腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡糖皮質(zhì)激素使糖皮質(zhì)激素使cAMP上升上升cAMP激活激活PKA使靶蛋白某些氨基酸（蘇、絲使靶蛋白某些氨基酸（蘇、絲AA）殘基磷酸化）殘基磷酸化改變蛋白質(zhì)功能改變蛋白質(zhì)功能3Fas蛋白

16、蛋白/Fas配體信號(hào)系統(tǒng)配體信號(hào)系統(tǒng)Fas蛋白：細(xì)胞膜跨膜蛋白蛋白：細(xì)胞膜跨膜蛋白Fas蛋白蛋白+Fas配體（抗配體（抗Fas）細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡機(jī)制：機(jī)制：Fas蛋白蛋白+Fas配體（抗配體（抗Fas）神經(jīng)鞘磷脂酶活性神經(jīng)鞘磷脂酶活性產(chǎn)生神酰胺產(chǎn)生神酰胺蛋白激酶激活蛋白激酶激活細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡Fas蛋白蛋白+抗抗Fas、TNF 激活激活I(lǐng)CE樣樣caspase 降降解解H1組蛋白組蛋白染色體松馳染色體松馳DNA暴露內(nèi)切酶位點(diǎn)暴露內(nèi)切酶位點(diǎn)通過通過Ca2+信號(hào)系統(tǒng)傳遞死亡信息引起細(xì)胞凋亡信號(hào)系統(tǒng)傳遞死亡信息引起細(xì)胞凋亡4神經(jīng)酰胺信號(hào)系統(tǒng)神經(jīng)酰胺信號(hào)系統(tǒng)神經(jīng)酰胺：神經(jīng)鞘磷脂（神經(jīng)酰胺：神經(jīng)鞘磷脂（

17、SM）在神經(jīng)鞘磷脂酶的）在神經(jīng)鞘磷脂酶的作用下產(chǎn)生的一類新型第二信使物質(zhì)。作用下產(chǎn)生的一類新型第二信使物質(zhì)。介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的依據(jù)：用天然神經(jīng)酰胺處理介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的依據(jù)：用天然神經(jīng)酰胺處理u937白血病細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡白血病細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡神經(jīng)酰胺途徑相關(guān)誘因：電離輻射、神經(jīng)酰胺途徑相關(guān)誘因：電離輻射、TNF-、Fas抗原、糖皮質(zhì)激素抗原、糖皮質(zhì)激素 5二酰甘油二酰甘油/蛋白激酶蛋白激酶C（PKC）信號(hào)系統(tǒng)）信號(hào)系統(tǒng)二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿在磷脂酶二酰甘油：磷脂酰肌醇和磷脂酰膽堿在磷脂酶C催催化下產(chǎn)生的一種第二信使物質(zhì)。化下產(chǎn)生的一種第二信使物質(zhì)。依據(jù)：依據(jù)：活化的活化的PKC1可誘導(dǎo)

18、可誘導(dǎo)u937白血病細(xì)胞凋亡白血病細(xì)胞凋亡抑制抑制PKC活性可抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠胸腺活性可抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠胸腺細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡PKC激動(dòng)劑佛波脂可抑制某些類型細(xì)胞凋亡（糖激動(dòng)劑佛波脂可抑制某些類型細(xì)胞凋亡（糖皮質(zhì)激素、皮質(zhì)激素、T細(xì)胞受體激活、細(xì)胞受體激活、IL-2撤除）撤除）6酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子激活酪氨酸蛋白激酶激活酪氨酸蛋白激酶靶靶蛋白酪氨酸磷酸化蛋白酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活蛋白激活通過通過Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白質(zhì)磷酸化蛋白質(zhì)磷酸化細(xì)胞分化細(xì)胞分化生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子撤除生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子撤除不能激活酪氨酸蛋

19、白不能激活酪氨酸蛋白激酶系統(tǒng)激酶系統(tǒng)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡3.凋亡相關(guān)基因凋亡相關(guān)基因三類：三類：抑制凋亡基因：抑制凋亡基因：Bcl-2、EIB、IAP促進(jìn)凋亡基因：促進(jìn)凋亡基因：P53、Bax、ICE雙向調(diào)節(jié)基因：雙向調(diào)節(jié)基因：c-myc、Bclx(B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞淋巴瘤/白血病白血病-2B cell lymphoma / leukemia-2基因的縮寫) Bcl-2蛋白：蛋白：229個(gè)氨基酸（人）、個(gè)氨基酸（人）、236個(gè)氨基酸（小鼠）個(gè)氨基酸（小鼠）分布：線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞膜內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜分布：線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞膜內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜作用：作用：Bcl-2高表達(dá)能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素所引起的細(xì)高

20、表達(dá)能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素所引起的細(xì)胞凋亡胞凋亡依據(jù)：依據(jù)：導(dǎo)入導(dǎo)入Bcl-2基因質(zhì)?？煞乐股窠?jīng)細(xì)胞因撤除神經(jīng)生長(zhǎng)因基因質(zhì)粒可防止神經(jīng)細(xì)胞因撤除神經(jīng)生長(zhǎng)因子所誘導(dǎo)的凋亡子所誘導(dǎo)的凋亡淋巴細(xì)胞有淋巴細(xì)胞有20%呈呈Bcl-2陽(yáng)性時(shí)，預(yù)后不佳（耐受放射陽(yáng)性時(shí)，預(yù)后不佳（耐受放射線、抗癌藥物）線、抗癌藥物）1.Bcl-2 直接的抗氧化作用直接的抗氧化作用 抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)（細(xì)胞色素抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)（細(xì)胞色素C、AIF） 抑制促凋亡性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)抑制促凋亡性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)Bax、Bak的細(xì)胞毒作用的細(xì)胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶（抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活）的激活 維持細(xì)胞鈣穩(wěn)

21、態(tài)維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)Bcl-2抗凋亡作用機(jī)制：抗凋亡作用機(jī)制：作用：作用：野生型（野生型（wtP53）：）：DNA結(jié)合蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡結(jié)合蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（“分子警察分子警察”）突變型：抑制細(xì)胞凋亡突變型：抑制細(xì)胞凋亡野生型野生型P53的作用機(jī)制：的作用機(jī)制：P53蛋白蛋白細(xì)胞周期細(xì)胞周期G1期檢期檢查染色體查染色體DNA損傷（檢查點(diǎn)功能）損傷（檢查點(diǎn)功能）發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)DNA損傷損傷剌激剌激CIP的表達(dá)的表達(dá)阻止細(xì)胞進(jìn)入下一周期，啟動(dòng)阻止細(xì)胞進(jìn)入下一周期，啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制修復(fù)機(jī)制修復(fù)失敗修復(fù)失敗啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡2.P53c-myc: 一種癌基因，它能誘導(dǎo)增殖，也能

22、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有一種癌基因，它能誘導(dǎo)增殖，也能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有雙向調(diào)節(jié)作用。雙向調(diào)節(jié)作用。作用機(jī)制：作用機(jī)制：c-myc蛋白為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，既可介蛋白為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，既可介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因，也可激活介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，其導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因，也可激活介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，其作用取決于細(xì)胞接受何種信號(hào)及細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境（有生作用取決于細(xì)胞接受何種信號(hào)及細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境（有生長(zhǎng)因子長(zhǎng)因子增殖，無生長(zhǎng)因子增殖，無生長(zhǎng)因子凋亡）。凋亡）。Bcl-x：能翻譯：能翻譯Bcl-XL和和Bcl-Xs兩種蛋白，兩種蛋白，Bcl-XL蛋蛋白抑制細(xì)胞凋亡，白抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-Xs蛋白促進(jìn)細(xì)胞凋亡（合成以蛋

23、白促進(jìn)細(xì)胞凋亡（合成以誰(shuí)為主）誰(shuí)為主） 3.c-myc,Bcl-x五、五、 細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制（一）氧化損傷（一）氧化損傷氧化損傷的后果之一：細(xì)胞凋亡氧化損傷的后果之一：細(xì)胞凋亡依據(jù)：依據(jù)：各種氧化劑（各種氧化劑（H2O2）可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡）可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制超氧化物歧化酶（抑制超氧化物歧化酶（SOD）活性可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡）活性可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抗氧化劑（抗氧化劑（VitE、胡蘿卜素等）可阻斷有氧化應(yīng)激背、胡蘿卜素等）可阻斷有氧化應(yīng)激背景的各種凋亡誘導(dǎo)因素（景的各種凋亡誘導(dǎo)因素（TNF-、電離輻射）引起的細(xì)、電離輻射）引起的細(xì)胞凋亡胞凋亡引起引起DNA損傷，激活損傷，激活P5

24、3基因基因引起引起DNA損傷，活化多聚損傷，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭核糖合成酶，耗竭NAD，消耗大量消耗大量ATP攻擊細(xì)胞膜不飽和脂肪酸，脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞膜損傷或攻擊細(xì)胞膜不飽和脂肪酸，脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞膜損傷或產(chǎn)生過氧羥基產(chǎn)生過氧羥基24碳四烯酸碳四烯酸激活激活Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶依賴的核酸內(nèi)切酶細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞膜損傷，Ca2+內(nèi)流增多及損傷線粒體，通透性增內(nèi)流增多及損傷線粒體，通透性增加膜電位改變加膜電位改變活化核轉(zhuǎn)錄因子活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-B、AP-1，加速凋亡相關(guān)基因表達(dá)，加速凋亡相關(guān)基因表達(dá)氧化損傷引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制：氧化損傷引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制：（二）鈣穩(wěn)態(tài)

25、失衡（二）鈣穩(wěn)態(tài)失衡細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡是細(xì)胞凋亡的重要機(jī)機(jī)制之一細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡是細(xì)胞凋亡的重要機(jī)機(jī)制之一依據(jù)：依據(jù)：各種凋亡刺激所引起的凋亡是鈣依賴過程各種凋亡刺激所引起的凋亡是鈣依賴過程凋亡發(fā)生時(shí)胞漿凋亡發(fā)生時(shí)胞漿Ca2+濃度顯著上升，并在隨后的濃度顯著上升，并在隨后的一系列凋亡改變中起關(guān)鍵性作用（核酸內(nèi)切酶激活、一系列凋亡改變中起關(guān)鍵性作用（核酸內(nèi)切酶激活、需鈣蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的激活，細(xì)需鈣蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的激活，細(xì)胞膜的空泡化）胞膜的空泡化）鈣穩(wěn)態(tài)失衡參與多種凋亡相關(guān)疾病的發(fā)?。ㄉ窠?jīng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡參與多種凋亡相關(guān)疾病的發(fā)病（神經(jīng)退行性疾?。┩诵行约膊。┘せ罴せ頒a2+

26、/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶，降解依賴的核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈鏈激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化肽鏈間的?；D(zhuǎn)移酶，激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，催化肽鏈間的?；D(zhuǎn)移酶，肽鏈間形成共價(jià)鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛肽鏈間形成共價(jià)鍵，使細(xì)胞骨架蛋白分子間發(fā)生廣泛交聯(lián)，有利于凋亡小體形成交聯(lián)，有利于凋亡小體形成激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因表達(dá)激活核轉(zhuǎn)錄因子，加速凋亡相關(guān)基因表達(dá)Ca2+在在ATP的配合下使的配合下使DNA鏈?zhǔn)嬲?，暴露核小體鏈?zhǔn)嬲梗┞逗诵◇w之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，有利于之間的連接區(qū)內(nèi)的酶切位點(diǎn)，有利于DNA內(nèi)切酶切割內(nèi)切酶切割DNA鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制：鈣穩(wěn)態(tài)失衡引起細(xì)胞凋亡的可

27、能機(jī)制：（三）線粒體損傷（三）線粒體損傷線粒體的改變：線粒體內(nèi)膜通透性增大，線粒體內(nèi)膜線粒體的改變：線粒體內(nèi)膜通透性增大，線粒體內(nèi)膜跨膜電位（跨膜電位（m）下降，能量代謝水平顯著降低）下降，能量代謝水平顯著降低線粒體改變?cè)诩?xì)胞凋亡發(fā)生中起關(guān)鍵作用線粒體改變?cè)诩?xì)胞凋亡發(fā)生中起關(guān)鍵作用依據(jù)：依據(jù)：抑制線粒體的三羧酸循環(huán)或呼吸鏈功能可誘導(dǎo)細(xì)胞抑制線粒體的三羧酸循環(huán)或呼吸鏈功能可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡凋亡在細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡改變之前，常先有線粒體內(nèi)膜跨在細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡改變之前，常先有線粒體內(nèi)膜跨膜電位（膜電位（m）下降）下降阻止線粒體通透性的改變，可防止細(xì)胞凋亡（阻止線粒體通透性的改變，可防止細(xì)胞凋亡（Bcl-2）

28、線粒體改變引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制：線粒體改變引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制： CaCa2+2+NONO缺血缺血原卟啉原卟啉活性氧活性氧線 粒 體線 粒 體mm下下降降Bcl-2 (-)PTP開放開放Apaf+Cyt.CCaspase-9Caspase-9酶原酶原Caspase-9Caspase-9(+)Caspase-3Caspase-3酶原酶原Caspase-3Caspase-3(+)CaspaseCaspase抑制劑抑制劑AIF(-)蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)水解細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡DNA斷裂斷裂無活性核酸內(nèi)切酶無活性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶激活核酸內(nèi)切酶激活(+)(+)第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法

29、細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法：歸納起來，細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法：歸納起來，可分三方面，即根據(jù)凋亡的形態(tài)學(xué)特可分三方面，即根據(jù)凋亡的形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞凋亡的生化特征以及細(xì)胞凋征、細(xì)胞凋亡的生化特征以及細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本節(jié)主要介紹亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本節(jié)主要介紹細(xì)胞凋亡的常用病理學(xué)檢測(cè)方法。細(xì)胞凋亡的常用病理學(xué)檢測(cè)方法。一、蘇木精一、蘇木精- -伊紅染色方法伊紅染色方法(HE(HE染色染色) )1石蠟組織切片石蠟組織切片HE染色（略）染色（略）2細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片的細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片的HE染色染色（1）細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片的制備：）細(xì)胞爬片或細(xì)胞涂片的制備： 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞

30、)：讓細(xì)胞：讓細(xì)胞生長(zhǎng)在蓋玻片使其在上面爬行生長(zhǎng)。取出生長(zhǎng)在蓋玻片使其在上面爬行生長(zhǎng)。取出蓋玻片，經(jīng)蓋玻片，經(jīng)PBS輕輕漂洗后，用輕輕漂洗后，用4%的甲醛的甲醛或多聚甲醛在常溫下固定或多聚甲醛在常溫下固定510min，即可，即可染色。染色。 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞)或貼壁生或貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)消化脫壁成單細(xì)胞懸液后，可長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)消化脫壁成單細(xì)胞懸液后，可經(jīng)細(xì)胞涂片后染色。經(jīng)細(xì)胞涂片后染色。（2）染色方法）染色方法:同石蠟組織切片同石蠟組織切片HE染色，免染色，免去第去第1和第和第2步。步。 【結(jié)果判斷】 1.光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。凋亡光學(xué)顯微鏡下細(xì)

31、胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。凋亡細(xì)胞在組織中單個(gè)散在分布，表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮，細(xì)胞在組織中單個(gè)散在分布，表現(xiàn)為核染色質(zhì)致密濃縮，核碎裂等。核碎裂等。 2.在細(xì)胞爬片上，凋亡的細(xì)胞變圓、變小，可見細(xì)胞在細(xì)胞爬片上，凋亡的細(xì)胞變圓、變小，可見細(xì)胞核固縮、碎裂，染色體被染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色；可見細(xì)核固縮、碎裂，染色體被染成深藍(lán)色或藍(lán)黑色；可見細(xì)胞膜皺折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小胞膜皺折、卷曲和出泡，以及芽生形成膜包裹的凋亡小體體(apoptotic bodies。而正常細(xì)胞經(jīng)染色后仍保持細(xì)。而正常細(xì)胞經(jīng)染色后仍保持細(xì)胞原有的生長(zhǎng)形狀胞原有的生長(zhǎng)形狀(如梭形或多角形如梭形或多角形)，細(xì)

32、胞核規(guī)整，染成，細(xì)胞核規(guī)整，染成均一藍(lán)色。細(xì)胞涂片時(shí)可見凋亡細(xì)胞核固縮、碎裂，染均一藍(lán)色。細(xì)胞涂片時(shí)可見凋亡細(xì)胞核固縮、碎裂，染色變深；正常細(xì)胞染色體顯均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，而壞死色變深；正常細(xì)胞染色體顯均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，而壞死細(xì)胞細(xì)胞腫脹，可見細(xì)胞膜的連續(xù)性破壞，核染色體染細(xì)胞細(xì)胞腫脹，可見細(xì)胞膜的連續(xù)性破壞，核染色體染成很淡的藍(lán)色甚至消失。成很淡的藍(lán)色甚至消失。 嗜酸性小體嗜酸性小體(凋亡凋亡)嗜酸性變及嗜酸性小體嗜酸性變及嗜酸性小體肝細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮紅染，呈嗜肝細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮紅染，呈嗜酸性變；或胞漿進(jìn)一步濃縮，細(xì)胞變圓，酸性變；或胞漿進(jìn)一步濃縮，細(xì)胞變圓，核碎裂、溶解消失，呈嗜

33、酸性小體狀核碎裂、溶解消失，呈嗜酸性小體狀二、甲基綠二、甲基綠- -派諾寧染色法派諾寧染色法【染色原理】【染色原理】 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死均可表現(xiàn)為細(xì)胞核固細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死均可表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮等細(xì)胞死亡形態(tài)，但兩者發(fā)生機(jī)制不同?？s等細(xì)胞死亡形態(tài)，但兩者發(fā)生機(jī)制不同。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，需要有細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，需要有細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的激活，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的激活，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達(dá)的增強(qiáng)。而細(xì)胞壞死則是一種被動(dòng)的細(xì)表達(dá)的增強(qiáng)。而細(xì)胞壞死則是一種被動(dòng)的細(xì)胞死亡過程，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有胞死亡過程，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)常有RNA的損失。根的損失。根據(jù)這一特點(diǎn)，可應(yīng)用試劑甲基綠對(duì)據(jù)這一

34、特點(diǎn)，可應(yīng)用試劑甲基綠對(duì)DNA染色染色的特異性和派諾寧對(duì)的特異性和派諾寧對(duì)RNA的親和性，使甲基的親和性，使甲基綠對(duì)固縮細(xì)胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如綠對(duì)固縮細(xì)胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸著染，如果細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽(yáng)性染色者為果細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽(yáng)性染色者為凋亡細(xì)胞，呈陰性染色者為壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞，呈陰性染色者為壞死細(xì)胞?！驹噭┘芭渲啤俊驹噭┘芭渲啤?.組織固定液組織固定液 無水乙醇無水乙醇600ml 氯氯 仿仿300ml 冰乙酸冰乙酸100ml 2.甲基綠純化甲基綠純化 新購(gòu)買的甲基綠新購(gòu)買的甲基綠(methyl green)需用氯仿進(jìn)行需用氯仿進(jìn)行純化處理以去除甲基紫。方法是將純化處

35、理以去除甲基紫。方法是將2%甲基綠水甲基綠水溶液溶液20ml傾入潔凈分液漏斗，加入氯仿傾入潔凈分液漏斗，加入氯仿20ml充充分混勻，使其內(nèi)的甲基紫溶于氯仿中而呈紫紅分混勻，使其內(nèi)的甲基紫溶于氯仿中而呈紫紅色。旋動(dòng)分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉帶色。旋動(dòng)分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉帶紫紅色的氯仿移去，再加入新的氯仿紫紅色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如，如此反復(fù)更換氯仿，直到無紫紅色為止。該液作此反復(fù)更換氯仿，直到無紫紅色為止。該液作為貯存液，為貯存液，4保存。保存。3.染色液染色液甲基綠貯存液甲基綠貯存液5m15%派諾寧水溶液派諾寧水溶液lm1蒸餾水蒸餾水12m12mol/L乙酸鈉乙酸

36、鈉(pH4.8)18ml(臨用前配臨用前配制，濾紙過濾制，濾紙過濾) 【操作方法】【操作方法】1.新鮮取材組織置組織固定液中新鮮取材組織置組織固定液中4固定固定36h；2.直接轉(zhuǎn)入直接轉(zhuǎn)入95%乙醇脫水和無水乙醇脫水，二乙醇脫水和無水乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；甲苯透明，石蠟包埋；3.切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水；切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至蒸餾水；4.置染色液中室溫下染片約置染色液中室溫下染片約lh；5.取出切片，不經(jīng)水洗，用濾紙吸干多余染液；取出切片，不經(jīng)水洗，用濾紙吸干多余染液；6.插入丙酮中迅速分化；插入丙酮中迅速分化；7.轉(zhuǎn)入丙酮二甲苯轉(zhuǎn)入丙酮二甲苯(1:1)稍洗；

37、稍洗；8二甲苯透明二甲苯透明23次；次；9中性樹膠封固中性樹膠封固 【結(jié)果判斷】 凋亡細(xì)胞：光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞細(xì)凋亡細(xì)胞：光學(xué)顯微鏡下凋亡細(xì)胞細(xì)胞核固縮呈綠色或綠藍(lán)色著染，胞質(zhì)呈紅胞核固縮呈綠色或綠藍(lán)色著染，胞質(zhì)呈紅紫色著染。觀察時(shí)可用凋亡指數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，紫色著染。觀察時(shí)可用凋亡指數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，即隨機(jī)選擇約即隨機(jī)選擇約1020個(gè)視野個(gè)視野(每張切片約每張切片約10002500個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分率。率。細(xì)胞壞死：只有固縮細(xì)胞核呈綠色著染。細(xì)胞壞死：只有固縮細(xì)胞核呈綠色著染。 三、吖啶橙染色法三、吖啶橙染色法【染色原理】【染色原理】吖啶橙的熒光隨吖啶橙的熒光隨pH而變，

38、其正色為綠色，而變，其正色為綠色，隨隨pH下降可變到橙紅色。吖啶橙與下降可變到橙紅色。吖啶橙與DNA和和RNA通過兩個(gè)部位結(jié)合，連接堿基對(duì)和磷酸鹽基團(tuán)，通過兩個(gè)部位結(jié)合，連接堿基對(duì)和磷酸鹽基團(tuán)，吖啶橙與堿基對(duì)結(jié)合，形成第一復(fù)合物。第二吖啶橙與堿基對(duì)結(jié)合，形成第一復(fù)合物。第二復(fù)合物在多核苷酸表面，由吖啶橙與磷酸鹽基復(fù)合物在多核苷酸表面，由吖啶橙與磷酸鹽基團(tuán)連接而成。團(tuán)連接而成。pH 6.0時(shí)，時(shí)，DNA結(jié)合染料的聚合結(jié)合染料的聚合加速，加速，pH低于低于3.8時(shí)，聚合受抑制，而時(shí)，聚合受抑制，而RNA在在pH 6.0和和3.8都能聚合而使顏色變紅都能聚合而使顏色變紅。 【試劑及配制】【試劑及配制

39、】 吖啶橙貯存液吖啶橙貯存液:10mg:10mg吖啶橙溶解于吖啶橙溶解于100ml 100ml PBSPBS中，中，pH 4.8pH 4.86.06.0濾過，濾過，4 40 0C C避光保存避光保存【操作方法】【操作方法】1.制備活細(xì)胞懸液，濃度約為制備活細(xì)胞懸液，濃度約為107/ml2.取取95l細(xì)胞懸液，加細(xì)胞懸液，加5l吖啶橙貯存液混勻吖啶橙貯存液混勻3.吸一滴混合液滴于潔凈玻片上，直接用蓋吸一滴混合液滴于潔凈玻片上，直接用蓋玻片封片玻片封片4.熒光顯微鏡選用激發(fā)濾片熒光顯微鏡選用激發(fā)濾片BG12，BV等，等，阻斷濾片用阻斷濾片用515nm或或SP3 【結(jié)果判斷】【結(jié)果判斷】 正常細(xì)胞：

40、在熒光顯微鏡下，細(xì)胞核正常細(xì)胞：在熒光顯微鏡下，細(xì)胞核DNA為黃色或黃綠色均勻熒光，細(xì)胞質(zhì)和核仁的為黃色或黃綠色均勻熒光，細(xì)胞質(zhì)和核仁的RNA為桔黃或桔紅色熒光為桔黃或桔紅色熒光 凋亡細(xì)胞：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃凋亡細(xì)胞：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的黃綠色染色，甚或見黃綠色碎片染的黃綠色染色，甚或見黃綠色碎片 壞死細(xì)胞：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或桔黃色熒光壞死細(xì)胞：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或桔黃色熒光均可減弱或消失均可減弱或消失 四、原位末端標(biāo)記四、原位末端標(biāo)記 原位末端標(biāo)記（原位末端標(biāo)記（ISEL)ISEL)是將滲入到凋亡細(xì)胞中的外源是將滲入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（性核苷酸在酶

41、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdTTdT）和）和DNADNA聚聚合酶合酶I I或或KIenowKIenow大片段的催化下與凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核大片段的催化下與凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核酸酶的激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷鏈相結(jié)合，再通過一酸酶的激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷鏈相結(jié)合，再通過一定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。通常有兩種方法定的顯示系統(tǒng)使之顯示出來。通常有兩種方法: :末端脫末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTPdUTP缺口末端標(biāo)記缺口末端標(biāo)記( (簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)稱TUNEL)TUNEL)；DNADNA聚合酶聚合酶I I或或KlenowKlenow大片段介導(dǎo)的原位缺口平移大片段介導(dǎo)的原位缺口平移( (簡(jiǎn)稱簡(jiǎn)

42、稱INST)INST)。在不考慮所使用的催化酶時(shí)，統(tǒng)稱為原位末端標(biāo)。在不考慮所使用的催化酶時(shí)，統(tǒng)稱為原位末端標(biāo)記。記。 TUNELTUNEL鑒定的原理基于細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生鑒定的原理基于細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生DNADNA斷鏈，所介導(dǎo)的酶是斷鏈，所介導(dǎo)的酶是TdTTdT，該酶能將外，該酶能將外源性的生物素或地高辛標(biāo)記的源性的生物素或地高辛標(biāo)記的dUTPdUTP無需無需DNADNA模板連接到凋亡細(xì)胞核的模板連接到凋亡細(xì)胞核的DNADNA斷鏈的斷鏈的3-3-羥基羥基(3-0H(3-0H末端，末端，DNADNA斷鏈可是單股斷鏈也可斷鏈可是單股斷鏈也可是雙股斷鏈，兩種斷鏈都有游離的是雙股斷鏈，兩種斷鏈都有游離的3-

43、3-羥基羥基末端，因此，末端，因此，TUNELTUNEL鑒定可以檢測(cè)凋亡細(xì)胞鑒定可以檢測(cè)凋亡細(xì)胞核中的單股和雙股核中的單股和雙股DNADNA斷鏈。斷鏈?！驹噭?zhǔn)備和配制】1. 0.15mol/L 的的PBS: 0.15mol/L NaCl， 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液；磷酸鹽緩沖液；2蛋白酶蛋白酶K 20g/ml， 0.15mol/L的的PBS配制；配制；3組織預(yù)處理液組織預(yù)處理液(2SSC溶液溶液):先配制先配制20SSC溶液作為儲(chǔ)存液，用時(shí)溶液作為儲(chǔ)存液，用時(shí)10倍稀釋倍稀釋(1SSC溶液含溶液含 0.3mol/L NaCl， 30mmol/L枸橡酸納枸橡酸納)；4內(nèi)源酶阻斷劑內(nèi)源酶阻

44、斷劑:3%H202-甲醇溶液（或甲醇溶液（或PBS）5緩沖液緩沖液A(buffer A250mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L MgC12， 10mmol/L -巰基乙醇，巰基乙醇， 0.005% BSA，pH 7.56鏈卵白素標(biāo)記的辣根過氧化物酶；鏈卵白素標(biāo)記的辣根過氧化物酶；7DAB-H202顯色液顯色液:DAB用用0.1mol/L Tris-Cl(pH7.6)配成配成0.4%，分裝一，分裝一20避光保存；避光保存；8TdT緩沖液緩沖液(pH6.8) 二甲胂酸納二甲胂酸納(Na-Cacodylate 100mmol/L二琉基蘇糖醇二琉基蘇糖醇(dithiothrenol 0.

45、1mmol/L氯化鉆氯化鉆(C00) 5mmol/L9TdT反應(yīng)液反應(yīng)液在在 T d T 緩 沖 液 中 加 入緩 沖 液 中 加 入 T d T 酶酶 1 0 0 U / m l ， 0.001mmol/L biotin-11-dUTP【染色步驟】1.切片常規(guī)脫蠟，復(fù)水，后續(xù)過程在濕盒內(nèi)進(jìn)行；切片常規(guī)脫蠟，復(fù)水，后續(xù)過程在濕盒內(nèi)進(jìn)行；2.3%的的H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶阻斷內(nèi)源性過氧化物酶30min；3.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；4.切片浸泡在切片浸泡在2SSC 80 20min；5.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；6.蛋白酶

46、蛋白酶K消化消化020min；7.0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；8.TdT緩沖液孵育緩沖液孵育 10min9. TdT反應(yīng)液反應(yīng)液37孵育孵育 1h；10.切片浸泡在切片浸泡在2SSC溶液溶液10min，以終止反應(yīng)；，以終止反應(yīng)；11. 0.15mol/L的的PBS洗洗3次次5min；12. 鏈卵臼素標(biāo)記的辣根過氧化物酶孵育鏈卵臼素標(biāo)記的辣根過氧化物酶孵育30min（POD）；）；13. 0.15mol/L的的PBS洗洗3次，每次次，每次5min；14.0.04%的的DAB顯色顯色510min，鏡下控制時(shí)間；，鏡下控制時(shí)間；15.蘇木精對(duì)比染色蘇木精對(duì)比染色10-

47、30sec，常規(guī)復(fù)水、透明，常規(guī)復(fù)水、透明和封固。和封固。 【結(jié)果判斷】 凋亡細(xì)胞的核呈棕色或棕褐色著染，細(xì)凋亡細(xì)胞的核呈棕色或棕褐色著染，細(xì)胞核形態(tài)呈碎點(diǎn)狀，不規(guī)整，大小不一致。胞核形態(tài)呈碎點(diǎn)狀，不規(guī)整，大小不一致。而正常非凋亡細(xì)胞和陰性對(duì)照片核被蘇木素而正常非凋亡細(xì)胞和陰性對(duì)照片核被蘇木素復(fù)染呈藍(lán)色，核相對(duì)較大，形態(tài)大小較為一復(fù)染呈藍(lán)色，核相對(duì)較大，形態(tài)大小較為一致致第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞凋亡的應(yīng)用細(xì)胞凋亡的應(yīng)用一細(xì)胞凋亡與機(jī)體發(fā)育一細(xì)胞凋亡與機(jī)體發(fā)育 細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞動(dòng)物生命活動(dòng)過程中不可細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞動(dòng)物生命活動(dòng)過程中不可缺少的組成內(nèi)容，是動(dòng)物借以存活的需要，因而缺少的組成內(nèi)容，是動(dòng)物借

48、以存活的需要，因而貫穿于動(dòng)物全部壽命周期中。無論是低等動(dòng)物還貫穿于動(dòng)物全部壽命周期中。無論是低等動(dòng)物還是高等動(dòng)物，都是如此。在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)生、是高等動(dòng)物，都是如此。在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)生、發(fā)育和成熟過程中，構(gòu)成組織的細(xì)胞生死交替，發(fā)育和成熟過程中，構(gòu)成組織的細(xì)胞生死交替，細(xì)胞凋亡是保證個(gè)體發(fā)育成熟所必需的。細(xì)胞凋亡是保證個(gè)體發(fā)育成熟所必需的。 二細(xì)胞凋亡與機(jī)體穩(wěn)態(tài)二細(xì)胞凋亡與機(jī)體穩(wěn)態(tài) 組成機(jī)體的細(xì)胞不但需要不斷地與環(huán)境進(jìn)行組成機(jī)體的細(xì)胞不但需要不斷地與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)、信息和能量的交換，而且這些細(xì)胞本身也物質(zhì)、信息和能量的交換，而且這些細(xì)胞本身也處在不斷的更新中。這種更新是以細(xì)胞數(shù)量上的處在不斷的更

49、新中。這種更新是以細(xì)胞數(shù)量上的恒定為前提的，因此是一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，顯然，恒定為前提的，因此是一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，顯然，各種細(xì)胞數(shù)量上穩(wěn)定，不但保證了機(jī)體各組織器各種細(xì)胞數(shù)量上穩(wěn)定，不但保證了機(jī)體各組織器官具有形態(tài)學(xué)上的穩(wěn)定性，同時(shí)也是機(jī)體生理功官具有形態(tài)學(xué)上的穩(wěn)定性，同時(shí)也是機(jī)體生理功能或內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的必要條件。沒有這種細(xì)胞生理能或內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的必要條件。沒有這種細(xì)胞生理性死亡，細(xì)胞更新就不可能發(fā)生，因此，細(xì)胞產(chǎn)性死亡，細(xì)胞更新就不可能發(fā)生，因此，細(xì)胞產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡之間的平衡是機(jī)體穩(wěn)態(tài)的基本條件，生與細(xì)胞凋亡之間的平衡是機(jī)體穩(wěn)態(tài)的基本條件，它們的平衡一旦破壞，就會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生它們的平衡一旦破壞，

50、就會(huì)導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生 三、三、 細(xì)胞凋亡與疾病細(xì)胞凋亡與疾?。ㄒ唬┘?xì)胞凋亡不足（一）細(xì)胞凋亡不足1. 腫瘤腫瘤發(fā)生機(jī)制：目前認(rèn)為：細(xì)胞增殖過度是腫瘤發(fā)病的一個(gè)途發(fā)生機(jī)制：目前認(rèn)為：細(xì)胞增殖過度是腫瘤發(fā)病的一個(gè)途徑，凋亡受抑、細(xì)胞死亡不足是腫瘤發(fā)病的另一途徑，結(jié)徑，凋亡受抑、細(xì)胞死亡不足是腫瘤發(fā)病的另一途徑，結(jié)果導(dǎo)致病變組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞存活延長(zhǎng)，存活大于死亡，腫果導(dǎo)致病變組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞存活延長(zhǎng)，存活大于死亡，腫瘤細(xì)胞數(shù)目?jī)粼鲩L(zhǎng)加大，形成新生物。瘤細(xì)胞數(shù)目?jī)粼鲩L(zhǎng)加大，形成新生物。凋亡受抑的依據(jù)：凋亡受抑的依據(jù)：多種腫瘤組織中多種腫瘤組織中Bcl-2表達(dá)顯著高于周圍組織表達(dá)顯著高于周圍組織許多腫瘤許多腫

51、瘤P53發(fā)生突變，突變型發(fā)生突變，突變型P53抑制細(xì)胞凋亡（肺抑制細(xì)胞凋亡（肺小細(xì)胞癌等）小細(xì)胞癌等） 近年腫瘤領(lǐng)域中凋亡的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：近年腫瘤領(lǐng)域中凋亡的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：腫瘤發(fā)生過程中凋亡的意義腫瘤發(fā)生過程中凋亡的意義:腫瘤發(fā)生過程中的凋亡腫瘤發(fā)生過程中的凋亡現(xiàn)象將有利于從細(xì)胞死亡角度考察腫瘤的形成。現(xiàn)象將有利于從細(xì)胞死亡角度考察腫瘤的形成。凋亡與細(xì)胞周期凋亡與細(xì)胞周期:細(xì)胞增殖與凋亡的關(guān)系是凋亡細(xì)胞細(xì)胞增殖與凋亡的關(guān)系是凋亡細(xì)胞離開了正常有絲分裂軌道離開了正常有絲分裂軌道,走向死亡。對(duì)于凋亡啟動(dòng)與走向死亡。對(duì)于凋亡啟動(dòng)與細(xì)胞周期時(shí)相的關(guān)系尚有不同的觀點(diǎn)細(xì)胞周期時(shí)

52、相的關(guān)系尚有不同的觀點(diǎn),一些作者以為一些作者以為, 凋凋亡只發(fā)生于亡只發(fā)生于G。/G1期期,而大部分作者認(rèn)為凋亡是多點(diǎn)啟而大部分作者認(rèn)為凋亡是多點(diǎn)啟動(dòng)的動(dòng)的,可源于細(xì)胞周期的任何時(shí)可源于細(xì)胞周期的任何時(shí)相。相。 凋亡與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo):信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明將對(duì)腫瘤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的闡明將對(duì)腫瘤的防治產(chǎn)生巨大影響。防治產(chǎn)生巨大影響。凋亡與腫瘤生長(zhǎng)凋亡與腫瘤生長(zhǎng): 凋亡與增殖是一對(duì)并存的矛盾凋亡與增殖是一對(duì)并存的矛盾,正常狀況是二者維持動(dòng)態(tài)平衡正常狀況是二者維持動(dòng)態(tài)平衡,癌前病變和腫瘤的增癌前病變和腫瘤的增生與凋亡失調(diào)有關(guān)生與凋亡失調(diào)有關(guān),此外此外,腫瘤誘導(dǎo)分化中的細(xì)胞凋腫瘤誘導(dǎo)分化中的細(xì)胞凋亡

53、、腫瘤治療中的細(xì)胞凋亡及腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的亡、腫瘤治療中的細(xì)胞凋亡及腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中的細(xì)胞凋亡亦是近年研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡亦是近年研究的熱點(diǎn)?？梢灶A(yù)見可以預(yù)見, 細(xì)胞凋亡的研究對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療細(xì)胞凋亡的研究對(duì)腫瘤的預(yù)防和治療,具具有重大的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。有重大的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。發(fā)生機(jī)制：從細(xì)胞凋亡角度看自身免疫病的發(fā)病發(fā)生機(jī)制：從細(xì)胞凋亡角度看自身免疫病的發(fā)病是由于細(xì)胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性是由于細(xì)胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性T細(xì)胞所致。細(xì)胞所致。依據(jù)：糖皮質(zhì)激素能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，為治療依據(jù)：糖皮質(zhì)激素能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，為治療自身免疫病的有效藥物之一。自身免疫病的

54、有效藥物之一。2. 自身免疫病自身免疫病(二二) 細(xì)胞凋亡過度細(xì)胞凋亡過度1. 心血管疾病心血管疾病(1) 心肌缺血與心肌缺血心肌缺血與心肌缺血-再灌注損傷再灌注損傷目前認(rèn)為：心肌缺血與心肌缺血目前認(rèn)為：心肌缺血與心肌缺血-再灌注損傷造成的心肌再灌注損傷造成的心肌細(xì)胞損傷不但有壞死，也有細(xì)胞凋亡（干預(yù)靶點(diǎn)）。細(xì)胞損傷不但有壞死，也有細(xì)胞凋亡（干預(yù)靶點(diǎn)）。細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)：細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)：缺血早期以細(xì)胞凋亡為主，晚期以細(xì)胞壞死為主缺血早期以細(xì)胞凋亡為主，晚期以細(xì)胞壞死為主梗死灶中央通常以壞死為主，周邊部分以細(xì)胞凋亡為主梗死灶中央通常以壞死為主，周邊部分以細(xì)胞凋亡為主輕度缺血以細(xì)胞凋亡為主，重度缺血通常以壞死為主輕度缺血以細(xì)胞凋亡為主，重度缺血通常以壞死為主在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，缺血在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，缺血-再灌注損傷時(shí)發(fā)生的細(xì)胞再灌注損傷時(shí)發(fā)生的細(xì)胞凋亡比同時(shí)間的單純?nèi)毖鼑?yán)重凋亡比同時(shí)間的單純?nèi)毖鼑?yán)重急性、嚴(yán)重的心肌缺血以壞死為主，慢性、輕度的心急性、嚴(yán)重的心肌缺血以壞死為主，慢性、輕度的心肌缺血以細(xì)胞凋亡為主肌缺血以細(xì)胞凋亡為主細(xì)胞凋亡的機(jī)制：細(xì)胞凋亡的機(jī)制：氧化應(yīng)激有關(guān)（氧化應(yīng)激有關(guān)（SOD可減少細(xì)胞凋亡）可減少細(xì)胞凋亡）Fas上調(diào)通