1、細(xì)胞穿膜肽的研究進(jìn)展摘要：細(xì)胞穿膜肽(CPP)是具有穿透多種細(xì)胞膜功能的小分子多肽，能攜帶生物活性大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。由于CPP缺乏組織選擇性和靶向性，限制了其在月中瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一些具有細(xì)胞穿透功能的短肽(少于30個(gè)氨基酸)即細(xì)胞穿膜肽(CPPS，能夠有效地將蛋白質(zhì)、多肽、核酸片段等以多種方式導(dǎo)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，具轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不會(huì)造成細(xì)胞損傷。CPPs的發(fā)現(xiàn)為生物大分子在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)以及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域等均具有良好的應(yīng)用前景。本文就CPPs的種類(lèi)特點(diǎn)、內(nèi)化機(jī)制、應(yīng)用及其存在的問(wèn)題進(jìn)行討論和評(píng)述。關(guān)鍵詞：細(xì)胞穿膜肽；靶向性；穿膜機(jī)制1細(xì)

2、胞穿膜肽的性質(zhì)、分類(lèi)到目前為止，已發(fā)現(xiàn)了多種CPPs,它們共有的性質(zhì)：具有凈正電荷性和兩親性；穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率高；可以導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞；可以攜帶多種活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞；可以通過(guò)固相合成或原核表達(dá)制備，方法成熟簡(jiǎn)便。CPPs的分類(lèi)以及統(tǒng)一的術(shù)語(yǔ)還沒(méi)有。根據(jù)不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，得到不同的種類(lèi)。最近有學(xué)者根據(jù)短肽的特點(diǎn)和來(lái)源將其分為3大類(lèi):蛋白衍生肽(proteinderivedCPPs),如penetratin、TAT和pVEG;模型肽(modelpeptides)如MAPF0(Arg)7等；設(shè)計(jì)肽(designedCPPs)如MPG0Transportan等。從其兩親性性質(zhì)也可將其分為3類(lèi)：兩親性CPP

3、s(PaCPPs),如MPGtransportan、TP10Pep-1;中等兩親性CPPs(SaCPPs),如penetratin,RL16;非兩親性CPPs(NaCPPs),如R9。2細(xì)胞穿膜肽的穿膜機(jī)制盡管細(xì)胞穿膜肽已經(jīng)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，但其穿膜機(jī)制目前仍暫無(wú)定論，且存在很大爭(zhēng)論因此，弄清細(xì)胞穿膜肽的內(nèi)化機(jī)制，是將其作為藥物載體應(yīng)用于臨床研究前需要解決的首要問(wèn)題目前，對(duì)于CPPs穿膜機(jī)制的描述主要有以下2種。第一，通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞這方面研究多是通過(guò)熒光標(biāo)記并使用胞吞作用抑制劑的方法，通過(guò)對(duì)比胞吞作用抑制劑使用與否對(duì)CPPs及其底物入胞作用的影響，來(lái)評(píng)價(jià)CPPs的入胞機(jī)制。第二，通過(guò)

4、靜電作用與細(xì)胞膜相結(jié)合并誘導(dǎo)膜脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生短暫的孔隙而直接滲透進(jìn)入細(xì)胞由于目前所研究的細(xì)胞穿膜肽多以陽(yáng)離子CPPs為主,如HIVTat,寡聚精氨酸等因此，有人提出，細(xì)胞穿膜肽的穿膜機(jī)制可能與其電荷特性有關(guān)，而人體組織細(xì)胞表面為負(fù)電荷特性，也為陽(yáng)離子CPPs與之吸附及發(fā)生穿透作用提供了理論依據(jù)Herce等認(rèn)為細(xì)胞穿膜肽的陽(yáng)離子特性不僅使CPPsW易于與細(xì)胞膜表面的結(jié)合，還能夠誘導(dǎo)膜雙分子層的失穩(wěn)并產(chǎn)生短暫孔隙Herce等進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定脂質(zhì)雙分子層的電子流向證實(shí)了這種假設(shè)，并認(rèn)為精氨酸殘基在陽(yáng)離子CPPs誘導(dǎo)的穿膜作用中扮演重要角色。3細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用近年來(lái)，細(xì)胞穿膜肽作為分子載體應(yīng)用于體

5、內(nèi)外入胞轉(zhuǎn)運(yùn)的研究越來(lái)越多與其他生物大分子轉(zhuǎn)運(yùn)方法相比，細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的入胞作用具有很多優(yōu)勢(shì)首先，細(xì)胞穿膜肽能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)具有不同分子量和天然性質(zhì)的大分子進(jìn)入細(xì)胞；其次，細(xì)胞穿膜肽毒性相對(duì)較?。辉俅?，細(xì)胞穿膜肽的非特異性穿膜作用使其應(yīng)用更廣泛；最后，細(xì)胞穿膜肽不僅可以應(yīng)用于注射給藥，還可以用于鼻黏膜給藥口服給藥細(xì)胞穿膜肽可以運(yùn)輸多種物質(zhì)到哺乳動(dòng)物的的多種細(xì)胞中，包括：小分子核酸，多肽，蛋白，質(zhì)粒DNA寡聚核甘酸，脂質(zhì)體及其他一些納米藥物載體等。這些應(yīng)用為疾病診斷和治療提供了一種新方法，大大推進(jìn)了分子生物學(xué)、藥學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、疫苗學(xué)、甚至影像學(xué)的發(fā)展。近年CPPs的應(yīng)用進(jìn)展如下：3.1 蛋白質(zhì)及多

6、肽類(lèi)藥物的運(yùn)輸對(duì)許多疾病使用外源蛋白質(zhì)或多肽類(lèi)藥物是一個(gè)非常有價(jià)值的治療方法。Wu等利用穿膜肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能來(lái)介導(dǎo)信號(hào)肽-綠色熒光蛋白-穿膜肽NT4-GFP-Ant融合蛋白通過(guò)細(xì)胞膜和血腦屏障到達(dá)靶細(xì)胞。Tat(Tat48-60)能將細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑的細(xì)胞毒素肽模擬物P21EAF1/CIP1運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)，且研究發(fā)現(xiàn)Tat48-60-P10可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhang等1根據(jù)一種a螺旋肽CAI的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出了一種細(xì)胞穿膜肽NYAD-1它比CAI具有更穩(wěn)定的a螺旋結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)，NYAD-1能夠穿過(guò)細(xì)胞膜并與Gag聚蛋白共定位于質(zhì)膜上,破壞病毒顆粒的自組裝。研究者2設(shè)計(jì)了一種含有穿膜肽、

7、彈性蛋白類(lèi)似多肽ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)和一種衍生于細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑P21的結(jié)合多肽,這種多肽能夠使SKOV-3卵巢癌細(xì)胞和HeLa子宮癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速率減慢而抑制它們的增殖。HIV-Tat與小泰勒蟲(chóng)抗原Tp2結(jié)合形成重組Tat-Tp2融合蛋白，發(fā)現(xiàn)其能夠加強(qiáng)遲鈍的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的興奮性。3.2 核酸類(lèi)藥物的運(yùn)輸核酸類(lèi)藥物的細(xì)胞運(yùn)輸具有挑戰(zhàn)性。最近有關(guān)使用CPPs進(jìn)行核酸細(xì)胞運(yùn)輸?shù)睦虞^多。研究證明，細(xì)胞膜穿透性寡肽一一八聚精氨酸（R8）修飾的脂質(zhì)體可以有效輸送siRNA進(jìn)入細(xì)胞并增強(qiáng)其生物學(xué)功能。Palm-Apergi等冏研究一種細(xì)胞穿膜肽MAP,用這種典

8、型的抗菌肽處理細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌空殼,這種空可以載入所需的DNA或質(zhì)粒并將其運(yùn)輸進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，還可以用于預(yù)防接種。Meade等冏研究認(rèn)為，CPPs為雙鏈siRNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化去誘導(dǎo)RNAi反應(yīng)提供了一種好方法。Veldhoen等34研究發(fā)現(xiàn)一種新的載體肽MPGx能同時(shí)與核酸形成非共價(jià)連接的、具有高靈活性的復(fù)合物，它可以作為運(yùn)輸siRNA的載體。與轉(zhuǎn)座子結(jié)合的“睡美人”轉(zhuǎn)座酶能將特殊基因轉(zhuǎn)移進(jìn)目標(biāo)動(dòng)物體內(nèi)。這些特殊基因有助于治療多種疾病。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜肽M918可以完成“睡美人”轉(zhuǎn)座酶和一個(gè)外源轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒（帶有一種抗生素基因）在體外的細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)導(dǎo)運(yùn)輸。具有空間位阻的帶電荷中性寡核甘酸類(lèi)似物，

9、如肽核酸（PNA）和磷酰二胺嗎咻代寡核甘酸（PMO）,在反義引物的應(yīng)用方面具有很好的生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)。然而，寡聚核酸在細(xì)胞內(nèi)不能自由運(yùn)輸，因此，Lebleu等研究了兩種富含精氨酸的CPPs（R-Ahx-R）4AhxB（R=精氨酸，Ahx=胺己苯酸酯，B=0-丙氨酸）和R6Pen,它們能夠在胞內(nèi)體溶解劑存在的情況下，在低摩爾濃度下將PNA和PMO進(jìn)行有效的核運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn)，固相合成穿膜肽Tat能夠攜帶質(zhì)粒DNA穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，并對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響703.3 小分子藥物運(yùn)輸研究表明，富含精氨酸的細(xì)胞穿膜肽可以直接運(yùn)輸磷酸二酰胺嗎咻齊聚物進(jìn)入鼠類(lèi)白細(xì)胞，抑制其基因表達(dá)和改變前體mRNA勺

10、剪接網(wǎng)。Lindgren等43設(shè)計(jì)了一種CPP與細(xì)胞抑制劑甲氨蝶吟（MTX）的結(jié)合物，用于克服乳腺癌月中瘤細(xì)胞對(duì)甲氨蝶吟的耐受。將2',5'-寡腺花酸四聚物（2-5A）與短鏈HIV-1Tat肽用化學(xué)方法結(jié)合產(chǎn)生2-5A-Tat嵌合體網(wǎng)，此嵌合體可以被細(xì)胞吸收并能在完整的細(xì)胞中活化核糖核酸酶L,它可能為HIV的RNA在體內(nèi)的靶向破壞提供了一種方法。3.4 增強(qiáng)藥物的吸收及其他特殊功能Kamei等10發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用CPPs可以促進(jìn)胰島素的腸內(nèi)吸收。Khafagy等11研究發(fā)現(xiàn)L-型穿膜肽penetratin可以顯著增加胰島素的滲透性而使其穿過(guò)鼻膜，并對(duì)鼻吸收黏膜上的細(xì)胞完整性不會(huì)引起

11、明顯的破壞。Tunnemann等12研究認(rèn)為細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)導(dǎo)作用不僅是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+無(wú)副作用情況下可以增加心肌功能的唯一方法，而且是一般細(xì)胞或干細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)和控制的非常有用的工具。Kloss等13研究發(fā)現(xiàn)，含有410個(gè)精氨酸殘基的寡聚精氨酸，特別是（Arg）8能夠抑制細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白水解系統(tǒng)。當(dāng)考慮寡聚精氨酸作為藥物的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸載體時(shí)，必須考慮其對(duì)蛋白酶的制活性問(wèn)題。有研究報(bào)道，成功設(shè)計(jì)的一種新的穿膜肽Pep-1-K（衍生于穿膜肽Pep-1）具有強(qiáng)的抗菌活性，可以作為細(xì)菌選擇性抗菌肽1Johansson等50研究發(fā)現(xiàn)了一種含有22個(gè)氨基酸殘基的衍生于月中瘤抑制基因

12、P14ARF勺N端部分的肽ARF（1-22）,它是一種具有P14ARF功能的類(lèi)似物，對(duì)細(xì)胞膜有穿透性，膜破壞性低且能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以前研究認(rèn)為大多數(shù)CPPs可以易位穿過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜,而不能穿過(guò)像酵母細(xì)胞的細(xì)胞膜。然而，Parenteau等15對(duì)20種CPPs®行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)有一種肽Tp10能有效的穿過(guò)裂殖酵母細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)均勻分布。由于治療分子不能穿過(guò)質(zhì)膜,基因和藥物運(yùn)輸進(jìn)入眼部組織，例如視網(wǎng)膜和角膜被阻礙，Johnson等16研究發(fā)現(xiàn)了一種能用于眼部組織運(yùn)輸?shù)男码腜OD,能夠運(yùn)輸小分子和大分子藥物進(jìn)入神經(jīng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞等。如果能夠通過(guò)高分辨率成像技術(shù)追蹤干細(xì)胞的分

13、布和分化的能力，對(duì)臨床和研究非常重要。Liu等17用一種典型的CPP承載銳顆粒，此顆?？梢杂糜诠撬栝g質(zhì)干細(xì)胞的磁共振成像。熒光成像技術(shù)確定此復(fù)合物可以?xún)?nèi)化進(jìn)入干細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi)，毒性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析表示此復(fù)合物不會(huì)影響細(xì)胞的生存和膜電勢(shì)梯度。關(guān)于CPPs的氨基酸序列見(jiàn)表1。lahk1Sequencesofcel-pcncrratingpcprides(CPPs)mentionedaboveCPPSequenceTa產(chǎn)toTac-PioCAIGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQRQTSMTDFM1SKRRLIFSITFEDLLDYYGP-NlbnNYAD-1H1V-TATITFX

14、DLLXYYGP-NHiRKKRRQRRRRgArgiJMAPRRRRRRRRKLALKLALKALKAALKLA-NH：MPGM918AcGALFLAFLAAALSCMGLWSQPKKKRKV-Cya*MVTVLFRRLRIRRACGPPRrRV-;penetratinPep-J-KARF(l-22)RRRRRRRQIKIWFQXRRMKWKKRQfKIWFQXRRMKWKKKKT*RKTWWTKW0QPKKKRKVMVRRFLXTLRJRRACGPPRVRV-NII：TpIOPODAGYLLGKINLKALAALAKKIL-NII：GGGlARKKAAKA'Ac-acciyLCya

15、:Cysteamine表1CPPs的氨基酸序列4細(xì)胞穿膜肽在應(yīng)用中的不足CPP缺乏組織選擇性和月中瘤靶向性,單純憑借CPP無(wú)法使抗月中瘤藥物定向積，使作用于月中瘤部位的藥物濃度減少，對(duì)正常組織的損傷性增大。同時(shí)CPP的正電性易與血漿中荷負(fù)電的成分發(fā)生相互作用，從而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速清除，導(dǎo)致CPP在體內(nèi)不穩(wěn)定，極大地限制了其在月中瘤治療中的應(yīng)用18。因此，提高CPP的月中瘤靶向性是將其應(yīng)用于月中瘤治療領(lǐng)域的關(guān)鍵。CPPs在藥物運(yùn)輸過(guò)程中的使用存在的另外一個(gè)弊端是其穩(wěn)定性差。CPPs內(nèi)化后，由于體內(nèi)含有各種蛋白酶，它可能會(huì)酶解外源CPPs及其藥物分子；體內(nèi)的環(huán)境包括pH值、離子濃度等都有可能改變

16、CPPs的某些性質(zhì)使其失去活性。因此，必須通過(guò)尋找新的穩(wěn)定的CPPs58或?qū)ΜF(xiàn)有的CPPs進(jìn)行修飾改進(jìn)來(lái)解決這方面的問(wèn)題。一些蛋白在內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后不再具有生物活性，可以考慮在蛋白和CPPs之間插入一個(gè)連接分子來(lái)輔助在細(xì)胞內(nèi)釋放有活性的蛋白和藥物外，CPPs是否有免疫原性或半免疫原性及長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生何種影響要將CPPs序列進(jìn)一步的優(yōu)化以提高其適用性19。一些證據(jù)顯示,CPPs可以與任意白分子結(jié)合,非靶向性進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致生物活性藥物不必要的損失。因此，如果不能建立可行性使用方法以促進(jìn)細(xì)胞特異性運(yùn)輸，將限制細(xì)胞穿膜肽在機(jī)體內(nèi)運(yùn)輸藥物等方面的應(yīng)用。目前，在能夠有效利用CPPs運(yùn)輸藥物以充分發(fā)揮

17、治療作用方面有價(jià)值的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果還鮮見(jiàn)報(bào)道。這種載藥方式在應(yīng)用中是否存在潛在的細(xì)胞毒性以及運(yùn)輸過(guò)程中缺乏細(xì)胞特異性等問(wèn)題尚未引起足夠的的重視20。一些CPPs存在細(xì)胞內(nèi)化差，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)代謝性降解及一些不良的生物效應(yīng)如毒性和免疫原性等。需要進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)CPPs的藥代動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)分布等相關(guān)研究。5展望CPPs的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來(lái)了曙光，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、評(píng)價(jià)及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。隨著研究深入，越來(lái)越多的CPPs及其類(lèi)似物將被發(fā)現(xiàn)和構(gòu)建，而作為研究基礎(chǔ)的對(duì)CPPs的基本序列及穿膜機(jī)制的探討尤顯重要，特別是新的研究方法和研究手段的建立與驗(yàn)證ACP

18、Ps作為一種新型載體應(yīng)用于靶向制劑，能夠顯著提高藥物的生物利用度，將逐漸成為CPPs領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)筆者認(rèn)為，隨著研究的深入，構(gòu)建能夠被病變部位或細(xì)胞特異性識(shí)別并打開(kāi)的連接鍵，或進(jìn)一步提高CPPs融合多肽對(duì)靶組織微環(huán)境的敏感性。參考文獻(xiàn)：I ZAROJL,SHENWC.QuantitativecomparisonofmembranetransductionandendocytosisofoligopeptidesJ.BiochemBiophyResComm,2013,307(2):241-247.2WENDERPA,ROTHBARDJB,JESSOPTC,etal.Oligocarbamatem

19、oleculartransporters:Design,synthesis,andbiologicalevaluationofanewclassoftransportersfordrugdeliveryJ.JAmeChemSoc,2002,124(45):13382-13383.3 FUTAKIS,NAKASEI,SUZUKIT,etal.Translocationofbranched-chainargininepeptidesthroughcellmembranes:Flexibilityinthespatialdispositionofpositivechargesinmembranepe

20、rmeablepeptidesJ.Biochemistry,2012,41(25):7925-7930.4 FUTAKIS,SUZUKIT,OHASHIW,etal.Arginine-richpeptides.Anabundantsourceofmembrane-permeablepeptideshavingpotentialascarriersforintracellularproteindeliveryJ.JBiolChem,2011,276:5836-5840.5 WENDERPA,MITCHELLDJ,PATTABIRAMANK,etal.Thedesign,synthesis,and

21、evaluationofmoleculesthatenableorenhancecellularuptake:peptoidmoleculartransportersJ .ProcNatlAcadSciUSA,2006,97(24):13003-13008.6MITCHELLDJ,KIMDT,STEINMANL,etal.PolyarginineenterscellsmoreefficientlythanotherpolycationichomopolymersJ.JPeptideRes,2007,56(5):318-325.7GUOQG,ZHAOGJ,HAOFJ,etal.Effectsof

22、theTATpeptideorientationandrelativelocationontheproteintransductionefficiencyJ.ChemicalBiology&DrugDesign,dio:10.1111/j.1747-0285.2011.01315.x.8 DeshayesS,PlenatT,CharnetP,etal.Formationoftransmembraneionicchannelsofprimaryamphipathiccellpenetratingpeptides.Consequencesonthemechanismofcellpenetr

23、ationJ.BiochimBiophysActa,2006,1758:1846-1851.9 ShengJW,OylerG,ZhouB,etal.Identificationandcharacterizationofanovelcell-penetratingpeptideJ.BiochemBiophysResCommun,2009,382:236-240.10 PatelLN,ZaroJL,ShenWC.Cellpenetratingpeptides:intracellularpathwaysandpharmaceuticalperspectivesJ.PharmRes,2007,24:1

24、977-1992.11 ZhangLX,ZhangSX.Mechanismofcell-penetratingpeptides-mediatedinternalizationanditsapplicationJ.ChinJBiochemMolBiol,2008,24:1092-1096.12 ChenQ,LiuYW,HuangS,etal.Advancesinmechanismsofinternalizationofcell-penetratingpeptidesJ.IntJPatholClinMed,2009,29:115-120.13PujalsS,GiraltE.Proline-rich,amphipathiccell-penetratingpeptidesJ.AdvDrugDelivRev,2008,60:473-484.14 QiaoYP,RenL,WangL,etal.TatpeptideenterbonemarrowstemcellsthroughalipidraftmacropinocytosisJ.JXiamenniv,2008,47:235-239.15 El-AndaloussiS,JohanssonHJ,HolmT,etal.Anovelcellpenetratingpeptide,M91