1、血液血液MICM診斷診斷白血病的診斷分型白血病的診斷分型MICMMICM FAB形態(tài)學(xué)診斷(Morphology) 免疫學(xué)檢查(Immunology ) 細胞遺傳學(xué)檢查(Cytogenetics) 分子遺傳學(xué)檢查(Molecular)檢測方法檢測方法 病史 形態(tài)學(xué)： 結(jié)構(gòu)：活檢 細胞學(xué)：涂片 骨髓血凝塊 免疫分型：流式細胞或免疫組化 細胞遺傳學(xué)：核型分析、FISH 分子遺傳學(xué)：融合基因（RT-PCRQ-PCR)/基因突變（測序）白血病白血病MICM診斷程序及技術(shù)診斷程序及技術(shù)白血病診斷的任務(wù)白血病診斷的任務(wù)不僅僅是不僅僅是FAB分類分類 是不是白血?。?急性？慢性？ 系來源 FAB分類 預(yù)后分

2、層 治療、療效判斷 MRD 病史病史+形態(tài)形態(tài)形態(tài)形態(tài)+免疫免疫形態(tài)形態(tài)+免疫免疫+遺傳遺傳+分子分子形態(tài)形態(tài)+免疫免疫+遺傳遺傳+分子分子為什么需要為什么需要MICM綜合診斷？綜合診斷？ 形態(tài)或病理或加細胞化學(xué)分析受觀察者個體經(jīng)驗及分辨力的限制，一致率僅50-70%； 在此基礎(chǔ)上增加免疫組化和/或FCM分析大大增加了分型的準確率，可達90%以上； 染色體、FISH及基因分析，進一步提高分型的準確率 MICM整合診斷的臨床意義整合診斷的臨床意義 全面正確診斷與分型 評估預(yù)后 確立檢測MRD的標(biāo)志，追蹤MRD 幫助建立分層、個性化的治療 定期追蹤幫助發(fā)現(xiàn)抗原丟失、克隆演變或突變 幫助確定病因或發(fā)

3、病機制MICM整合報告整合報告形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué) 是診斷的基礎(chǔ)，任何淋巴造血系統(tǒng)增生性疾病是診斷的基礎(chǔ)，任何淋巴造血系統(tǒng)增生性疾病的診斷都離不開形態(tài)學(xué)診斷。形態(tài)學(xué)診斷技術(shù)的診斷都離不開形態(tài)學(xué)診斷。形態(tài)學(xué)診斷技術(shù)包括包括細胞學(xué)：外周血、骨髓涂片，淋巴組織穿刺細胞學(xué)：外周血、骨髓涂片，淋巴組織穿刺組織學(xué)：骨髓活檢、淋巴組織活檢組織學(xué)：骨髓活檢、淋巴組織活檢 骨髓活檢和骨髓/血涂片骨髓涂片細胞細微結(jié)構(gòu)清楚評估紅系、粒系增生情況及幼稚細胞比例具有優(yōu)勢骨髓纖維化、細胞致密可干抽可做組織化學(xué)染色（如鐵染）對缺鐵性貧血、慢性疾病引起的貧血、巨幼細胞性貧血、和急性白血病的診斷尤其有幫助。骨髓活檢顯示骨髓的組織結(jié)構(gòu)和

4、各成分的分布及相互關(guān)系，對巨核細胞的評估具有優(yōu)勢不存在干抽和骨髓稀釋可做免疫組織化學(xué)染色對再生障礙性貧血、低增生性白血病、淋巴瘤、轉(zhuǎn)移癌、骨髓增生性腫瘤的診斷具有重要價值 血凝塊：廢物利用、骨髓活檢的補充 注明病史骨髓涂片看細胞、骨髓活檢看結(jié)構(gòu)，骨髓涂片看細胞、骨髓活檢看結(jié)構(gòu)，相互補充相互驗證不能相互替代不能相互替代骨髓/血涂片骨髓活檢1.骨髓活檢+3項特染2.骨髓涂片+組織化學(xué)染色（3）3.免疫組織化學(xué)染色4-10項4.血塊骨髓活檢可根據(jù)個性化病理診斷需要加做免疫組織化學(xué)染色！骨髓活檢可根據(jù)個性化病理診斷需要加做免疫組織化學(xué)染色！免疫組化免疫組化長度長度 1.5cm1.5cm達標(biāo)（達標(biāo)（1c

5、m1cm尚可）尚可）長度長度 1cm1cm不達標(biāo)不達標(biāo)長度長度 0.5cm0.5cm可能存在診斷不全面可能存在診斷不全面（不包括皮膚、肌肉、軟骨、血塊等）（不包括皮膚、肌肉、軟骨、血塊等）附附2 2張合格的骨髓涂片（晾干后再包裝）張合格的骨髓涂片（晾干后再包裝）血塊分開固定（收費按小標(biāo)本病理收費）血塊分開固定（收費按小標(biāo)本病理收費）注意：取材部位是否有病灶 保存液使用福爾馬林固定骨髓活檢標(biāo)本長度要求骨髓活檢標(biāo)本長度要求取材的限制骨髓增生不均勻(與血象不符)取材過少取材表淺組織擠壓活檢增生低下活檢增生低下,涂片增生活躍涂片增生活躍 骨髓增生不均勻 取材較少,表淺活檢增生活躍活檢增生活躍,涂片增生

6、低下涂片增生低下 骨髓增生不均勻 涂片稀釋骨髓活檢與骨髓涂片細胞增生不一致骨髓活檢與骨髓涂片細胞增生不一致流式細胞術(shù)流式細胞術(shù) 流式細胞免疫分型的作用流式細胞免疫分型的作用確定系來源確定系來源 原理：不同系有特定的抗原表達 髓系/B系/T/NK系/組織細胞和樹突狀細胞確定細胞分化階段確定細胞分化階段 不同發(fā)育階段細胞，其抗原表達不同預(yù)后判斷預(yù)后判斷 有些抗原表達和淋巴瘤/白血病預(yù)后相關(guān)治療方法選擇治療方法選擇-治療靶向治療靶向療效判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測療效判斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測 M0 CD34,CD33,CD13 M1 MPO,CD34,CD33,CD13, HLA-DR M2 MPO,CD34,CD15,C

7、D13, HLA-DR M3 MPO, CD33,CD13、CD9(HLA-DR、CD11b常陰性) M4 MPO,CD33,CD15,CD14,CD13 M5 CD68,CD33,CD14,CD13,HLA-DR,CD36，CD64 M6 CD33,CD235a,CD71 M7 CD33,CD41,CD42b,CD61急性髓系白血病免疫表型與急性髓系白血病免疫表型與FABFAB分型相關(guān)性分型相關(guān)性形態(tài)與免疫表型的符合性不足80%，不能脫離形態(tài)學(xué)單純依賴免疫表型進行白血病的診斷與分型。FAB基于形態(tài)，兩者不符以形態(tài)為主。MRD流式細胞檢測流式細胞檢測 腫瘤細胞與正常起源細胞免疫表型不同 跨系表

8、達 抗原表達不同步 抗原表達丟失 抗原表達減弱 其它抗原表達 初始免疫分型結(jié)果、白血病相關(guān)表型特點 抗體組合越多覆蓋率越高、敏感性越高 假陽性、假陰性均存在 隨訪、動態(tài)觀察更有意義流式檢測標(biāo)本要求流式檢測標(biāo)本要求抗凝骨髓/外周血附2張合格的骨髓涂片（晾干再包裝） 完整的病史 MRD需要初次分型資料 組套12、18、24、30、36遺傳學(xué)診斷技術(shù)遺傳學(xué)診斷技術(shù) 細胞遺傳學(xué)： 核型分析：全基因檢測、覆蓋面廣、敏感性差 FISH：針對性強、敏感性高、周期短、覆蓋率低 分子遺傳學(xué)： 融合基因（RT-PCRQ-PCR)：針對性強、敏感性高 基因突變（測序、PCR）：覆蓋面較大、敏感性較低 染色體異常 包

9、括染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量異常 根據(jù)這些特征性的異常，對惡性血液病進行診斷和分類 細胞遺傳學(xué)細胞遺傳學(xué)急性白血病急性白血病染色體檢測的臨床意義染色體檢測的臨床意義 染色體畸變可以作為急性白血病緩解和復(fù)發(fā)重要參考，最初治療后異常核型可以消失提示CR，之后重新出現(xiàn)提示白血病復(fù)發(fā)，有新的核型出現(xiàn)，表明有進展 可以作為標(biāo)志來驗證骨髓移植成功與否 最初診斷的核型是急性白血病預(yù)后最有價值指標(biāo)預(yù)后等級核型類型AMLALL好t(8;21)、 t(15;17)、inv(16)t(12;21)、染色體數(shù)目50條的超二倍體、dic(9;12)(p11;p12)中正常、+8、+21、+22、11q23異常、del(9q)、

10、del(7q)正常、47-50的超二倍體、t(11;14)差-5、del(5q)、-7、3q異常、復(fù)雜異常亞二倍體、近單倍體、t(9;22)、t(4;11)、t(1;19)、t(8;14)急性白血病核型的預(yù)后分級急性白血病核型的預(yù)后分級染色體檢測常見問題染色體檢測常見問題 標(biāo)本取材量不足：檢測最低白細胞數(shù)為10的6次方個細胞 培養(yǎng)后無分裂相或分裂相少于15個：標(biāo)本白細胞量低，患者正在進行化療 結(jié)果臨床不符：分子檢測陽性而染色體陰性（染色體分辨率低） 融合基因融合基因BCR/ABL(P210)-CML/ALLBCR/ABL(P230)-CMLBCR/ABL (P190)-ALLPML/RARa-

11、M3AML/ETO-M2CBF/MYH11X-M4EOMLL重排-M5FLP1L1-PDGFR-嗜酸細胞增多癥 基因突變基因突變JAK-2 V617F /539-543突變MPL 外顯子10突變分子遺傳學(xué)分子遺傳學(xué)-血液病類型確診的分子標(biāo)志血液病類型確診的分子標(biāo)志融合基因篩查融合基因篩查 適用患者 本篩查項目主要用于篩查ALL、AML、CML、AMMOL、CMML、MDS等血液病病種可能出現(xiàn)的31種融合基因或癌基因，及其融合基因的110余種剪切變異情況。適合無法確定融合基因類別的初診患者初診患者，便于醫(yī)生對血液病患者進行分子標(biāo)志物的確定，并進行后續(xù)微小殘留病灶的監(jiān)控。 本項目建議配合染色體核型

12、分析一起檢測，以免由于染色體數(shù)目異常或攜帶少見融合基因而造成漏診。 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院對于初診蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院對于初診ALL,AMLALL,AML患者都建議做患者都建議做此項目此項目不同疾病篩查項目不同疾病篩查項目ALL融合基因篩查（18種）AML融合基因篩查（23種）APL融合基因篩查 繼t(15;17)之后，又先后發(fā)現(xiàn)4種M3特異的累及RAR的變異性染色體易位：分別產(chǎn)生PLZF-RAR，NPM-RAR，NuMA-RAR和STAT5b-RAR融合基因。 臨床上，具有PLZF-RAR或STAT5b-RAR融合基因患者對ATRA治療不敏感，其余三種染色體易位患者經(jīng)ATRA治療可獲完全緩解。

13、MLL融合基因篩查JAK2 基因突變基因突變 已列入WHO2008 MPNs的診斷標(biāo)準 V617F見于90%以上的PV，約50%的ET、PMF 在PV中，少部分患者為JAK2 Exon12或其它突變 建議JAK2基因突變篩查檢測以下幾種 V617F; K539L; N542-E543del; E543-D544delMPL基因突變檢測基因突變檢測 MPL和MPN MPN中以JAK2 V617F最為常見，PV、ET、PMF中的突變頻率分別為96%、55%、65%。 MPL突變主要見于ET和PMF，頻率分別為2-5%和5-10%。 MPL可用于JAK V617F陰性的ET和PMF患者的診斷。檢測目

14、的檢測目的用于JAK2 V617F陰性的ET和PMF患者的診斷。 臨床考慮ET或PMF的患者可以組合檢測 融合基因融合基因BCR-ABL P210JAK2 V617F基因突變基因突變MPL基因突變基因突變基因陽性率臨床意義預(yù)后與其他遺傳異常相關(guān)性KIT5%預(yù)后因素差t(8;21)inv(16)/t(16;16)FLT320-40%預(yù)后因素差-NPM130%（核型正常）對疾病進行臨時性的定義良好 （如果沒有FLT3突變）M4, M5CD34 -CEBPA10%對疾病進行臨時性的定義良好M1，M2CD7+WHO 2008 新界定的突變新界定的突變AML預(yù)后基因突變6項 CEBPA基因TAD1區(qū)突變

15、檢測 CEBPA基因TAD2區(qū)突變檢測 CEBPA基因bZIP區(qū)突變檢測 C-kit17號外顯子 FLT3-ITD基因突變檢測 NPM1基因突變檢測報告時間：12個工作日價格：1800元AML預(yù)后基因突變9項 CEBPA基因TAD1區(qū)突變檢測 CEBPA基因TAD2區(qū)突變檢測 CEBPA基因bZIP區(qū)突變檢測 C-kit（8號外顯子和17號外顯子） FLT3-ITD基因突變檢測 FLT3基因592位點突變檢測 FLT3基因835位點突變檢測 NPM1基因突變檢測 報告時間：12個工作日價格：2700元 TCR和和IgH重排項目重排項目 有5-10%的患者無法通過常規(guī)方法辨別其淋巴系統(tǒng)的增生是惡

16、性增生還是反應(yīng)性增生。 正常淋巴細胞在成熟過程中重排是多克隆性的，但惡性腫瘤（98%）表現(xiàn)為單克隆性Ig和/或TCR基因重排。 適用患者及適應(yīng)癥：疑似淋巴瘤患者的良惡性鑒別診斷。淋系白血病患者的鑒別診斷及微小殘留跟蹤檢測。 目標(biāo)科室：血液科、腫瘤科、病理科現(xiàn)有檢測方法及相關(guān)技術(shù)現(xiàn)有檢測方法及相關(guān)技術(shù)PCR結(jié)合毛細管電泳技術(shù)（Genescan）： 分辨率高，不易產(chǎn)生假陽性或假陰性PCR結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù) ABL激酶區(qū)突變激酶區(qū)突變 伊馬替尼的長期服用導(dǎo)致部分患者，特別是CML 急變期（AP-CML）的患者，發(fā)生伊馬替尼的耐藥，其耐藥發(fā)生率在20-30%。耐藥主要由ABL激酶區(qū)突變引起，可

17、導(dǎo)致藥物療效下降或失效。 適用患者：伊馬替尼，尼洛替尼及達沙替尼治療BCR-ABL陽性CML、ALL患者，建議定期檢測，盡早發(fā)現(xiàn)耐藥。 檢測范圍：BCR-ABL融合基因ABL激酶區(qū)52個位點ABL激酶區(qū)突變與TKI耐藥的關(guān)系Sara Redaelli, et. al, JCO, 2009,VOL27(3)469-471分子檢測常見問題分子檢測常見問題 標(biāo)本取材量不足：檢測最低白細胞數(shù)為10的6次方個細胞 檢測內(nèi)參偏低：目前原因未知 結(jié)果臨床不符：分子檢測覆蓋范圍問題，其他情況一般假陰性較少MICM整合報告整合報告染色體檢查的分析前影響因素染色體檢查的分析前影響因素 標(biāo)本要求：肝素抗凝骨髓，最少

18、標(biāo)本量為2ml。需要用公司統(tǒng)一配送的專用肝素鈉抗凝管?？鼓齽┝刻嘤绊懪囵B(yǎng)效果 標(biāo)本需要當(dāng)天送檢，24小時內(nèi)到達實驗室。標(biāo)本存放于18-25常溫即可，溫度不可高于25，不要低于16。溫度過高或過低都會影響細胞存活 藥物影響及病情影響：惡性血液病細胞，特別是用藥后的細胞存活能力較正常細胞差，不易培養(yǎng)流式檢查的分析前影響因素流式檢查的分析前影響因素 標(biāo)本要求：EDTA抗凝骨髓，最少標(biāo)本量為2ml。 標(biāo)本需要當(dāng)天送檢，48小時內(nèi)到達實驗室。標(biāo)本存放于18-25常溫即可，溫度不可高于25，不要低于16。 溫度過高或過低都會導(dǎo)致細胞表面抗原脫落，影響結(jié)果 藥物影響及病情影響：抗原表達譜改變流式細胞檢測注意事項：流式細胞檢測注意事項： 標(biāo)本要求：EDTA抗凝骨髓/外周血2 m