1、DNA指紋法在案件偵破中有重指紋法在案件偵破中有重要作用，刑偵人員通過(guò)案發(fā)現(xiàn)要作用，刑偵人員通過(guò)案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)的血液、頭發(fā)等樣品中提取場(chǎng)的血液、頭發(fā)等樣品中提取的的DNA，與犯罪嫌疑人的，與犯罪嫌疑人的DNA進(jìn)行比較，就由可能為案進(jìn)行比較，就由可能為案件的偵破提供證據(jù)。件的偵破提供證據(jù)。討論：討論：犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場(chǎng)的樣品一般都犯罪嫌疑人留在現(xiàn)場(chǎng)的樣品一般都是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足是極少量的，刑偵人員要怎樣才能得到足夠量的夠量的DNA呢？呢？課題課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增擴(kuò)增DNA片段片段溫故知新溫故知新1o組成組成DNA分子的基本單位是什么分子的基本單位是什么?

2、o這些基本單位是如何連接成這些基本單位是如何連接成DNA分子的分子的?oDNA分子結(jié)構(gòu)有什么特點(diǎn)？分子結(jié)構(gòu)有什么特點(diǎn)？12345堿基堿基OHOOPOHOOHOOPOHO堿基堿基OHOHOOPOHO堿基堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基53ATGCAGCT5端端3端端5端端3端端 識(shí)別識(shí)別 ：-OH端為端為3; 磷酸基團(tuán)的磷酸基團(tuán)的末端為末端為5。DNADNA分子的復(fù)制需要哪些條件？分子的復(fù)制需要哪些條件？DNADNA分子的復(fù)制過(guò)程是怎樣的？分子的復(fù)制過(guò)程是怎樣的？溫故知新溫故知新2DNADNA母鏈：母鏈：提供復(fù)制的模板提供復(fù)制的模板解旋酶：解旋酶：打開(kāi)打開(kāi)DNADNA雙鏈雙鏈4 4種脫氧核苷酸

3、：種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料合成子鏈的原料DNADNA聚合酶：聚合酶：催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈ATPATP：為復(fù)制過(guò)程提供能量為復(fù)制過(guò)程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶從引物的聚合酶從引物的3 3端開(kāi)端開(kāi)始連接脫氧核苷酸始連接脫氧核苷酸o討論討論: 如何控制條件進(jìn)行細(xì)胞外如何控制條件進(jìn)行細(xì)胞外DNA的的復(fù)制呢？復(fù)制呢？DNADNA母鏈：母鏈：提供復(fù)制的模板提供復(fù)制的模板解旋酶：解旋酶： 打開(kāi)打開(kāi)DNADNA雙鏈雙鏈4 4種脫氧核苷酸：種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料合成子鏈的原料DNADNA聚合酶：聚合酶： 催化合成催化合成DNADNA子鏈子鏈ATPATP：為復(fù)制過(guò)程提供能

4、量為復(fù)制過(guò)程提供能量引物：引物：使使DNADNA聚合酶從引物的聚合酶從引物的3 3端開(kāi)端開(kāi)始連接脫氧核苷酸始連接脫氧核苷酸8010080100耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶緩沖溶液：緩沖溶液：維持反應(yīng)的維持反應(yīng)的pHpH值不變值不變PCR技術(shù)技術(shù)：oPCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)n是一種體外迅速擴(kuò)增是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技片段的技術(shù)，它能以極少量的術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝?？截悺利用了利用了DNA的熱變性的熱變性原理，通過(guò)控原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。制溫度來(lái)控制雙鏈

5、的解聚與結(jié)合。DNA雙鏈雙鏈變性（加熱變性（加熱80-100 ）復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）DNA單鏈單鏈變性的目的：變性的目的：解開(kāi)雙鏈解開(kāi)雙鏈復(fù)性的目的：復(fù)性的目的：有利于引物有利于引物1和引物和引物2與兩條單鏈與兩條單鏈的結(jié)合的結(jié)合PCR擴(kuò)增儀實(shí)際上就是一臺(tái)能夠擴(kuò)增儀實(shí)際上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)自動(dòng)調(diào)控溫度控溫度的儀器，它可以根據(jù)的儀器，它可以根據(jù)DNA的熱變的熱變性原理性原理，通過(guò)自動(dòng)改變溫度，達(dá)到擴(kuò)增，通過(guò)自動(dòng)改變溫度，達(dá)到擴(kuò)增DNA片段的目的。片段的目的。1234522557294時(shí)間（時(shí)間（minmin）溫度（）適溫延伸適溫延伸高溫變性高溫變性低溫復(fù)性低溫復(fù)性重復(fù)重復(fù)1 13 3

6、步步3030輪輪DNA復(fù)制的方向：DNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的5端向端向3端端延伸延伸變性變性 復(fù)性（退火）復(fù)性（退火） 延伸延伸 PCR的反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)過(guò)程 5/3/3/5/5/3/引物引物5/3/引物引物變性變性95oC復(fù)性復(fù)性55oC延伸延伸72oC5/3/3/5/5 引物引物15 引物引物2第二次復(fù)制第二次復(fù)制第一次復(fù)制第一次復(fù)制5 5 5 5 5 5 模板模板DNA5 5 5 5 5 5 5 5 三、三、 PCR實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作一種通過(guò)高速轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將一種通過(guò)高速轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生離心現(xiàn)象，能將固體與液體分開(kāi)的設(shè)備。固體與液體分開(kāi)的設(shè)備。（1）按配方將所需試劑擺

7、放在實(shí)驗(yàn)桌上（）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備準(zhǔn)備）（2）用）用微量移液器微量移液器按配方在微量按配方在微量離心管離心管中依次加入各組分（中依次加入各組分（移液移液）（3）蓋嚴(yán)）蓋嚴(yán)離心管離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合混合）（4）將微量離心管放在）將微量離心管放在離心機(jī)離心機(jī)上（上（離心離心）（5）將離心管放入）將離心管放入PCR儀儀上，設(shè)置好上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（儀的循環(huán)程序（反應(yīng)反應(yīng)） (1)為避免外源為避免外源DNA等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。些用具在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。

8、 (2)所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 儲(chǔ)儲(chǔ)存。存。 (3)在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。所有成分都加入后，通劑后，移液器上的槍頭必須更換。所有成分都加入后，通過(guò)手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻。過(guò)手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)四、四、 結(jié)果分析與評(píng)價(jià)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA 含量的測(cè)定：含量的測(cè)定：稀釋稀釋 對(duì)照調(diào)零對(duì)照調(diào)零 測(cè)定測(cè)定 計(jì)算計(jì)算5050倍倍蒸餾水做蒸餾水做對(duì)照對(duì)照波長(zhǎng)波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)處讀數(shù)討論并交流：討論

9、并交流： 生物體內(nèi)的生物體內(nèi)的DNA復(fù)制與復(fù)制與 PCR技術(shù)有哪些異同技術(shù)有哪些異同 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增擴(kuò)增(PCR技術(shù)技術(shù))的比較的比較細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制復(fù)制PCR不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋解旋酶，邊解旋邊復(fù)制解旋酶，邊解旋邊復(fù)制80 100 高溫解旋，雙高溫解旋，雙鏈完全分開(kāi)鏈完全分開(kāi)酶酶DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶連接酶TaqDNA聚合酶聚合酶引物引物RNADNA或或RNA溫度溫度體內(nèi)溫和條件體內(nèi)溫和條件高溫高溫子鏈子鏈合成合成一條鏈連續(xù)一條鏈連續(xù)(先導(dǎo)鏈先導(dǎo)鏈)，另一條鏈，另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由不連續(xù)，先合成片段，再由D

10、NA連接酶連結(jié)連接酶連結(jié)(滯后鏈滯后鏈)兩條子鏈均連續(xù)合成兩條子鏈均連續(xù)合成相同點(diǎn)相同點(diǎn)提供提供DNA模板模板四種脫氧核苷酸作原料四種脫氧核苷酸作原料子鏈延伸的方向都是從子鏈延伸的方向都是從5端到端到3端端練習(xí)鞏固練習(xí)鞏固1.PCR過(guò)程中,引物的作用是()A.打開(kāi)DNA雙鏈,使DNA解旋為單鏈B.催化合成DNA子鏈C.使DNA聚合酶能夠從引物的3端開(kāi)始復(fù)制D.為DNA復(fù)制過(guò)程提供模板2.PCR的每次循環(huán)都可以分為三步,按循環(huán)的順序排列是()A.變性、延伸、復(fù)性 B.變性、復(fù)性、延伸C.復(fù)性、變性、延伸 D.延伸、變性、復(fù)制CB3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過(guò)程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95下使模板DNA變性、解鏈55下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）72下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR過(guò)程的敘述中不正確的是（ ）A變性過(guò)程中是使用高溫破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵B復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成C延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸DPCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高C課堂小結(jié)課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段片段PCR