1、靶向血管的抗腫瘤藥物研究方法靶向血管的抗腫瘤藥物研究方法靶向血管的抗腫瘤藥物在臨床腫瘤治療中的意義靶向血管的抗腫瘤藥物在臨床腫瘤治療中的意義 惡性腫瘤在全球范圍內(nèi)已成為常見病、多發(fā)病，據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，全球5050多億人口中，每年新診斷的腫瘤患者約為900900萬人，因腫瘤而死亡者達700700萬人，占總病死率的近20%20%。 傳統(tǒng)的腫瘤治療方法如手術(shù)、放療和化療雖有一定的進展，但都有它們本身的局限性。 1971 1971年，美國科學家、哈佛大學醫(yī)學院教授JudahJudahFolkman Folkman 首次提出腫瘤的生長浸潤依賴于腫瘤內(nèi)新生血管的形成這一觀點。隨后，在這一領(lǐng)域的研究逐漸

2、深入，針對腫瘤新生血管的治療策略層出不窮。 腫瘤血管的生成腫瘤血管的生成 血管前期 腫瘤聚集體生成后即進入無血管生長期, ,通過彌散作用使腫瘤獲得足夠的營養(yǎng)和氧, ,并運走代謝產(chǎn)物。當腫瘤體積增至(1(12)mm32)mm3以上時, ,如無新生血管長入, ,腫瘤組織將保持休眠狀態(tài)或發(fā)生退化。 血管期 一旦血管長入腫瘤, ,血液供應變?yōu)楣嘧? ,腫瘤將快速生長并達到難以控制的體積。多種組織的腫瘤內(nèi)微血管密度(MVD)(MVD)高于正常。新生血管不僅為腫瘤組織提供足夠的營養(yǎng)和氧, ,還提供大量的生長因子和存活因子, ,促進其生長。 腫瘤血管和正常血管的區(qū)別腫瘤血管和正常血管的區(qū)別 不成熟：血管管腔

3、內(nèi)皮細胞不連續(xù)、基膜異常 內(nèi)皮形狀異常、相互之間聯(lián)系松散 對大分子的滲透性高以及由此引起的高的間隙壓 增殖快，增殖細胞比例高，血管平滑肌層不完整或缺乏 血管系統(tǒng)雜亂無序，具有復雜的分支系統(tǒng)，血管直徑異常，分支點之間距離較長，對于血流的阻力較大 血流速度低，甚至是間斷的 毛細血管中包含高水平的血紅蛋白，缺氧的微環(huán)境Bloodflowrate(ml/g/min)靶向血管的抗腫瘤藥物分類靶向血管的抗腫瘤藥物分類 靶向新生腫瘤血管的藥物 腫瘤新生血管生成抑制劑（tumorangiogenesisinhibitors，TAIs） 抗血管新生，主要通過改變促進和抑制血管生成因子的平衡關(guān)系來抑制腫瘤新生血管

4、的生長，如阻斷促血管生成因子與其受體結(jié)合，使用抗血管生成因子等。 代表藥物：TNP470、血管抑制素（Angiostatin） 、內(nèi)皮抑制素（Endostatin）、凝血栓蛋白（Thrombospondin1） 靶向既成腫瘤血管的藥物 血管破壞劑（vascular disrupting agents, VDAs） 血管靶向，利用腫瘤血管內(nèi)皮細胞生長活躍，特異地高表達一些分子的特性，構(gòu)建相關(guān)的耦聯(lián)毒素或同位素的抗體（生物導彈），或者制成這些腫瘤血管內(nèi)皮細胞相關(guān)分子的疫苗，靶向性地殺傷腫瘤血管內(nèi)皮細胞。 代表藥物：CA 4 P、ZD6126，F(xiàn)AA VEGF抑制劑：抗VEGF單克隆抗體 貝伐單抗(

5、Bevacizumab,Avastin)2004年2月26日獲得FDA批準上市用于一線治療晚期大腸癌,在緩解率生存期、疾病進展時間等方面有明顯療效 。在晚期非小細胞肺癌的臨床應用中也取得滿意療效。靶向血管治療的特點靶向血管治療的特點 腫瘤細胞不易產(chǎn)生耐藥性； 腫瘤血管內(nèi)皮細胞的有限損傷就可造成大量腫瘤細胞的生長抑制，不會對骨髓和造血器官產(chǎn)生毒性； 抗血管生成治療可應用到很多中惡性腫瘤，具有廣譜性 20012001年，中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院聯(lián)合全國2424家臨床醫(yī)院，對恩度進行了近500500例的大規(guī)模臨床實驗。20052005年9 9月1212日，恩度獲得國家新藥證書，成為擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的國

6、家一類新藥。 血管破壞劑分類血管破壞劑分類CA4類藥物黃酮乙酸類藥物 CA4P FAADMXAADisruption of endothelial cells by treatment with CA-4-P or DMXAAtubulin (green)actin (red)研究方法研究方法 體外篩選 血管內(nèi)皮細胞模型；大鼠動脈環(huán); ;血管生成因子模型；高通量篩選模型 體內(nèi)篩選 雞胚絨毛尿囊膜模型、鼠耳模型、基質(zhì)膠塞模型、嚙齒動物的角膜微囊、斑馬魚模型 腫瘤模型 小鼠Lewis 肺癌、黑素瘤B16在體觀察血管發(fā)育的模式生物 模式生物：通常指人們研究生命現(xiàn)象過程中長期、反復作為研究材料的物種，

7、如，果蠅、線蟲、斑馬魚、雞胚、擬南芥等。人們在對這些物種的形態(tài)、解剖、生理、生化、細胞及遺傳進行全面分析和歸納的基礎(chǔ)上，把它們作為典范，將對其研究得出的規(guī)律，推演到相關(guān)的生物物種中，從而加快了對其他各種生物的研究。 模式生物的發(fā)展 早在20世紀最初的20年中，甚至更早到20世紀的“上世紀”，人們就發(fā)現(xiàn)，如果把關(guān)注的焦點集中在相對簡單的生物上，發(fā)育的現(xiàn)象難題可以得到部分解答（細胞數(shù)量更少，分布相對單一，變化也較好觀察；由于進化的原因，細胞生命在發(fā)育的基本模式方面具有相當大的同一性）所以利用位于生物復雜性階梯較低級位置上的物種來研究發(fā)育共同規(guī)律是可能的。尤其是當在有不同發(fā)育特點的生物中發(fā)現(xiàn)共同形態(tài)

8、形成和變化特征時，發(fā)育的普遍原理也就得以建立。因為對這些生物的研究具有幫助我們理解生命世界一般規(guī)律的意義，所以它們被稱為“模式生物”。模式生物的特點生理特征能夠代表生物界的某一大類群容易獲得并易于在實驗室中飼養(yǎng)繁殖容易進行實驗操作在體觀察血管發(fā)育的模式生物斑馬魚、雞胚雞胚絨毛尿囊膜模型雞胚的生物學構(gòu)造尿囊尿囊卵黃囊卵黃囊雞胚模型的意義生理情況下新生血管形成主要發(fā)生在胚胎發(fā)育和女性月經(jīng)周期內(nèi)膜修復過程：在某些病理情況下。如損傷修復、炎癥等也常伴發(fā)血管生成。特別是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)。早在1912年，雞胚絨毛尿囊膜(CAM)模型首次成功用于腫瘤研究。雞胚對抑制血管生成的藥物較敏感是一種

9、較理想的研究抗血管形成藥物的篩選模型是研究血管形成和抗血管形成的最佳體內(nèi)模型之一。操作過程獲取種蛋，于37，55相對空氣濕度下孵育，每天翻動3次；孵育至第七天，無菌條件下加藥：確定氣室及胚頭位置75%酒精清洗卵殼，無菌眼科鑷、剪在氣室處開窗，直徑為2.0cm左右，小心移去蛋殼及其內(nèi)側(cè)的殼膜，觀察絨毛膜尿囊血管生成情況設(shè)置對照組和實驗組：對照組加生理鹽水，實驗組按照預先設(shè)定的藥物濃度分別加藥，藥物加在無菌濾紙薄片上，置薄片于血管較細、密度較小部位小心把對照組和實驗組放回溫箱， 37，55相對空氣濕度，但不再翻動孵育至第810天，連續(xù)觀察結(jié)果并拍照記錄。對照組高濃度藥物實驗組對照組低濃度藥物實驗組

10、中濃度藥物實驗組高濃度藥物實驗組27 解剖顯微鏡下以相同放大倍數(shù)計數(shù)血管，以實驗部位邊緣(即微孔濾膜載體邊緣) 1mm范圍內(nèi)為一級血管，5mm范圍內(nèi)為二級血管凡屬趨向性生長的血管，即以載體為中心發(fā)出，與濾膜半徑的夾角小于45者均計數(shù)，而穿行，繞行的血管則不計算在內(nèi)一、二級血管分別觀察計數(shù)，然后對一、二級血管數(shù)分別進行統(tǒng)計學分析和拍照記錄。注意事項 雞胚絨毛尿囊膜的血管生成大約經(jīng)歷早期、中期和晚期3個階段。早期胚胎的第57天，毛細血管網(wǎng)以出芽的方式形成新生血管；中期胚胎發(fā)育的第812天，套疊生長是主要的生長方式；而晚期胚胎的第l3l4天，血管結(jié)構(gòu)已經(jīng)基本成熟，此時的血管形成主要以毛細血管網(wǎng)的膨脹

11、方式進行。 因此，選擇胚胎410天進行抗血管形成試驗，此時血管形成以出芽和套疊的方式進行，處于血管生長高峰階段，便于結(jié)果的觀察。在CAM法中，固態(tài)待測物可直接加入，液態(tài)物質(zhì)需要適宜載體，使藥物在局部緩釋起效及定位常用的藥物戴體有(1)明膠海綿，(2)中速定性濾紙，(3)快速定性濾紙，(4)混合纖維素濾膜，(5)雙蒸水配制濃度為0.5的M-450甲基纖維素溶液。高溫高壓滅菌，150l甲基纖維素溶液分6次加入直徑為5mm的圓形模具中，60烤箱烘干成盤狀，80烤箱中烘烤60min消毒，備用前四種載體制成直徑5mm的圓片，濕熱滅菌，4冰箱保存?zhèn)溆谩ｋu胚模型的應用目前，抑制腫瘤血管形成已被公認為一種嶄新

12、的抗癌戰(zhàn)略，以腫瘤血管生成為靶點，開發(fā)血管生成抑制劑在抗腫瘤研究中是一個新的活躍研究領(lǐng)域?？寡苌芍委煹难芯楷F(xiàn)已推廣到新生兒血管瘤病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等疾病的治療；而促血管生成對心血管疾病、胃腸道消化性潰瘍等疾病的治療也有一定的意義。腫瘤血管和正常血管的區(qū)別腫瘤血管和正常血管的區(qū)別 不成熟：血管管腔內(nèi)皮細胞不連續(xù)、基膜異常 內(nèi)皮形狀異常、相互之間聯(lián)系松散 對大分子的滲透性高以及由此引起的高的間隙壓 增殖快，增殖細胞比例高，血管平滑肌層不完整或缺乏 血管系統(tǒng)雜亂無序，具有復雜的分支系統(tǒng)，血管直徑異常，分支點之間距離較長，對于血流的阻力較大 血流速度低，甚至是間斷的 毛細血管中包含高水平的血紅蛋白，缺氧的微環(huán)境Bloodflowrate(ml/g/min)靶向血管治療的特點靶向血管治療的特點 腫瘤細胞不易產(chǎn)生耐藥性； 腫瘤血管內(nèi)皮細胞的有限損傷就可造成大量腫瘤細胞的生長抑制，不會對骨髓和造血器官產(chǎn)生毒性； 抗血管生成治療可應用到很多中惡性腫瘤，具有廣譜性 雞胚模型的意義生理情