1、第八章 蛋白質(zhì)分析及預測方法 一、分子量及等電點一、分子量及等電點n蛋白質(zhì)的一些基本性質(zhì)可直接分析其一級序列而獲得，如蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子質(zhì)量、等電點(pI)、親水性和疏水性、信號肽、跨膜區(qū)等。n蛋白質(zhì)的分子量和等電點可用一些本地化的軟件如MacVector、OMIGA、DNAMAN、BioEdit等分析計算n在線可通過ExPASy的Compute pI/Mw（/tools/pi_tool.html）或ProtParam（/tools/ protparam.html）計算。Temperature 22 30IPTG

2、(mM) 0.001 0.1 0.001 0.01 M S P S P S P S PnCompute pI/Mw對pI的確定基于早期Bjellqvist等的實驗，該實驗根據(jù)多肽在含高濃度（9.29.8mol/L）尿素緩沖液中，酸性pH梯度（pH4.5至pH7.5）電泳中的遷移率來計算其pK值和pI值，然后根據(jù)氨基酸序列和pI關(guān)系來預測，因此在計算堿性蛋白質(zhì)的理論pI值時可能不準確。nProtParam可計算蛋白質(zhì)分子量、理論等電點、氨基酸組成、各原子組成、在280nm附近的吸光系數(shù)、估計半衰期、穩(wěn)定指數(shù)等，但如蛋白質(zhì)中含翻譯后修飾過的氨基酸殘基，則不計算在內(nèi)。 二、蛋白質(zhì)辨識二、蛋白質(zhì)辨識（

3、一）、基于組成的蛋白質(zhì)辨識（一）、基于組成的蛋白質(zhì)辨識可利用可利用ExPASy的的AA CompIdent（/tools/aacomp/）去檢索）去檢索具有相同組成的已知蛋白。具有相同組成的已知蛋白。 （二）、二維凝膠電泳（二）、二維凝膠電泳n在嚴格的標準化狀況下，雙向凝膠上的某些蛋白質(zhì)圖譜，可結(jié)合SWISS-2DPAGE（/ch2d/）數(shù)據(jù)庫而得到鑒定。 （三）、質(zhì)譜分析（三）、質(zhì)譜分析n 應(yīng)用質(zhì)譜分析可進行蛋白質(zhì)鑒定和序列測定，其基本原理是將樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子之間的質(zhì)荷比的差異來分離并確定相對分子質(zhì)量。

4、 n 應(yīng)用蛋白酶將膠上或膜上分離出的蛋白斷裂成肽片段，通過MALDI-MS或ESI-MS得到肽質(zhì)指紋圖譜，搜索數(shù)據(jù)庫，可對蛋白質(zhì)進行鑒定。常用的在 線 肽 質(zhì) 指 紋 圖 譜 分 析 工 具 有 E x P A S y 的PeptIdent（/tools/peptident.html）三、酶切及斷裂位點 nExPASy的PeptideCutter（/tools/peptidecutter/）工具可預測蛋白質(zhì)序列在特定蛋白酶或化學試劑作用下的斷裂位點 nPeptideMass（/to

5、ols/peptide-mass.html）是ExPASy中另一個分析內(nèi)切產(chǎn)物的工具，它可計算蛋白質(zhì)經(jīng)特定酶水解得到的肽片段的分子量、理論等電點等。 四、疏水性四、疏水性n在線可用ExPASy的ProtScale(/cgi-bin/protscale.pl )程序。疏水性預測的方法依賴于疏水性的衡量尺度，這里每個氨基酸根據(jù)其一系列的物理特性（例如，溶解性、跨越水汽相時產(chǎn)生的自由能等），被賦予一個數(shù)值以代表其疏水性。 n用用ProtScale中中Kyte & Doolittle 算法分析人算法分析人NPD1蛋白結(jié)果示例蛋白結(jié)果示例nProtScal

6、e除能分析蛋白質(zhì)的親/疏水性外，還能計算蛋白質(zhì)的分子量、極性，預測二級結(jié)構(gòu)等，共包括了50余種不同的算法。n除ProtScale外，蛋白質(zhì)序列統(tǒng)計分析（Statistical Analysis of Protein Sequences，SAPS）是另一個計算蛋白質(zhì)序列性質(zhì)的在線工具（http:/www.isrec.isb-sib.ch/software/SAPS_form.html），它可給出查詢序列的氨基酸組成、電荷分布（包括正/負電荷聚集區(qū)的位置，強帶電或不帶電區(qū)段，電荷分布連續(xù)性和模式等）、高疏水性和跨膜區(qū)段、重復結(jié)構(gòu)及周期性分析等屬性。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測 預測方法可以分為三類

7、：n統(tǒng)計/經(jīng)驗算法，其中最為著名的有基于經(jīng)驗統(tǒng)計規(guī)則的Chou-Fasman方法及基于信息論算法的GOR方法；n物理化學方法，基于對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的物理及化學原理的預測，如Lim方法；n機器學習方法，致力于將前兩種方法的優(yōu)點結(jié)合起來。 一、二級結(jié)構(gòu)預測方法：（一）、Chou-Fasman方法nChou-Fasman方法曾經(jīng)是現(xiàn)在仍然是最為普遍應(yīng)用的方法。n其基本出發(fā)點在于對于蛋白質(zhì)20種不同的氨基酸殘基在不同的二級結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的幾率進行統(tǒng)計分析得出在不同二級結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的傾向性。利用這種傾向性，加之周圍殘基的信息，在一定規(guī)則的指導下就可以進行預測了。預測規(guī)則簡述如下：n 螺旋規(guī)則： 沿著蛋白質(zhì)序列尋

8、找螺旋核，相鄰6個殘基中若有至少4個殘基傾向于形成螺旋，則認為是螺旋核。然后螺旋核向兩端延伸，直至四肽片斷的螺旋傾向性因子的平均值P1.0為止。此外，Pro不容許在螺旋內(nèi)部出現(xiàn)，但可出現(xiàn)于C末端以及N端的前三位，這也用于終止螺旋的延伸。最后，將螺旋兩端各去掉3個殘基，剩余部分若長于6個殘基，而且P103，則預測為螺旋。n折疊規(guī)則 相鄰5個殘基中若有3個傾向于形成折疊，則認為是折疊核，折疊核向兩端延伸直至4個殘基的平均折疊傾向性因子P1.0。若延伸后的片斷P1.05，則預測為折疊。n 轉(zhuǎn)角規(guī)則 四肽片斷，若位置專一性轉(zhuǎn)角形成幾率f i+1f i+2f i+3f i+4 0.7510-4 ，Pt

9、1.0，并大于P和P，則預測為轉(zhuǎn)角。n 重疊規(guī)則 螺旋和折疊的重疊區(qū)域，按和P的相對大小進行預測，如若P大于，則預測為螺旋，反之，則預測為折疊。（二）、GOR方法n GOR(Gamier-Osguthorpe-Robson)方法基于信息論算法，是所有統(tǒng)計算法中理論基礎(chǔ)最好的。其基本原理是將一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)看成是由一個轉(zhuǎn)化過程相聯(lián)系的兩個信息。n結(jié)構(gòu)預測依賴于每個氨基酸殘基及其周圍的殘基所攜帶的二級結(jié)構(gòu)信息。n為了避免需要大量的實驗數(shù)據(jù)，GOR方法將信息函數(shù)分為多項加和形式，并且只考慮雙殘基及單殘基所攜帶的信息：一個殘基攜帶其自身的二級結(jié)構(gòu)信息，同時攜帶有另一個殘基的二級結(jié)構(gòu)信息，包含不依賴于

10、另一殘基類型的和依賴于另一殘基類型的信息。（三）、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法n神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學習系統(tǒng)是一組有相互聯(lián)系強度的非線性的單元。用于二級結(jié)構(gòu)預測的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)多為誤差回傳式反饋網(wǎng)絡(luò)。用于二級結(jié)構(gòu)預測的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法有許多種，其中代表性的為最早發(fā)表的Qian和Sejnowski方法以及廣泛應(yīng)用的PHD方法。相對而言神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法便于應(yīng)用，有較高的預測準確度。最大的缺點是沒有明確的物理化學意義。（四）、基于多重序列比對的二級結(jié)構(gòu)預測n基于單個序列的二級結(jié)構(gòu)預測方法經(jīng)過近三十年的發(fā)展，雖然可以利用的實驗數(shù)據(jù)有了數(shù)十倍的增長，但預測準確度提高得不明顯。在單個殘基基礎(chǔ)上的預測準確度在58左右。n近年來將同源序列的信息引入二

11、級結(jié)構(gòu)預測中，可以將二級結(jié)構(gòu)預測的準確度提高到70左右?；谕葱蛄袑Ρ鹊亩壗Y(jié)構(gòu)預測方法有兩類：一類是自動程序算法，如改進的GOR方法及PHD；另一類是專家參與的多重序列對比，然后進行二級結(jié)構(gòu)預測。隨著多重序列搜尋方法PSI-BLAST的發(fā)展，基于PSI-BLAST多重序列比對的二級結(jié)構(gòu)預測方法PSIPRED也見諸報道。PSIPRED利用PHD的算法，將PSI-BLAST產(chǎn)生的多重序列比對用于訓練及預測，使預測準確度從70提高到77。二、二級結(jié)構(gòu)在線預測1PSIPRED：基于多重序列比對算法，服務(wù)器網(wǎng)址為http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/。2PredictP

12、rotein：基于PHD算法，網(wǎng)址：/predictprotein北京大學生物信息中心有該網(wǎng)站的鏡像：http:/ 。4、綜合分析：、綜合分析：位于法國里昂的CNRS（Centre National de la Recherche Scientifique）提供NPSn（http:/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html）服務(wù)，其二級結(jié)構(gòu)預測可由用戶從SOPM、HNN、DPM、DSC、GOR、PHD、PREDATOR、SIMPA96等1

13、2種方法中任選幾種進行預測，然后根據(jù)預測結(jié)果匯集整理成一個“一致的結(jié)果” 三、二級結(jié)構(gòu)預測的準確度三、二級結(jié)構(gòu)預測的準確度 總的來講，單序列的預測準確度在60左右，應(yīng)用多重序列對比信息的二級結(jié)構(gòu)預測準確度在6585之間。 從1994年起每兩年國際上都要舉行一屆關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測進展方面的評估(critical assessment of protein structure prediction, CASP) n常采用參數(shù)Q3：Q3=（P+P+Pcoil）/T，其中P、P、Pcoil分別代表預測螺旋、折疊和無規(guī)則卷曲正確的氨基酸殘基數(shù)，T為總氨基酸殘基數(shù)。 n亦有人建議用不同二級結(jié)構(gòu)預測的相關(guān)系

14、數(shù)Ci來評估。如C表示螺旋預測相關(guān)系數(shù)：其中，P為預測是螺旋且預測正確的殘基數(shù)（positive），N為非螺旋預測正確殘基數(shù)（negative），O為非螺旋卻被錯誤預測為螺旋的殘基數(shù)（false positives），U為是螺旋卻未預測出的殘基數(shù)（miss）。)()()()(OPUPONUNOUNPC算法 作者 準確性 GOR1 Garnier J, Osguthorpe DJ, Robson B (1978) 作者評測：Q3=57% CASP2：Q3=55.4%（41.9-62.5） GOR3 Gibrat JF, Robson B, Garnier J (1987) 作者評測：Q3=63%

15、 DSC King RD, Sternberg MJE (1996) 作者評測：Q3=70.1% CASP2：Q3=69.5% 57.3-87.2 PREDATOR Frishman D, Argos P (1996) 作者評測：Q3=75% Yi & Lander Yi TM, and Lander S (1993) 作者評測：Q3=68% NNSSP Salamov AA, Solovyev VV (1995) 作者評測：Q3=72.2% CASP2：Q3=67.7% 40.8-82.4 PHD Rost B, Sander C (1993) 作者評測：Q3=72.2% CASP1

16、：Q3=71.6% 46.3-94.1 CASP2：Q3=74% 53.1-92.9 SIMPA Levin JM, Garnier J (1988) 作者評測：Q3=63% SSPRED Mehta PK, Heringa J, Argos P (1995) 作者評測：Q3=70.9% CASP2：Q3=57.8% 43.6-67.1 NNPREDICT Kneller DG, Cohen FE, Langridge R (1990) 作者評測：Q3=64% CASP2：Q3=61.1% 51.5-69.7 JNET Cuff J. A. and Barton G.(1999) 作者評測：Q

17、3=76.4% PSIPRED Jones, D. T. (1999) 作者評測：Q3=76.5%-78.3% CASP3：Q3=75.7% 55.3-96.8 第三節(jié) 特殊結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)特征分析 一、跨膜區(qū)一、跨膜區(qū)n在目前的基因組數(shù)據(jù)中，有大約2030的基因產(chǎn)物被預測為膜蛋白。n它在生物體中擔負著多種多樣的功能，其中包括把營養(yǎng)物質(zhì)和一些無機電解質(zhì)輸人細胞，將有毒的或無用的代謝產(chǎn)物排出細胞，以及細胞膜內(nèi)外信號的傳遞等作用。n它也是重要的藥物標靶。n由于跨膜蛋白具有強硫水性，難于形成x射線衍射所需要的晶體，因此目前已知跨膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的只有少數(shù)幾種，如細菌視紫視質(zhì)，光合反應(yīng)中心，細胞色素C氧化酶等

18、。n需要有效的、準確度高的算法來預測跨膜區(qū)域和跨膜方向以指導跨膜蛋白的研究；n通過對預測，能夠揭示出其隱含的生物學意義，從而指導跨膜蛋白生物學實驗。 n1982年，Kyte 和Doolittle根據(jù)各個氨基酸在有機溶劑和水中的分布系數(shù)以及在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的分布，給出它們各自的疏水標度值，然后根據(jù)硫水標度值，把氨基酸序列通過滑動的矩形窗轉(zhuǎn)換成疏水圖譜，設(shè)定合適的閾值，來判定可能的跨膜區(qū)。n然而，水溶性球狀蛋白的內(nèi)埋區(qū)也基本上是疏水性的，因此僅根據(jù)疏水特性可能會給出錯誤的結(jié)果。n1986年Von Heijine通過對各種跨膜蛋白的統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，帶正電荷的氨基酸主要分布在緊靠膜內(nèi)連接跨膜區(qū)的環(huán)上，這就

19、是所謂的“正電荷居內(nèi)規(guī)則”（Positive-inside rule）。n如1992年的TOPPRED，對可能的跨膜區(qū)通過將它們進行組合，選取使得緊靠膜內(nèi)環(huán)上正電荷最多的組合來進行進一步判斷。二、網(wǎng)絡(luò)資源資源名稱 網(wǎng)址 TMHMM http:/genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ TMPRED /software/TMPRED_form.html PHDhtm http:/npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_htm.html TMA

20、P http:/bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/tmap.html MAMSAT http:/www.cs.ucl.ac.uk/staff/d.jones/memsat.html 三、算法準確度n評估算法準確度應(yīng)包括預測區(qū)準確度及拓撲結(jié)構(gòu)準確度兩個方面，可采用Tusnady GE等使用的兩個值：1)、跨膜螺旋預測準確度QP ，其中MNcorNobs，(Ncor表示預測正確的跨膜區(qū)個數(shù)，Nobs表示總共觀測到的跨膜區(qū)個數(shù))，M可看作跨度區(qū)敏感性的度量指標；CNcor/Nprd(Nprd表示總共預測到的跨膜區(qū)個數(shù))，C可看作跨膜區(qū)特異性的度量指標，而Qp為

21、這兩個指標的綜合值。2)、整個拓撲結(jié)構(gòu)(包括跨膜區(qū)和跨膜方向)預測準確度QTNTTNTOT，其中NTT為整個拓撲結(jié)構(gòu)預測正確的跨膜蛋白個數(shù)，NTOT為測試集中總共的跨度蛋白個數(shù)。 CM跨膜區(qū) 跨膜蛋白 數(shù)據(jù)集 方法 Nobs Nprd Ncor QP M C NTOT NTT QT TMHMM 115 109 93.2% 91.6% 94.8% 23 62.2% HMMTOP 125 115 94.3% 96.7% 92.0% 24 64.9% MEMSAT 116 111 94.5% 93.3% 95.7% 21 56.8% TMAP 119 114 95.8% 95.8% 95.8% 21

22、 56.8% A PHDhtm 119 119 116 97.5% 97.5% 97.5% 37 28 75.7% TMHMM 148 140 92.7% 90.9% 94.6% 12 52.2% HMMTOP 162 146 92.4% 94.8% 90.1% 14 60.9% MEMSAT 164 145 91.2% 94.2% 88.4% 11 47.8% TMAP 153 136 88.6% 88.3% 88.8% 9 39.1% B PHDhtm 154 158 142 91% 92.2% 89.8% 23 9 39.1% TMHMM 263 249 92.9% 91.2% 94.7

23、% 35 58.3% HMMTOP 287 261 93.2% 95.6% 90.9% 38 63.3% MEMSAT 280 256 92.6% 93.8% 91.4% 32 53.3% TMAP 272 250 91.7% 91.6% 91.9% 30 50% Total PHDhtm 273 277 258 93.8% 94.5% 93.1% 60 37 61.6% 二、信號肽和蛋白質(zhì)定位二、信號肽和蛋白質(zhì)定位 在核糖體上新合成的多肽被送往細胞的各個部分，如溶酶體、線粒體、葉綠體、細胞核等細胞器中，或運送到細胞外，以行使各自的生物功能。n對于需要被轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)，其前體中含有特征氨基酸序列

24、，信號肽一般由2040個氨基酸殘基組成，在一級結(jié)構(gòu)上有以下特點：、信號肽N末端有13個帶正電荷的氨基酸殘基；、接著是1420個中性氨基酸殘基組成的疏水區(qū)（疏水核）。這個疏水區(qū)極重要，其中某一個氨基酸被非極性氨基酸置換時，信號肽即失去功能；、在信號肽C-端有一個可被信號肽酶識別的位點，此位點上游常有一段疏水較強的5肽。三、卷曲螺旋分析三、卷曲螺旋分析n另一個能夠直接從序列中預測的功能模體（motif）是-螺旋的卷曲螺旋（coiled-coils）排列方式。在這種結(jié)構(gòu)中，兩個螺旋通過其疏水性界面相互纏繞在一起形成一個十分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。卷曲螺旋在很多蛋白質(zhì)中存在，例如轉(zhuǎn)錄因子的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)中以及肌球

25、蛋白中。 資源 網(wǎng)址 描述 COILS /software/COILS_form.html 將查詢序列與已知卷曲螺旋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫搜索比較，在線預測 Multicoil /cgi-bin/multicoil/multicoil.pl 可預測雙-螺旋或三條-螺旋纏繞結(jié)構(gòu) Marcoil .au/folders/mauro/Marcoil/ 居于隱馬爾可夫模型的預測方法， 運行于 UNIX 或 LINUX 平臺 Coiled-coil http:/www.york.ac.u

26、k/depts/biol/units/coils/coilcoil.html 運行于 Macintosh 平臺的卷曲螺旋預測程序 第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測 一、同源模建（一、同源模建（homologous modeling）n同源模建也稱比較模建(Comparative modeling)，所以利用結(jié)構(gòu)已知的同源蛋白質(zhì)可以建立目標蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型，然后用理論計算方法進行優(yōu)化。 n同源模建的基本過程包括六部分：尋找一個或一組與待測蛋白質(zhì)同源的由實驗測定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進行結(jié)構(gòu)疊合；建立未知蛋白質(zhì)與已知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的序列比對；找出結(jié)構(gòu)保守性的主鏈結(jié)構(gòu)片段；模建結(jié)構(gòu)變化的區(qū)域，

27、一般為連接二級結(jié)構(gòu)片段間的區(qū)域；側(cè)鏈建模；利用能量計算的方法進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。一般地，序列一致性越差，匹配的準確程度越低，建立的模型精度也越差，序列一致性低于30的蛋白質(zhì)難以得到理想的結(jié)構(gòu)模型。 n同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測的方法有多種，大體上可分為片段組裝法和距離幾何法。片段組裝法如COMPOSER、SWISS-MODEL，距離幾何法如MODELLER等。 二、折疊模式識別二、折疊模式識別 某些蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)已知的數(shù)據(jù)庫中找不到序列相似性大于30的同源蛋白質(zhì)，但有許多序列相似性很差（小于25%）的蛋白質(zhì)卻存在相同的框架結(jié)構(gòu)折疊子（folds）。在1987年，F(xiàn)inkelstein和Ptitsyn就指出，由

28、于各種立體化學的限制，蛋白質(zhì)折疊子的數(shù)目是有限的。后來許多學者對自然界中可能存在的折疊子數(shù)目作了估計。1992年Chothia估計自然界中折疊子不會超過1000個。1998年我國科學家王志新院士作了更精確的估計，認為僅有654種折疊子存在。以結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)的折疊子為模板，尋找給定氨基酸序列可能采取的折疊類型，即折疊識別。 目前利用折疊識別預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要方法大多是從1991年Bowie等提出的一維-三維剖面法（1D-3D profile）和1992年Jones等提出的Threading方法上發(fā)展而來的。n一維-三維剖面法利用每一個殘基在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所處的環(huán)境描述蛋白質(zhì)的折疊類型，根據(jù)側(cè)鏈的埋藏程度、側(cè)鏈被極性原子或水分子覆蓋的分數(shù)以及局部二級結(jié)構(gòu)，Bowie等將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)環(huán)境分成18類，然后統(tǒng)計出20種氨基酸在18種環(huán)境中的出現(xiàn)概率，得到一個表示不同氨基酸對各種環(huán)境偏好程度的評估矩陣，稱為3D-1D記分表。對于結(jié)構(gòu)已知的蛋白質(zhì)X，每一個氨基酸殘基都可以分配一類環(huán)境，從而將3D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為1D序列(稱環(huán)境鏈)。n利用3D-1D記分表生成蛋白質(zhì)X