1、第一次EMSA實驗1. 實驗設計首次實驗為確保系統(tǒng)的正確工作和操作的正確性，設計將Control System和Test System一起電泳。聚丙烯酰胺凝膠泳道共10個，“#number”表示泳道序號。Table 1. Control reactions for the expected results.ComponentFinal AmountControl Reactions#1#2#3Ultrapure Water-12 l11 l9 l10Binding Buffer12 l2 l2 l50% Glycerol2.5%1 l1 l1 l100mM MgCl25 mM1 l1 l1 l

2、1 g/l Poly(dIdC)50 ng/l1 l1 l1 l1% NP-400.05%1 l1 l1 lUnlabeled EBNA DNA4 pmol-2 lEBNA Extract1 Unit-1 l1 lBiotin-EBNA Control DNA20 fmol2 l2 l2 lTotal Volume-20 l20 l20 lTable 2. Binding reactions for the Test System.ComponentFinal AmountReactions#4#5#6#7#8#9#10-5L1D5L6DW0PPP0P3Ultrapure Water-10Bi

3、nding Buffer12 l2 l2 l2 l2 l2 l2 l1 g/l Poly(dIdC)50 ng/l1 l1 l1 l1 l1 l1 l1 lOptional: 50% Glycerol2.5%1 l1 l1 l1 l1 l1 l1 lOptional: 1% NP-400.05%1 l1 l1 l1 l1 l1 l1 lOptional: 1M KClOptional: 100mM MgCl25 mM1 l1 l1 l1 l1 l1 l1 lOptional: 200 mM EDTAUnlabeled Target DNA4 pmol-Protein Extract2 g-Bi

4、otin End-Labeled Target DNA20 fmolTotal Volume-20 l20 l20 l20 l20 l20 l20 l進一步實驗根據(jù)第一次實驗結(jié)果，不同時期探針結(jié)合情況不同，以另外兩批材料的核蛋白重復實驗各一次；若實驗結(jié)果顯示某個時期結(jié)合較為明顯，可選擇結(jié)合最顯著的時期的核蛋白進行下一步競爭實驗驗證，設計不同濃度梯度的Unlabeled Target DNA(cold probe)特異性競爭結(jié)合，排除非特異性結(jié)合的可能；最后在與探針結(jié)合的蛋白的位置凝膠切下測序。2. 實驗準備2.1 試劑注意：試劑瓶一律使用強酸過夜浸泡，并用自來水沖洗20次，超純水沖洗20次，并

5、過夜浸泡，使用過程避免交叉污染。500 ml 5TBE（0.22 m水系濾頭過濾）：Trizma (Tris)27 gBoric acid13.75 g0.5 mol/L EDTA-Na+(pH 8.0)10 ml或直接加Na2EDTA2H2O1.86 g超純水400 ml 溶解，定容到500 ml，室溫保存，使用前用0.22 m水系濾器過濾；25 ml 40% Acrylamide（丙烯酰胺/甲雙叉丙烯酰胺：191）： Acrylamide9.5 g BIS0.5 g 超純水10 ml 溶解，定容至20 ml，0.45 m水系濾器過濾，于棕色瓶中4保存；顯影液和定影液：按照試劑說明配制，可用

6、無特殊處理的量筒配制，可重復使用34次；1 ml 10% AP（過硫酸銨；不可使用過舊的）: AP0.1 g 去離子水.1 ml 溶解后儲存于4，2周內(nèi)有效；50 ml 5 M NaCl： NaCl14.61 g 去離子水.40 ml 溶解，定容至50 ml，高溫高壓滅菌，4保存；50 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)： Na2EDTA2H2O9.305 g 去離子水.40 ml +NaOH 約1 g調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至50 ml，高溫高壓滅菌，室溫保存；50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5)： Trizma(Tris).6.055 g 去離子水.40 ml +

7、3.5 ml 濃HCl，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至7.5，定容至50 ml，高溫高壓滅菌，室溫保存；50% Glycerol（配膠用）：Glycerol1 ml去離子水1 ml0.22 m水系濾器過濾；1% NP-40；TEMED； EBNA Control System components；Test System samples；Ultrapure Water； 2.2 設備儀器100 ml、500 ml 量筒；電泳及轉(zhuǎn)膜設備（包括冰袋和泡沫箱）；大搖床；紫外超凈工作臺；10 ml小燒杯；6個大培養(yǎng)皿；尼龍膜；濾紙；水浴鍋；250 ml錐形瓶1個；保鮮膜；暗盒；X-射線膠片；0. 45 m和0

8、.22 m濾頭； 2.3 探針退火接頭退火流程：（推薦使用PAGE方法純化后的Oligo進行退火連接，也可以選擇其他商業(yè)提供的高親和柱純化或HPLC純化方式。）A：為了建立接頭退火反應體系，需將下列成分混合：（需根據(jù)Oligo的濃度和退火反應的總體積調(diào)整各成分體積，根據(jù)實驗所需調(diào)整退火探針的量）體系成分終濃度Oligonucleotide 1100 nmol/mlOligonucleotide 2100 nmol/ml10退火緩沖液*1DEPC-Treated water適量*10退火緩沖液成分：100 mM Tris-HCl(pH 7.5), 10 mM EDTA, 1 M NaClB：將o

9、ligo溶液放在65或者更高溫度下孵育10 min（保持恒定溫度和時間至關重要?。ｋS后，將oligo溶液取出，并在室溫下緩慢冷卻（12小時）。C：將連接好的接頭于-20保存。3. 實驗步驟3.1 Prepare and Pre-Run Gel制膠：按Table 3試劑表制膠。Table 3. 6% Polyacrylamide mini gel.ComponentVolume5TBE(過濾)1 ml40% Acrylamide1.65 ml50% Glycerol(過濾)0.5 mlTEMED10 lUltrapure Water6.78 ml脫氣10 min10% AP60 lTotal

10、Volume10 ml 室溫放置30 min，同時準備電泳設備和0.5TBE電泳緩沖液。 預電泳：加0.5TBE電泳緩沖液，靜置5 min，觀察無漏，則繼續(xù)加緩沖液至沒過金屬線；100 V，1315 mA預電泳（可直接調(diào)節(jié)電流，不調(diào)電壓）至電流恒定，3060 min。同時配制0.5TBE 放入4冰箱預冷，為電轉(zhuǎn)運作準備。 3.2 Prepare and Perform Binding Reactions冰上解凍EBNA Control System components和Test System samples（不要渦旋和用手捂熱），使用時再室溫解凍EBNA Extract。根據(jù)Table 1和

11、Table 2配制20 l體系，室溫孵育20 min。添加5 l 5Loading Buffer到各20 l 反應體系，上下吹打數(shù)次，充分搖勻，不要旋渦或劇烈混勻。3.3 Electrophorese Binding Reactions切斷電源并沖洗膠孔，加各樣品20 l到膠孔中，打開電流（設定為100V為880.1厘米凝膠），樣品中溴酚藍染料遷移電泳到凝膠長度約2/3到3/4處。在6凝膠中游離的biotin-EBNA Control DNA duplex位于溴酚藍遷移后面。 3.4 Electrophoretic Transfer of Binding Reactions to Nylon

12、Membrane 0.5TBE浸泡尼龍膜至少10 min。按照“（底）海綿+濾紙2層+凝膠+尼龍膜+濾紙2層+海綿”將膜等放在一個干凈的電泳轉(zhuǎn)移槽中（避免使用已被用于免疫印跡海綿），加0.5TBE電泳緩沖液至沒過海綿。380 mA（100V）轉(zhuǎn)膜4560 min，轉(zhuǎn)運過程準備交聯(lián)設備，并將Blocking Buffer和4Washing Buffer于50水浴至所有顆粒溶解。完成后，將膜的溴酚藍一側(cè)（與凝膠相貼一面，即正面）朝上放置于干紙巾上。（在凝膠中不應有任何殘留的染料）不要讓膜干燥，立即進行下一步。 3.5 Cross-link Transferred DNA to Membrane 超

13、凈工作臺紫外燈下10 cm左右照射10 min。 3.6 Detect Biotin-labeled DNA by ChemiluminescenceBlocking Buffer和4Washing Buffer可以在室溫和50之間使用，保持所有的顆粒留在溶液中。Substrate Equilibration Buffer 可在4和室溫使用之間。封閉膜：尼龍膜正面朝上（以下操作均保持膜正面朝上）于培養(yǎng)皿中加20 ml Blocking Buffer，并45 rpm孵育15 min。準備conjugate/blocking solution：20 ml Blocking Buffer 中加入66

14、.7 l Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate （1:300稀釋）。倒出膜中的Blocking Buffer，加入conjugate/blocking solution。45 rpm孵育15分鐘；同時，準備1wash solution：40 ml 4Wash Buffer +120ml ultrapure water。膜轉(zhuǎn)移到一個新培養(yǎng)皿，用20 ml 1wash solution洗，45 rpm輕輕搖動5 min，共洗膜4次。膜轉(zhuǎn)移到一個新培養(yǎng)皿，并加入30 ml Substrate Equilibration Buffer，45 rpm孵育5分鐘；關燈：準備Substrate Working Solution：6 ml Luminol/Enhancer Solution + 6 ml Stable Peroxide Solution。注：暴露在陽光下或任何強光都會破壞Working Solution，應保存在棕色瓶并避免長時間暴露在強光下；短期暴露于通常的實驗室燈光不會破壞溶液。將膜從Substrate Equilibration Buffer中取出，用紙巾小心地吸去膜邊緣的緩沖液；將膜放在一個干凈的保鮮膜上；將Subst