1、免疫組化實驗方法免疫組織化學的概念免疫組織化學的概念 利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學?；瘜W。2最突出的優(yōu)點最突出的優(yōu)點 在更廣闊的范圍內(nèi)，把結(jié)構(gòu)與功能及代謝把結(jié)構(gòu)與功能及代謝結(jié)合起來結(jié)合起來，在微觀世界原位地原位地確定組織及細胞結(jié)構(gòu)的化學成分，達到方法統(tǒng)一，定方法

2、統(tǒng)一，定性可靠，定位準確，定量可能性可靠，定位準確，定量可能。3免疫組化實驗標本免疫組化實驗標本 組織標本（石蠟切片和冰凍切片） 細胞標本（組織印片、細胞爬片和細胞涂片）。 石蠟切片對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔；4細胞和組織的固定細胞和組織的固定1固定的作用固定的作用-使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固、終止或抑制外源性和內(nèi)源性酶活性，最大限度地保存細胞和組織的抗原性，使水溶性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬苄钥乖?，防止抗原彌散?選擇最佳固定液的標準選擇最佳固定液的標準：保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；保存抗原性。（1）醛類固定劑：穿透性較強，收縮性小，是常用的固定劑。如10中性福爾馬林液、4

3、多聚甲醛緩沖液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。（2）非醛類固定劑：適用于多肽類激素的組織固定，常與戊二醛或多聚甲醛混合使用。（3）丙酸及醇類固定劑：沉淀蛋白質(zhì)和糖，保存抗原性較好。但對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)的保存效果較差，和其它試劑混合使用加以解決，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。3常用的固定方法常用的固定方法-浸入法浸入法和灌注法灌注法（適用于動物實驗研究） 組織新鮮 勿干燥 體積適中 固定液足夠（20倍） 5抗體抗體常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體單克隆抗體和多克隆抗體。特性比較： 均一性2. 穩(wěn)定性3. 特異性4. 重復性5. 沉淀反應6熒光素標記抗體熒光素標記抗體 能夠產(chǎn)

4、生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光色素熒光色素。必備條件: 熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。 結(jié)合抗體蛋白后對抗體的免疫學性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響，用于活體內(nèi)標記，結(jié)合物應無毒，附加抗原性小。7常用的染色方法常用的染色方法 根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法酶標法，親和組織化學法 按標記物定位于抗原所在部位的手段，則可將免疫細胞組織化學染色方法分為直接直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋連法（一步法）、間接法（二步法）、橋連法法等。每進行一步結(jié)合反應。都會產(chǎn)生一次陽性結(jié)果的放大效應。敏感性由高到低敏感性由高到低依次為橋連法、間接法

5、、直接法依次為橋連法、間接法、直接法。8染色的基本程序染色的基本程序標記抗體與標本中抗原反應結(jié)合；用緩沖液洗去未結(jié)合的成分；直接觀察結(jié)果；或顯色后再用顯微鏡觀察。9反應條件反應條件抗原抗體結(jié)合屬于可逆性反應，具有共性的反應條件：（1）PH：中性及弱鹼性條件（PH 78）有利于免疫復合物的形成（2）離子強度離子強度：0.010.02 M的低離于強度有利于免疫復合物的形成（3）去污劑去污劑：有利于復合物的形成，常用的非離子型去污劑有吐溫-20，EDTA（0.01%），Triton X-100（0.11%）（4）抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度抗體稀釋液中蛋白質(zhì)濃度：稀釋液中含無關(guān)蛋白質(zhì)可以減少抗體的非特異吸

6、附，常用牛血清白蛋白（5）防腐劑防腐劑：微生物生長會干擾抗原抗體反應，稀釋液和抗體液中加入適量的疊氮鈉或硫柳汞以防腐（6）溫度和時間溫度和時間：較高的反應溫度（37）可加速抗原抗體結(jié)合反應，低溫有利于抗原抗體結(jié)合率的提高（7）洗滌洗滌：除去未結(jié)合抗原或抗體，除去非特異性吸附造成的背景染色。選用自來水、生理鹽水或PBS等，加去污劑并在洗滌過程中加以振搖10熒光素熒光素 1，異硫氰酸熒光黃異硫氰酸熒光黃（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）黃色、橙黃色或褐黃色結(jié)晶粉末，最大吸收光譜為490495 nm，最大發(fā)射光譜為520530 nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色黃綠色熒光。最常用

7、。2四甲基異硫氰酸羅丹明四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫紅色粉未，較穩(wěn)定，最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈橙紅色熒光橙紅色熒光，與FITC發(fā)射的黃綠色熒光對比鮮明。3四乙基羅丹明四乙基羅丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐紅色粉未，最大吸收光譜570 nm，最大發(fā)射光譜596600nm，呈橙紅色熒光橙紅色熒光。價廉。11染色注意事項染色注意事項（1）在濕盒內(nèi)進行，以免標本上的試劑干燥。（2）酸堿度以接近體液環(huán)境為宜（PH 7.4左右）（3）組織細胞要求新鮮，最好使用冷

8、凍切片，固定存檔標本要求組織結(jié)構(gòu)完好。（4）切片經(jīng)染色后，應及時觀察并照相。切片在4冰箱內(nèi)過夜，其熒光強度將減弱約30。（5）調(diào)整抗體稀釋度以獲得最佳染色效果，以背景調(diào)整抗體稀釋度以獲得最佳染色效果，以背景非特異性染色最小為標準，對每一批抗體必須試驗非特異性染色最小為標準，對每一批抗體必須試驗摸索，找出最佳稀釋度。摸索，找出最佳稀釋度。（6）所購抗體應及早使用，盡量減少抗體溶液的凍融次數(shù)。12酶標抗體法酶標抗體法 通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上制成酶標抗體，再借酶對底物的特異性催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物，于顯微鏡下進行細胞或組織表面或內(nèi)部某種抗原成分定位觀察。 常用的酶-辣根過氧化物酶辣根過氧

9、化物酶（HRP），堿性磷堿性磷酸酶酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶（GOD）等。 優(yōu)點優(yōu)點：與免疫熒光技術(shù)相比，終產(chǎn)物可在普通光鏡下觀察，切片能夠長久保存，經(jīng)鋨酸處理后，電子密度增強，可用于電鏡觀察。13抗生物素抗生物素-生物素生物素-過氧化物酶技術(shù)過氧化物酶技術(shù)(avidin-biotin peroxidase complex ABC) 原理原理：利用抗生物素分別連接生物素標記的第2抗體和生物素標記的酶。其第1抗體不為標記物所標記，生物素標記的第2抗體與ABC復合物相連接。ABC復合物是將過氧化物酶結(jié)合在生物素上，再將生物素-過氧化物酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應而制備的。常用：

10、ABC-HRP 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶：最通用的系統(tǒng)，使用范圍廣 ABC-AP 堿性磷酸酶堿性磷酸酶：靈敏度比較高，染色密度較低 ABC-GO 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶：靈敏度較低，適用于組織內(nèi)源性HRP或者AP含量比較高的組織，常與HRP或者AP系統(tǒng)配合進行雙染141516ABC法的特點法的特點：敏感性強 特異性強，背景染色淡方法簡便，節(jié)約時間可用于雙重或多重免疫染色。17免疫金染色原理免疫金染色原理：免疫金染色技術(shù)使用膠體金耦聯(lián)抗體，然后在光學顯微鏡下檢測抗原。解決了免疫組化里內(nèi)源性酶干擾的問題。整個檢測過程中無需酶的參與，因此不必預先處理樣本以消除內(nèi)源性酶的活性。免疫組化試劑的正確

11、選擇和使用免疫組化試劑的正確選擇和使用18一抗一抗1. 首選單克隆抗體：單克隆抗體具有高特異性、高親和力、交叉反應少等特點，避免與細胞或組織蛋白的非特異性結(jié)合，減少染色背景。減少染色背景。2. 多克隆抗體：最好是經(jīng)樣本來源種屬正常血清吸附過，盡可能的減少非特異性著色背景。加一抗前，用封閉加一抗前，用封閉液（可以是液（可以是BSA或二抗來源的正常動物血清）充分封或二抗來源的正常動物血清）充分封閉，以阻斷非特異性結(jié)合位點。閉，以阻斷非特異性結(jié)合位點。3. 跨膜分子的抗體選擇：要注意免疫原是整個蛋白分子或是胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)。對于胞內(nèi)區(qū)抗體，染色時需要使用穿孔劑，而胞外區(qū)抗體不必使用。4. 正確使用：一

12、般供應商都會提供稀釋范圍和使用方法。但常常需要重新選擇比例。一般從供應商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作倍比稀釋。1920二抗二抗種屬來源要匹配：根據(jù)所用一抗選定二抗。一般來說，如果一抗是小鼠原性，二抗應選擇兔/山羊或其它種屬抗小鼠的抗體。注意抗體同種型和亞型：確定一抗同種型和亞型后，可以選擇抗一抗來源種屬廣譜Ig或針對一抗亞型的二抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以選用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。1. 正確使用：也需要重新選擇稀釋比例。一般從供應商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作5倍比稀釋。21設(shè)立陽性對照和陰性對照設(shè)立陽性對照和陰性對照-證明實驗系統(tǒng)的正確性1. 陽性對照陽性對照：主要涉及所用緩沖液、稀釋液、二抗和檢測系統(tǒng)等因素。尤其在結(jié)果出現(xiàn)無信號時，為查找原因提供重要線索。2. 陰性對照陰性對照：一種是自身對照（常用），指測試組織本身非抗原表達部位。一種是外部對照，指已證實不表達檢測抗原的組織。22試劑保存試劑保存-抗體試劑保存：抗體濃度越高越穩(wěn)定，易保存；濃度低時，應加抗體濃度越高越穩(wěn)定，易保存；濃度低時，應加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保護劑；必要時需要加的牛血清白蛋