1、第七章第七章 抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 抗體的制備抗體的制備v多抗（多抗（ployclonal antibody）v單抗（單抗（monoclonal atibody）v抗體庫（抗體庫（antibody library）v基因工程抗體（基因工程抗體（engineering antibody）v催化抗體（催化抗體（catalytic antibody or abozyme）抗血清：含有特異性抗體的動(dòng)物血清。抗血清：含有特異性抗體的動(dòng)物血清。 一、抗血清的制備一、抗血清的制備1、免疫動(dòng)物、免疫動(dòng)物 抗原抗原 佐劑佐劑 免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物2、抗血清的純化和保存、抗血清的純化和保存

2、 采血采血 抗血清的純化抗血清的純化保存保存3、抗血清的特性鑒定、抗血清的特性鑒定 滴度（滴度（titer） 親和（合）力親和（合）力 特異性特異性二、抗體的特性二、抗體的特性1 1 抗原抗原- -抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)作用力作用力 抗原抗體作用力 非共價(jià)鍵結(jié)合非共價(jià)鍵結(jié)合 氫鍵氫鍵 離子鍵離子鍵 范德華力范德華力 疏水鍵疏水鍵 Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J., Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000 :85/chime2/lyso-abfr.htm2 抗體的

3、特性測(cè)定抗體的特性測(cè)定v滴度（滴度（Titer）是指在給定條件下，結(jié)合一定量抗原）是指在給定條件下，結(jié)合一定量抗原所需的最大的抗血清稀釋倍數(shù)。（因方法不同有差所需的最大的抗血清稀釋倍數(shù)。（因方法不同有差異）異）v特異性（特異性（Specificity） 特異性檢測(cè)特異性檢測(cè)/競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)v親和力（親和力（Affinity）和親合力（）和親合力（Avidity） 親和力是單個(gè)抗原表位與單個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)親和力是單個(gè)抗原表位與單個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)之間的作用力，反映抗體與抗原表位特異性結(jié)合之間的作用力，反映抗體與抗原表位特異性結(jié)合強(qiáng)弱的量化指標(biāo)。強(qiáng)弱的量化指標(biāo)。AbAgHigh AffinityA

4、bAgLow AffinityCalculation of AffinityAg + Ab Ag-AbKeq = Ag-AbAg . AbApplying the Law of Mass Action: Reversible親合力（Avidity）p156v多價(jià)抗原與抗體結(jié)合強(qiáng)度的總體評(píng)價(jià)多價(jià)抗原與抗體結(jié)合強(qiáng)度的總體評(píng)價(jià) ，反映抗原抗體，反映抗原抗體結(jié)合的總體效果。（提高濃度改善抗原抗體親和性）結(jié)合的總體效果。（提高濃度改善抗原抗體親和性）Keq =104Affinity106Avidity1010Avidity3 影響抗原影響抗原-抗體反應(yīng)的因素抗體反應(yīng)的因素v親和力親和力v親合力親合力v抗

5、原抗體比例抗原抗體比例Ab excessAg excessEquivalence Lattice formationv抗原的物質(zhì)形式抗原的物質(zhì)形式v環(huán)境條件環(huán)境條件 溫度、離子濃度等溫度、離子濃度等Polyclonal antibodies can form lattices, or large aggregates, that precipitate out of solution.If each antigen molecule contains only a single epitope recognized by a given monoclonal antibody, the ant

6、ibody can link only two molecules of antigen and no precipitate is formed.第二節(jié)第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)原理抗原抗體反應(yīng)原理 抗原抗體反應(yīng)是非共價(jià)的特異性可逆反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)是非共價(jià)的特異性可逆反應(yīng)。 體外免疫檢測(cè)的原理。體外免疫檢測(cè)的原理。一、抗原抗體反應(yīng)的熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)一、抗原抗體反應(yīng)的熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué) 1 溶液中抗原抗體反應(yīng)的化學(xué)平衡溶液中抗原抗體反應(yīng)的化學(xué)平衡 Ag+Ab=Ag-Ab K = SL /SL= K+/K- p152 K : 平衡常數(shù)或內(nèi)在親和力。平衡常數(shù)或內(nèi)在親和力。Kd:解離常數(shù)解離常數(shù)v達(dá)到反應(yīng)平衡

7、需要的時(shí)間較長，但反應(yīng)進(jìn)行達(dá)到反應(yīng)平衡需要的時(shí)間較長，但反應(yīng)進(jìn)行90%很很容易。容易。vK相同并不能說明相同并不能說明K+和和K-的大小。的大小。 K +大時(shí)，有利于結(jié)合，抗原抗體結(jié)合穩(wěn)定大時(shí)，有利于結(jié)合，抗原抗體結(jié)合穩(wěn)定 K-大時(shí)，大時(shí)， 達(dá)到平衡點(diǎn)快，結(jié)合不穩(wěn)定達(dá)到平衡點(diǎn)快，結(jié)合不穩(wěn)定 。 前者用于標(biāo)記，后者用于親和層析。前者用于標(biāo)記，后者用于親和層析?？贵w結(jié)合抗原的特異性抗體結(jié)合抗原的特異性v同源抗原（強(qiáng)）同源抗原（強(qiáng)）v異源抗原（弱）異源抗原（弱）v變態(tài)抗體（強(qiáng)）變態(tài)抗體（強(qiáng)）v抗原末端或表面基團(tuán)具有免疫優(yōu)勢(shì)抗原末端或表面基團(tuán)具有免疫優(yōu)勢(shì)三、抗體與大分子多價(jià)抗原的反應(yīng)三、抗體與大分子多

8、價(jià)抗原的反應(yīng)1 多抗原決定簇多抗原決定簇-大分子抗原特征大分子抗原特征 抗原決定簇（表位）抗原決定簇（表位）-多價(jià)抗原多價(jià)抗原-表位重疊表位重疊v半抗原為單抗原決定簇半抗原為單抗原決定簇v結(jié)合在固體上具有多抗原決定簇的效果結(jié)合在固體上具有多抗原決定簇的效果v與液體中的半抗原反應(yīng)不同與液體中的半抗原反應(yīng)不同2 抗原抗體的親和力和親合力抗原抗體的親和力和親合力v親和力親和力(affinity)單價(jià)抗原與抗體結(jié)合的強(qiáng)弱單價(jià)抗原與抗體結(jié)合的強(qiáng)弱v親合力親合力(avidity) 多價(jià)抗原與抗體結(jié)合強(qiáng)度的總體評(píng)價(jià)多價(jià)抗原與抗體結(jié)合強(qiáng)度的總體評(píng)價(jià) 3 抗體與多價(jià)抗原結(jié)合的濃度帶現(xiàn)象抗體與多價(jià)抗原結(jié)合的濃度帶

9、現(xiàn)象v 抗體與單價(jià)抗原結(jié)合往往形成可溶性復(fù)合物抗體與單價(jià)抗原結(jié)合往往形成可溶性復(fù)合物v抗體與多價(jià)抗原可以形成沉淀（條件）抗體與多價(jià)抗原可以形成沉淀（條件） 抗原抗體反應(yīng)時(shí)抗原抗體反應(yīng)時(shí) 前帶區(qū)（抗體過量，沉淀少）前帶區(qū)（抗體過量，沉淀少） 等帶區(qū)（抗體抗原適量，大量沉淀）等帶區(qū)（抗體抗原適量，大量沉淀） 后帶區(qū)（抗原過量，沉淀少）后帶區(qū)（抗原過量，沉淀少） 初級(jí)反應(yīng)（未出現(xiàn)沉淀）初級(jí)反應(yīng)（未出現(xiàn)沉淀） 次級(jí)反應(yīng)（出現(xiàn)沉淀）次級(jí)反應(yīng)（出現(xiàn)沉淀）v形成沉淀需要一定時(shí)間，另外溫度、形成沉淀需要一定時(shí)間，另外溫度、pH值、離子值、離子強(qiáng)度、補(bǔ)體等強(qiáng)度、補(bǔ)體等v沉淀的形成可以用網(wǎng)絡(luò)理論解釋沉淀的形成可以

10、用網(wǎng)絡(luò)理論解釋4 交叉反應(yīng)交叉反應(yīng) 抗體與同源抗原反應(yīng)，又與異源抗原結(jié)合就抗體與同源抗原反應(yīng)，又與異源抗原結(jié)合就產(chǎn)生了交叉反應(yīng)。同源抗原結(jié)合強(qiáng)，異源結(jié)合弱。產(chǎn)生了交叉反應(yīng)。同源抗原結(jié)合強(qiáng)，異源結(jié)合弱。交叉反應(yīng) 單個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)能與不同的抗原表位發(fā)生反單個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)能與不同的抗原表位發(fā)生反應(yīng)或者一個(gè)抗體能與不同的抗原反應(yīng)。應(yīng)或者一個(gè)抗體能與不同的抗原反應(yīng)。 當(dāng)抗原具有相同或相似的抗原表位時(shí)即可發(fā)生當(dāng)抗原具有相同或相似的抗原表位時(shí)即可發(fā)生交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)。Anti-A AbAg AAnti-A AbAg BShared epitopeAnti-A AbAg CSimilar epitopeCr

11、oss reactionsAnti-A AbAg CSimilar epitopeCross reactions第三節(jié) 常見免疫分析方法v利用抗原抗體特異性反應(yīng)特點(diǎn)，對(duì)其中之一進(jìn)行利用抗原抗體特異性反應(yīng)特點(diǎn)，對(duì)其中之一進(jìn)行定性定量分析的方法。定性定量分析的方法。v特異、靈敏、迅速特點(diǎn)。特異、靈敏、迅速特點(diǎn)。一、免疫沉淀（一、免疫沉淀（immune precipitation) 沉淀反應(yīng)：沉淀反應(yīng)： 可溶性抗原（血清蛋白、細(xì)胞裂解液等）與相應(yīng)抗可溶性抗原（血清蛋白、細(xì)胞裂解液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時(shí)，比例適當(dāng)，出現(xiàn)肉眼體結(jié)合后，在有電解質(zhì)存在時(shí)，比例適當(dāng)，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物?？梢?/p>

12、的沉淀物。 半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)。半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)。A precipitation curve for a system of one antigen and its antibodiesA zone of antibody excess- precipitation is inhibited and antibody not bound to antigen can be detected in the supernatant; an equivalence zone of maximal precipitation - antibody and antigen form large i

13、nsoluble complexes and neither antibody nor antigen can be detected in the supernatant; a zone of antigen excess - precipitation is inhibited and antigen not bound to antibody can be detected in the supernatant.Precipitation reactions（沉淀反應(yīng)）（沉淀反應(yīng)）（soluble) in fluids yield a precipitin curve 前帶區(qū)（抗體過量，

14、沉淀少）前帶區(qū)（抗體過量，沉淀少） 等帶區(qū)（抗體抗原適量，大量沉淀）等帶區(qū)（抗體抗原適量，大量沉淀） 后帶區(qū)（抗原過量，沉淀少）后帶區(qū)（抗原過量，沉淀少）v形成沉淀需要一定時(shí)間，另外溫度、形成沉淀需要一定時(shí)間，另外溫度、pH值、值、離子強(qiáng)度、補(bǔ)體等離子強(qiáng)度、補(bǔ)體等1 溶液中的沉淀反應(yīng) 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)抗血清對(duì)照:10 1:20 1:40 1:80 1:160沉淀線抗原在凝膠或瓊脂中形成可見的沉淀線在凝膠或瓊脂中形成可見的沉淀線2. 兩種類型兩種類型免疫擴(kuò)散免疫擴(kuò)散單向擴(kuò)散（單向擴(kuò)散（radial immunodiffusion）雙向擴(kuò)散（雙向擴(kuò)散（double immunodiffusion） 。

15、單向擴(kuò)散單向擴(kuò)散(radial immunodiffusion)雙向擴(kuò)散雙向擴(kuò)散(double immunodiffusion)？Single diffusion原理原理: :檢測(cè)抗原檢測(cè)抗原單向免疫擴(kuò)散：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散：Ab+瓊脂瓊脂制板制板打孔打孔AgNSAgAg加樣加樣觀察觀察（含量）（含量）（2 2）雙向免疫擴(kuò)散：）雙向免疫擴(kuò)散：瓊脂瓊脂AbNS免疫電泳血清免疫電泳鑒定-特異圖譜火箭免疫電泳對(duì)流免疫電泳（1 1）免疫電泳）免疫電泳原理：電泳后雙擴(kuò)原理：電泳后雙擴(kuò) 應(yīng)用：血清蛋白種類分析應(yīng)用：血清蛋白種類分析An antigen preparation (orange) is first

16、electrophoresed, which separates the component antigens on the basis of charge. Antiserum (blue) is then added to troughs on one or both sides of the separated antigens and allowed to diffuse; In time, lines of precipitation (colored arcs) form where specific antibody and antigen interact.Immunoelec

17、trophoresis Combines Electrophoresis and Double ImmunodiffusionRocket diffusionantibody(3)(3)對(duì)流免疫電泳：對(duì)流免疫電泳：方法和原理：方法和原理：雙擴(kuò)電泳雙擴(kuò)電泳NSAgAbImmunoprecipitation using magnetic bead to precipitate antigen4. 免疫共沉淀免疫共沉淀5. 免疫凝集反應(yīng)(Agglutination Reactions)v抗體與顆?？乖Y(jié)合形成的可見聚集反應(yīng)?？贵w與顆粒抗原結(jié)合形成的可見聚集反應(yīng)。The interaction bet

18、ween antibody and a particulate antigen results in visible clumping called agglutinationHemagglutination (血細(xì)胞凝集）血細(xì)胞凝集）Is Used in Blood TypingABOABO血型系統(tǒng)特點(diǎn)：血型系統(tǒng)特點(diǎn)：表型表型 基因型基因型 紅細(xì)胞表面抗原紅細(xì)胞表面抗原 血清中天然抗體血清中天然抗體 AA/A,A/OA抗抗BBB/B,B/OB抗抗AABA/BA 和和 BOO/OH抗抗A 和和 抗抗BPassive Agglutination Is Useful with Soluble An

19、tigens Agglutination reactions employing synthetic beads can be read rapidly, often within 3 to 5 minutes of mixing the beads with the test sample. can detect small amounts of antibody (concentrations as low as nanograms per milliliter).vDefinition - agglutination test done with a soluble antigen co

20、ated onto a particle+A modification of the agglutination reaction, called agglutination inhibition, provides a highly sensitive assay for small quantities of an antigen.凝集抑制凝集抑制In Agglutination Inhibition, Absence ofAgglutination Is Diagnostic of Antigen（eg. Bacteria )The original home pregnancy tes

21、t kit employed hapten inhibition to determine the presence or absence of human chorionic gonadotropin (HCG人絨毛膜促性腺激素).PregnancyMechanism of home pregnant test kit間接凝集抑制試驗(yàn):乳膠妊娠試驗(yàn) v 將待測(cè)樣品中的抗原與已知抗體作用后，再與將待測(cè)樣品中的抗原與已知抗體作用后，再與相應(yīng)抗原相應(yīng)抗原乳膠顆粒混合。因沒有游離抗體的存在，乳膠顆?；旌稀Ｒ驔]有游離抗體的存在，乳膠顆粒表面的抗原不能與抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，乳膠顆粒表面的抗原不能與抗體

22、結(jié)合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，即凝集被抑制。孕婦尿液中含即凝集被抑制。孕婦尿液中含HCG，用抗，用抗HCG與之與之結(jié)合后，再加結(jié)合后，再加HCG乳膠，則不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。乳膠，則不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。 v方法方法 v1、取玻片一張，左側(cè)加生理鹽水一滴，右側(cè)加待檢尿、取玻片一張，左側(cè)加生理鹽水一滴，右側(cè)加待檢尿液一滴。液一滴。 v2、兩側(cè)各加抗、兩側(cè)各加抗HCG（HCG診斷血清）一滴，混勻診斷血清）一滴，混勻2分分鐘。鐘。 v3、兩側(cè)各加、兩側(cè)各加HCG乳膠抗原一滴，混勻乳膠抗原一滴，混勻2分鐘，觀察分鐘，觀察結(jié)果。結(jié)果。Agglutination inhibition assays can also be use

23、d to determine whether an individual is using certain types of illegal drugs, such as cocaine or heroin.Agglutination inhibition assays are widely used in clinical laboratories to determine whether an individual has been exposed to certain types of viruses that cause agglutination of red blood cells

24、.二、免疫標(biāo)記二、免疫標(biāo)記、放射免疫分析、放射免疫分析 放射免疫測(cè)定法（放射免疫測(cè)定法（RIA）：）： 131I、125I標(biāo)記，微量物質(zhì)測(cè)定標(biāo)記，微量物質(zhì)測(cè)定或放射或放射自顯影自顯影酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)EIA（Enzyme immunoassay）ELISA （Enzyme-linked immunosorbent assay） 直接法直接法 包被抗體包被抗體-標(biāo)記抗原標(biāo)記抗原 包被抗原包被抗原-標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體ELISA原理：原理： 將已知抗原或抗體吸附于固相載體將已知抗原或抗體吸附于固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面

25、進(jìn)行，用洗滌液將游離體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌液將游離成分洗去。成分洗去。間接法間接法 包被抗原包被抗原 - 一抗一抗 - 標(biāo)記二抗標(biāo)記二抗夾心法夾心法直接夾心直接夾心 ：包被抗體：包被抗體 - 抗原抗原 - 標(biāo)記抗體標(biāo)記抗體 間接夾心：包被抗體間接夾心：包被抗體 - 抗原抗原 - 一抗一抗 - 標(biāo)記二抗標(biāo)記二抗Dot-ElISA* *間接法：間接法： 檢測(cè)抗體檢測(cè)抗體洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌標(biāo)本標(biāo)本觀察觀察結(jié)果結(jié)果方法：方法：* *雙抗體夾心法：雙抗體夾心法： 檢測(cè)抗原檢測(cè)抗原Ag底物包被標(biāo)本洗洗滌滌酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體ELISPOT酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)測(cè)定法3 熒光免疫分析膜抗原膜抗原4 親和標(biāo)記免

26、疫分析親和標(biāo)記免疫分析 生物素生物素-親和素（鏈親和素）親和力高親和素（鏈親和素）親和力高 地高辛地高辛-抗體抗體Fig. 3. Northern blotting to detect DjPreb RNA. Lane 1, total RNA of planarians. 28 S and 18 S rRNA bands are indicated. Lane 2, the blot was hybridized with DIG-labeled DjPreb RNA probe. Fig.4. Expression patterns of DjPreb mRNA in D.japonica

27、 juveniles detected by whole-mount in situ hybridization. 三、免疫定位分析三、免疫定位分析 熒光免疫定位熒光免疫定位 酶標(biāo)記免疫定位酶標(biāo)記免疫定位 免疫組化免疫組化/免疫印跡免疫印跡蛋白印跡蛋白印跡Western Blotting(a) separated by electrophoresis in PAGE/SDS-PAGE, which separates the components according to their molecular weight; lower molecular weight components mig

28、rate farther than higher molecular weight ones. (b) The gel is removed from the apparatus and applied to a protein-binding sheet of nitrocellulose or nylon and the proteins in the gel are transferred to the sheet by the passage of an electric current. (c) Addition of enzyme-linked antibodies detects

29、 the antigen of interest. (d) The position of the antibodies is visualized by means of an ELISA reaction that generates a highly colored insoluble product that is deposited at the site of the reaction.2001 免疫學(xué)信息網(wǎng) http:/免疫印跡免疫印跡Western Blot覆蓋轉(zhuǎn)印覆蓋轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜（去垢劑）（去垢劑）將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開41 24

30、41 24120120His-Pv重組蛋白表達(dá)重組蛋白表達(dá)SDS-PAGE分析結(jié)果。分析結(jié)果。M，marker；1，經(jīng)過誘導(dǎo)的帶有重組，經(jīng)過誘導(dǎo)的帶有重組質(zhì)粒質(zhì)粒His-Pv超聲后沉淀；超聲后沉淀；2，經(jīng)過誘導(dǎo)的帶有重組，經(jīng)過誘導(dǎo)的帶有重組質(zhì)粒質(zhì)粒His-Pv超聲后上清；超聲后上清；3，未經(jīng)誘導(dǎo)的帶重組質(zhì)，未經(jīng)誘導(dǎo)的帶重組質(zhì)粒粒His-Pv的菌。的菌。斑馬魚卵無細(xì)胞體系中斑馬魚卵無細(xì)胞體系中C3和和Bf的的Western blot檢測(cè)（檢測(cè)（M：marker；H：人血清；：人血清；Z：斑馬魚卵無細(xì)胞體系）：斑馬魚卵無細(xì)胞體系）兔抗人兔抗人C3多克隆抗體多克隆抗體和和羊抗人羊抗人Bf多克隆抗體多

31、克隆抗體與人血清與人血清和斑馬魚卵無細(xì)胞體系均有反應(yīng)。和斑馬魚卵無細(xì)胞體系均有反應(yīng)。vWestern blot 結(jié)果表明結(jié)果表明兔抗人兔抗人C3多克隆抗體多克隆抗體和和羊抗人羊抗人Bf多克隆抗體與多克隆抗體與人血清和斑馬魚卵無細(xì)胞體系均有反應(yīng)人血清和斑馬魚卵無細(xì)胞體系均有反應(yīng)（圖（圖2-20）。兔抗人）。兔抗人C3抗體與斑馬魚卵無細(xì)胞體系形成抗體與斑馬魚卵無細(xì)胞體系形成了三條特異性條帶，其中一條帶對(duì)應(yīng)的分子量約為了三條特異性條帶，其中一條帶對(duì)應(yīng)的分子量約為185 kD，與人，與人C3的分子量大小相當(dāng)；此外，還有兩條分子量的分子量大小相當(dāng)；此外，還有兩條分子量約為約為115 kD和和70 kD的

32、條帶，分別與的條帶，分別與C3和和C3的大小相的大小相一致。一致。v斑馬魚卵無細(xì)胞體系與羊抗人斑馬魚卵無細(xì)胞體系與羊抗人Bf抗體的反應(yīng)僅產(chǎn)生了一抗體的反應(yīng)僅產(chǎn)生了一條特異性條帶，分子量與人的條特異性條帶，分子量與人的Bf很接近，約為很接近，約為93 kD。這一結(jié)果說明在斑馬魚卵子中確實(shí)存在參與替代途徑的這一結(jié)果說明在斑馬魚卵子中確實(shí)存在參與替代途徑的補(bǔ)體成分。補(bǔ)體成分。 Fig. 7 Localization of AmphiTIP30 transcripts in different tissues of adult amphioxus. (A) A micrograph shows the

33、 presence of AmphiTIP30 transcripts in the female amphioxus and predominantly expressed in the ovary. (B and C) A micrograph shows the absence of AmphiTIP30 in control sections. (D) Micrographs show the absence of AmphiTIP30 in the spermary in amphioxus. Scale bars represent 100 lm.Fig. 5. Ectopic d

34、orsal expression of ventral markers and CNS duplication after Smed-BMP and Smed-Smad1 RNAi. (A, D) Smed-eye53 expression in controls. In panel D white arrows indicate the pharynx neural plexus and black arrows indicate the visual cells. After RNAi, the treated animals show ectopic dorsal Smed-eye53 expression (arrowheads in panels E and F). Black arrows in panels EF indicate the eyes. Red arrow in panel E points to an extra eye