1、微生物的接種和分離技術應用實驗內容實驗目的實驗原理操作步驟注意事項問題與思考實驗目的 1.了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。2.了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。3.熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關準備工作及操作方法。二 實驗原理培養(yǎng)基是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的營養(yǎng)基質原則：目的明確 ;營養(yǎng)協調;控制PH、滲透壓等條件;經濟節(jié)約方法：查閱文獻;精心設計;試驗比較 步驟：計算、稱量、溶解、調PH、加瓊脂、熔化、過濾、 分裝、加塞、包扎、滅菌、冷卻、無菌檢查 營養(yǎng)六要素碳源：提供微生物繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質。用途：糖、蛋白質、核酸合成

2、。氮源：提供微生物繁殖所需氮元素的營養(yǎng)物質。用途：蛋白質、核酸合成。能源：提供微生物生命活動最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能。生長素：微生物生長必需，但又不能自行合成的有機物。無機鹽：提供微生物繁殖所需各種重要元素。水分：水是保證生命活動重要的介質。培養(yǎng)基種類:一、按成份的不同劃分 天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基二、按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)劃分 固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基三、按培養(yǎng)基用途劃分 基礎培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的種類據組成成分可分為: 1. 合成培養(yǎng)基：由各種純化學物質按一定比例配制而成。（如葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基、淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基等。） 2. 半合成培養(yǎng)基

3、：有一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成。（如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。） 3. 天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。 （如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。） 1. 液體培養(yǎng)基：不加凝固劑（常用凝固劑為瓊脂）的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。 2. 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。 3. 半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.2-0.7%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為按照培養(yǎng)基的用途，可將其分為：加富培養(yǎng)基：加富培養(yǎng)基是指在普通培養(yǎng)基里加過血、血清、動物（或植物）組織液或其他營養(yǎng)物質（或生長因子）的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，用以培養(yǎng)某種或某類營養(yǎng)要求苛

4、刻的異養(yǎng)微生物選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基是根據某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要或對某種化合物的敏感性不同而設計出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。鑒別培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產物發(fā)生反應的指示劑或化學藥品，從而產生某種明顯的特征性變化，以區(qū)別不同的微生物。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂1520g，水1000mL，7.2(后調)高氏1號培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，

5、K2HPO4，MgSO4，FeSO4，瓊脂1520g，水1000mL，。 查氏合成培養(yǎng)基查氏合成培養(yǎng)基是用來分類和培養(yǎng)霉菌的培養(yǎng)基,其配方如下：NaNO3 3g,K2HPO4 1g, KCl 0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖 30g, H2O 1000ml,pH自然麥芽汁培養(yǎng)基用來培養(yǎng)酵母菌,干麥芽粉加4倍水,在50-60保溫糖化3-4小時，用碘液試驗檢查至糖化完全為止,調整糖液濃度,煮沸后，過濾，調pH為。培養(yǎng)基配制程序9. 加塞10. 包扎11. 滅菌12. 擱置斜面、倒平板13. 無菌檢查計算稱量溶解調pH加瓊脂融化過濾分裝消毒與滅菌消毒：消滅病原

6、菌和有害微生物的營養(yǎng)體滅菌：殺滅一切微生物的營養(yǎng)體，芽胞和孢子。方法：物理的方法：加熱、過濾、輻射化學的方法：用化學試劑抑制或殺滅微生物。主要破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。 一、概念：（一）清潔（cleaning)：是指用物理方法清除物體表面的污垢、塵埃和有機物.目的: 去除和減少微生物，但并非殺滅微生物。 （二）消毒(disinfection)： 用物理或化學的方法清除或殺滅除芽胞以外的所有病原微生物，使其數量減少到無害程度的過程。 （三）滅菌(sterilization)： 用物理或化學方法殺滅全部微生物，包括致病和非致病的微生物，以及細菌的芽胞的過程。 二、消毒滅

7、菌的方法消毒滅菌方法有兩大類：物理消毒滅菌法和化學消毒滅菌法消毒滅菌方法物理消毒滅菌法化學消毒滅菌法熱力消毒滅菌光照消毒法微波消毒滅菌浸泡法噴霧法擦拭法熏蒸法干熱濕熱燃燒法干烤法煮沸消毒法壓力蒸汽滅菌 手提式壓力蒸汽滅菌器臥式壓力蒸汽滅菌器 預真空壓力蒸汽滅菌器日光曝曬紫外線燈管消毒電離輻射滅菌法 臭氧滅菌燈滅菌注：每一種消毒滅菌的方法、特點、適用物品、注意事項都是掌握的重點。過濾除菌干熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌1、火焰灼燒適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、熱空氣滅菌利用高溫干燥空氣（160170C）加熱滅菌12h，適用于玻璃器皿和培養(yǎng)皿等。原理加熱使

8、蛋白質變性，與水的含量有關，當環(huán)境和細胞含水量越大，凝固越快。3、注意事項： 1）培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品不能用此法； 2）溫度控制在180； 3）物品不能太擠； 4）溫度降至70時才開箱門。 1、熱力消毒滅菌法-干熱法烤箱對物品的要求：高溫下不變質，不損壞、不蒸發(fā)的物品，如油劑、金屬制品、玻璃器具等。加熱滅菌濕熱滅菌 高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性

9、而達到滅菌的目的。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大，三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。1g水在100時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。1）手提式壓力蒸汽滅菌器： 壓力：103kPa，時間：15-30分鐘，溫度：121126手提式壓力蒸汽滅菌器立式或臥式滅菌鍋。容量較大，一般能裝幾十瓶或幾百瓶。2、光照消毒法又稱輻射消毒，主要利用紫外線的殺菌作用，使菌體蛋白光解、變性而導致細菌死亡。（1）日光暴曬法（2）

10、紫外線燈管消毒法2、光照消毒法（1）日光暴曬法 日光有熱、干燥和紫外線的作用，有一定殺菌力 常用于：床墊、毛毯、衣服、書籍等物品的消毒 方法：是將物品放在直射陽光下暴曬6h，定時翻動，使物品各面均能受到日光照射，達到消毒的目的2、光照消毒法(2)紫外線燈管消毒法紫外線屬電磁波輻射，根據波長可分為A波、B波、C波和真空紫外線。消毒使用的是C波紫外線，其波長范圍為200 nm275nm，殺菌作用最強的波段為250 nm 270nm。紫外線可殺滅多種微生物，包括桿菌、病毒、真菌、細菌繁殖體、芽孢等。常用的紫外線燈管 15W、20W、30W、40W紫外線燈管：2、光照消毒法(2)紫外線燈管消毒法1）作

11、用機制 1、破壞菌體蛋白質中的氨基酸，使菌體蛋白 光解變性； 2、使菌體DNA失去轉化能力而死亡； 3、降低菌體內氧化酶的活性，使氧化能力喪失 4、使空氣中的氧電離產生極強殺菌作用的臭氧2、光照消毒法(2)紫外線燈管消毒法2）使用方法1、空氣消毒：消毒前做好室內清潔衛(wèi)生工作（紫外線易被灰塵微粒吸收而影響效果），關閉門窗，人員停止走動，每10m2安裝30W紫外線燈管一支，有效距離不超過2m，照射時間為3060分鐘；2、物品消毒：消毒時應將物品攤開或掛起以減少遮擋（紫外線穿透力差），有效距離為2560cm，照射時間為2030分鐘。3、液體消毒：可采用水內照射法或水外照射法，水層厚度應小于2cm,并

12、根據紫外線的輻照強度確定水流速度。2、光照消毒法(2)紫外線燈管消毒法3）注意事項3、由于紫外線的穿透力差，消毒物品時應將物品攤開或掛起，并定時翻動，使其表面受到直接照射；4、紫外線消毒的適宜溫度為2040，適宜濕度為4060；5、紫外線的消毒時間須從燈亮57min后開始計時，照射后病室要通風換氣。關燈后如需再開啟，應間歇34min。普通移動紫外線燈消毒車C波段移動紫外線燈消毒車家用紫外消毒線燈3）臭氧滅菌消毒臭氧滅菌燈臭氧發(fā)生器2、光照消毒法（3）臭氧滅菌消毒法 臭氧在常溫下為強氧化劑，穩(wěn)定性極差，易爆炸，主要依靠強大的氧化作用殺菌，可殺滅細菌繁殖體、病毒、芽孢、真菌，并可破壞肉毒桿菌毒素。

13、（補充） 滅菌燈內裝有臭氧發(fā)生管，在電場作用下，可將空氣中的氧氣轉換成高純臭氧。主要用于空氣、物品表面等的消毒。方法：關閉門窗，人員離開，打開開關20分鐘，（殺滅芽孢40分鐘）。消毒后30分鐘，人方可進入。 2、光照消毒法（3）臭氧滅菌燈消毒法注意事項1、為保證消毒效果，使用時需關閉門窗；2、臭氧對人有毒，國家規(guī)定大氣中允許濃度為 02mg/m3；3、由于臭氧的強氧化性，對多種物品都有損壞；4、溫濕度、有機物、pH等多種因素可影響臭氧的 殺菌作用；5、空氣消毒時，人員必須離開，待消毒結束后 30min可進入。 3、微波消毒滅菌法 微波是一種頻率高、波長短的電磁波。在電磁波的高頻交流電場中，物品

14、中的極性分子發(fā)生極化，高速運動，并頻繁改變方向，互相摩擦、碰撞，使溫度迅速上升，達到消毒滅菌的作用。 微波可以殺滅各種微生物，包括細菌繁殖體、真菌、病毒和細菌芽孢、真菌孢子等。常用于食物及餐具的消毒、化驗單據及票證的消毒、醫(yī)療藥品及耐熱的非金屬材料器械的消毒滅菌。 4、電離輻射滅菌法 利用放射性核素60Co發(fā)射高能射線（丙種射線）或電子加速器產生的高能電子束（陰極射線）進行輻射滅菌，殺死微生物的滅菌法。由于此法是在常溫下滅菌，故又稱“冷滅菌”，適用于不耐高溫物品的滅菌，如：金屬、橡膠、塑料、高分子聚合物（如一次性注射器、輸液器、輸血器等）、精密醫(yī)療器械、生物醫(yī)學制品等均可用此法滅菌。因放射線對

15、人體有害，應選用機械傳遞物品。5、過濾除菌 過濾除菌法（filtration） 是用物理阻留的方法將液體或空氣的細菌除去，以達到無菌目的。所用的器具是含有微小孔徑的濾菌器（filter）。主要用于血清、毒素、抗生素等不耐熱生物制品及空氣的除菌。常用的濾菌器有薄膜濾菌器（和孔徑）、陶瓷濾菌器、石棉濾菌器（即Seitz濾菌器）、燒結玻璃濾菌器等。 利用濾膜過濾去除細菌的方法。常用的有熔結玻璃細菌濾器、火棉膠、硝化纖維素濾膜等。用最大孔徑不超過1nm的過濾器可得到無菌濾液，常用于對熱不穩(wěn)定的物質的除菌?？諝饣蚱渌麣怏w也可通過棉花或超細纖維膜達到除菌的目的。 過濾除菌 不能用加熱滅菌的液體物質（如維生

16、素、血清），一般可用細菌過濾器進行除菌。（二）化學消毒滅菌法定義： 利用液體或氣體的化學藥物抑制微生物的生長繁殖或殺滅微生物的方法。 凡不適用熱力消毒滅菌的物品，都可采用化學消毒滅菌法。如病人皮膚、黏膜、排泄物及周圍環(huán)境、光學儀器、金屬銳器和某些塑料制品的消毒。（二）化學消毒滅菌法1、化學消毒劑的作用原理（1）與菌體蛋白質的氨基結合，使蛋白質變性、酶活性消失。如甲醛、碘酊（2）與菌體蛋白的巰基、氨基結合，使蛋白質變性。如戊二醛（3）通過對菌體蛋白質分子的烷基化作用，干擾酶的正常代謝而殺滅微生物，如環(huán)氧乙烷（4）抑制細菌酶活性，破壞細胞代謝導致菌體死亡，如漂白粉（5）使菌體蛋白凝固變性。如707

17、5的乙醇（6）破壞細胞膜的酶活性，使胞漿膜破裂，如氯乙定（二）化學消毒滅菌法2、化學消毒劑的分類（1）滅菌劑：可以殺滅一切微生物，包括細菌芽孢，使其達到滅菌效果的制劑。如甲醛、戊二醛、過氧乙酸、環(huán)氧乙烷等（2）高效消毒劑：指可殺滅一切細菌繁殖體、病毒、真菌及其孢子，并對細菌芽孢有顯著殺滅作用的制劑，如含氯消毒劑、過氧化氫等 （3）中效消毒劑：能殺滅細菌芽孢以外的細菌繁殖體、真菌、病毒及其他微生物的制劑。如乙醇、碘消毒劑（4）低效消毒劑：只能殺滅細菌繁殖體，親脂病毒和某些真菌的制劑，如氯乙定等。細菌培養(yǎng)技術 內容常用細菌培養(yǎng)方法。細菌的分離培養(yǎng)和接種技術。細菌生長現象觀察。 一、常用細菌培養(yǎng)方法

18、需氧培養(yǎng)法（一般培養(yǎng)）適用于需氧菌和兼性厭氧菌培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度：37（采用恒溫培養(yǎng)箱）。培養(yǎng)時間：1824h。二氧化碳培養(yǎng)法適用于奈瑟菌屬和布魯菌屬等苛養(yǎng)菌培養(yǎng)?？刹捎脿T缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱。一、常用細菌培養(yǎng)方法微需氧培養(yǎng)法適用于空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等微需氧菌培養(yǎng)?？刹捎贸闅鈸Q氣法。厭氧培養(yǎng)法適用于專性厭氧菌培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等。二、細菌的分離培養(yǎng)和接種技術(一)接種工具接種針和接種環(huán)：由三部分組組成，即環(huán)（針）、金屬柄和絕緣柄。接種前后都要過火滅菌。接種針用于穿刺接種細菌，接種環(huán)用于固體、液體培養(yǎng)基的細菌接種。L型玻璃棒：用于瓊脂平板涂布接種細菌。（二

19、）接種環(huán)境操作需在接種罩、超凈工作臺或無菌室內進行。常用的接種工具在實驗室或生產實踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。3、常用的接種方法劃線接種：液體接種穿刺接種涂布接種三點接種澆混接種注射接種最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。3、常用的接種方法劃線接種液體接種:穿刺接種涂布接種三點接種澆混接種注射接種從固體培養(yǎng)基上挑取細菌，接種到液體培養(yǎng)基中；或者從液體培養(yǎng)物中將菌液接至液體培養(yǎng)基中，稱為液體接種。3、常用的接種方法

20、劃線接種液體接種穿刺接種：涂布接種三點接種澆混接種注射接種用接種針挑取少量的細菌，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。在保藏厭氧菌種或研究細菌的動力時常采用此法。3、常用的接種方法劃線接種液體接種穿刺接種涂布接種：三點接種澆混接種注射接種將菌液倒到平板上，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布。3、常用的接種方法劃線接種液體接種穿刺接種涂布接種三點接種：澆混接種注射接種把少量的微生物接種在平板表面上，成三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。常用于研究霉菌的形態(tài)。3、常用的接種方法劃線接種液體接種穿刺接種涂布接種三點接種澆混接種：注射接種將待接的微生物做適當稀

21、釋后，先放入培養(yǎng)皿中；然后再倒入冷卻至45左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻；待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng).3、常用的接種方法劃線接種液體接種穿刺接種涂布接種三點接種澆混接種注射接種：用注射的方法將待接的微生物轉接至活的動物體內?？梢允钦麄€動物；也可是發(fā)育的雞胚.（三）細菌接種的基本程序滅菌接種環(huán)沾取標本接種滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的細菌，以免污染標本殺滅接種環(huán)沾染的細菌，以免污染環(huán)境細菌接種的基本程序取菌種試管和待接種的斜面試管滅菌接種環(huán)沾取標本接種接種后滅菌接種環(huán)（四）接種方法1.平板劃線接種法：目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。方法：分區(qū)劃線法：適用于含菌量較

22、多的標本。連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標本。分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)連續(xù)劃線法（四）接種方法2.液體培養(yǎng)基接種法可觀察細菌在培養(yǎng)基中的生長現象或用作生化反應實驗。 （四）接種方法3.半固體培養(yǎng)基接種法：穿刺接種法 ，用于保存菌種或觀察細菌動力。11（四）接種方法4.斜面接種法：用于鑒定和保存菌種。 （四）接種方法5.涂布接種法：用于測定標本中活菌數和藥敏實驗細菌接種。 （四）接種方法6.傾注培養(yǎng)法：用于細菌計數。將上述已接種細菌的培養(yǎng)基置37恒溫培養(yǎng)箱中孵育1824h，觀察細菌的生長現象。三、細菌在培養(yǎng)基上的生長現象1、細菌在固體培養(yǎng)基中的生長現

23、象菌落定義：指單個細菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細菌集團。菌落特征：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性。菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細菌堆積物。菌落與菌苔菌落菌苔2、細菌在液體培養(yǎng)基中的生長現象混濁沉淀：多見于鏈狀排列的細菌。菌膜：多見于厭氧菌。細菌在液體培養(yǎng)基中的生長現象菌膜菌沉淀均勻渾濁對照3、細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現象有鞭毛細菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴散生長，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現象有動力 現象無動力 現象實驗操作培養(yǎng)基的配制1.配制液體培養(yǎng)基2.配制半固體培養(yǎng)基3.配制

24、固體培養(yǎng)基實驗操作高壓滅菌器的使用1.首先將內層鍋取出,再向外層鍋內加入適量的水,使水面與三角擱架相平為宜。 切勿忘記加水,同時水量不可過少,以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。 2.放回內層鍋,并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠,以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸,以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3.加蓋,并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓,使螺栓松緊一致,勿使漏氣。 4.用電爐或煤氣加熱,并同時打開排氣閥,使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后,關上排氣閥,讓鍋內的溫度隨蒸氣壓力增加到逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時,控制熱源,維持壓力至所需時間。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內冷空氣必須完全排盡后,才能關上排氣閥,維持所需壓力。 實驗操作高壓滅菌器的使用5.滅菌所需時間到后,切斷電源或關閉煤氣,讓滅菌鍋內溫度自然下降,當壓力表的壓力降至“0”時,打開排氣閥,旋松螺栓,打開蓋子,取出滅菌物品。6.將取出的滅菌培養(yǎng)基,需擺斜面的則擺成斜面,然后放入37溫箱培養(yǎng)24h,經檢查若無雜菌生長,即可待用。實驗操作-平板制作及劃線法放斜面倒平板分區(qū)劃線澆混法接種實驗操作-斜面接種和穿刺接種 固體斜面接種半固體穿刺接種液體接種注意事項-培養(yǎng)基