1、環(huán)境化學(xué)物的一般毒性和其評價(jià)要求一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指經(jīng)人工培育，對其攜帶微生物實(shí)行控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學(xué)研究的動(dòng)物。第一節(jié) 化學(xué)物毒性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)對化合物的毒性反應(yīng)及代謝過程與人相似自然壽命不太長易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)濟(jì)并易于獲得（一）物種選擇 種類選擇的依據(jù)： （二）品系選擇 品系指計(jì)劃交配的辦法獲得的起源于共同祖先的一群動(dòng)物。同一品系的動(dòng)物具有共同的遺傳來源、相似的外貌特征、獨(dú)特的生物學(xué)特性及穩(wěn)定的遺傳性能。1、近交系動(dòng)物 指采用連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配而培育的純品系動(dòng)物。遺傳上高度一致，基因純合度可達(dá)98.6-99.8%。 對放射線耐受性強(qiáng)，淋巴細(xì)胞

2、白血病發(fā)病率6，化學(xué)致癌物質(zhì)不能誘發(fā)乳腺癌和卵巢囊腫，對結(jié)核桿菌有感受性。 可用于營養(yǎng)與肝癌發(fā)生率關(guān)系的研究，對鼠傷寒沙門氏菌C5有抵抗力，對酒精過敏。也可作為許多瘤株的宿主。 乳腺癌自發(fā)率低，肺癌發(fā)病率為26，網(wǎng)狀細(xì)胞瘤8，血管瘤6，淋巴肉瘤45，乳腺癌3，對放射線極為敏感。 特點(diǎn)：a.實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較準(zhǔn)確，可以避免遺傳組成不同或個(gè)體差異太大等所引起的誤差。b.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均性較一致。每組僅用較少數(shù)的動(dòng)物，即能看出顯著性來。c.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性較大。e.易于獲得預(yù)期結(jié)果。f.近交衰退。 2、突變系動(dòng)物 在生長繁殖過程中，通過自然突變或人工定向突變的方法，使其某基因發(fā)生突變并喪失原有的正常功能。這

3、種突變的基因可以世代相傳并保持遺傳基因特性的品系動(dòng)物，稱為突變系動(dòng)物。無胸腺裸鼠3、雜交群動(dòng)物 指兩個(gè)不同近交系之間有目的地進(jìn)行交配所產(chǎn)生的第一代動(dòng)物。 特點(diǎn)：a.具有純系動(dòng)物基本相似的遺傳均質(zhì)性。個(gè)體間遺傳變異很小。b.表現(xiàn)雙親的顯性性狀 c.對各種實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好d.具有雜種優(yōu)勢 e.國際上分布廣4、封閉群動(dòng)物 指在5年以上不從外部引進(jìn)新血緣，僅由同一品系的動(dòng)物在固定場所保存繁殖的動(dòng)物群。個(gè)體間具有一定程度的遺傳學(xué)差異。封閉群動(dòng)物個(gè)體間差異的大小，取決于祖代的來源 。（三）微生物控制的選擇1、無菌動(dòng)物 germ free animal, GF 指體內(nèi)外均無任何微生物和寄生蟲的動(dòng)物。經(jīng)人工剖

4、腹產(chǎn)凈化培育而來。2、悉生動(dòng)物 gnotobiotic animal, GN 指體內(nèi)帶有已知微生物的動(dòng)物。是經(jīng)人工有計(jì)劃地將已知菌投入動(dòng)物體內(nèi)。3、無特定病原體動(dòng)物 specific pathogen animal, SPF 指體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲的動(dòng)物。即無傳染病的動(dòng)物，容許攜帶非特定微生物。 SPF動(dòng)物群的建立，其原種必須來源于無菌動(dòng)物或悉生動(dòng)物才能保證。4、清潔動(dòng)物 Clean animal,CL 也稱最低限度疾病動(dòng)物，動(dòng)物體內(nèi)外不攜帶人畜共患疾病的病原體或動(dòng)物傳染病病原體。（四）個(gè)體選擇1、年齡 取決于實(shí)驗(yàn)類型。急性實(shí)驗(yàn)成年動(dòng)物亞慢性、慢性實(shí)驗(yàn)較年幼或初斷乳動(dòng)物。 在實(shí)際工作中常

5、以動(dòng)物體重粗略判斷動(dòng)物的年齡。各組動(dòng)物的年齡應(yīng)盡可能保持一致。2、性別 不同性別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對化學(xué)物毒性的敏感程度有時(shí)會(huì)不同。一般選用雌雄兩性。3、生理狀態(tài) 一般選用未產(chǎn)未孕的雌性動(dòng)物。雌雄分養(yǎng)。4、健康狀況 應(yīng)選用健康動(dòng)物。一般試驗(yàn)前檢疫觀察57天二、常用染毒方法（一）經(jīng)口染毒1、灌胃 是將液態(tài)受試化合物或固態(tài)、氣態(tài)化合物溶于某種溶劑中，配制成一定濃度，裝入注射器等定量容器，經(jīng)過導(dǎo)管注入胃內(nèi)。優(yōu)點(diǎn)：劑量準(zhǔn)確缺點(diǎn)：工作量大；可能損傷食道或誤入氣管；與人的接觸方式差異很大。 2、吞咽膠囊 將一定劑量受試化合物裝入藥用膠囊內(nèi)，強(qiáng)制放到動(dòng)物的后咽部迫使動(dòng)物咽下。家兔及貓、狗等大動(dòng)物可用此法。 優(yōu)點(diǎn)：劑

6、量準(zhǔn)確，尤其適用于易揮發(fā)、易水解和有異味的化合物。3、喂飼 將化合物拌入飼料和水中，需計(jì)算每日進(jìn)食量和飲水量，折算攝入劑量。 優(yōu)點(diǎn)：符合人接觸化合物的方式 缺點(diǎn)：可能拒食；揮發(fā)性化合物可使攝入量下降，且有經(jīng)過呼吸道吸入的可能；化合物易水解或與食物中的化學(xué)成分起反應(yīng)。（二）經(jīng)呼吸道染毒1、靜式吸入 在固定體積的密閉容器中，加入定量的易揮發(fā)液態(tài)化合物或氣態(tài)化合物。將動(dòng)物置于其中，一般2h。尤其是適用于小動(dòng)物接觸易揮發(fā)液態(tài)化合物的急性毒性研究。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單；操作方便；消耗化合物少缺點(diǎn)：柜內(nèi)空氣組成、環(huán)境條件不穩(wěn)定；化合物濃度難以恒定。表5-1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最低需氣量及不同體積染毒柜應(yīng)放置動(dòng)物數(shù)關(guān)系動(dòng)物

7、種屬呼吸通氣量(L/小時(shí))最低需氣量(L/小時(shí))不同容積染毒柜放置動(dòng)物數(shù)(只)25L50L100L300L小 鼠大 鼠1.4510.182.4530.535610121512364056濃度計(jì)算：C=a.d/L10001000（mg/m3） a加入化合物量（ml），d比重，L容積（L）2、動(dòng)式吸入 染毒柜空氣流動(dòng) 面罩吸入避免化合物經(jīng)皮吸入 優(yōu)點(diǎn)：劑量準(zhǔn)確 缺點(diǎn)：裝置復(fù)雜；消耗大；可能造成污染（三）經(jīng)皮膚染毒 用于研究化合物經(jīng)皮膚吸收的毒性作用及化合物對接觸皮膚的局部作用（皮膚刺激和致敏）第二節(jié) 急性毒性及其評價(jià)方法 一、急性毒性的概念 急性毒性（acute toxicity）是指機(jī)體(人或?qū)?/p>

8、驗(yàn)動(dòng)物)一次(或24小時(shí)內(nèi)多次)接觸外來化合物之后所引起的中毒效應(yīng)。觀察期可在17天。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接觸化合物的方式或途徑不同，“一次”的含義也有所不同。凡經(jīng)口接觸和各種方式的注射接觸，“一次”是指在瞬間將受試化合物輸入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)。而經(jīng)呼吸道吸入與經(jīng)皮膚接觸，“一次”是指在一個(gè)特定的期間內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)地接觸受試化合物的過程 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.求出受試化合物對一種或幾種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致死劑量(通常以LD50為主要參數(shù))，以初步估計(jì)該化合物對人類毒害的危險(xiǎn)性。2.闡明受試化合物急性毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系與中毒特征。3.研究化合物在機(jī)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化過程及其動(dòng)力學(xué)變化。也可用于研究急救治療措施4.為亞急性

9、、慢性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供依據(jù)二、急性毒性評價(jià)方法（一）經(jīng)典的急性致死性毒性試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用成年健康動(dòng)物，常用大鼠和小鼠。各劑量組雌：雄1：1，出生23個(gè)月。數(shù)量1020只最佳。大動(dòng)物每組6只。實(shí)驗(yàn)前至少觀察一周，選取其中健康動(dòng)物，隨機(jī)分組。2、染毒劑量設(shè)計(jì)（1）查閱文獻(xiàn)：分析受試化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其理化性質(zhì)，依此查閱文獻(xiàn)，找出與受試化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似化合物的毒性資料，并以其LD50(LC50)值作為受試化合物的預(yù)期毒性中值。（2）試驗(yàn)：以文獻(xiàn)LD50為中值，取倍差，設(shè)34個(gè)梯度，找出大致的LD10-90的范圍。（3）正式試驗(yàn)： I（logLD90logLD10）/（n-1）組距，即相

10、鄰兩個(gè)劑量組對數(shù)差或相鄰組比值的對數(shù)值。一般設(shè)57個(gè)劑量組。 限量實(shí)驗(yàn)：毒性較小的化學(xué)物若無法求得LD50，則進(jìn)行限量實(shí)驗(yàn)，單次染毒劑量5g/kg（體重），食品毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)15g/kg（體重）。 3、觀察 一般要求計(jì)算兩周內(nèi)的總死亡數(shù)。對于一些速死性化合物求其LD50(LC50)也可僅計(jì)算24小時(shí)的死亡率。應(yīng)注明是多少時(shí)間的LD50值，以便于在進(jìn)行毒性比較時(shí)有共同的基礎(chǔ)。 觀察內(nèi)容：（1）死亡情況（2）動(dòng)物體重（3）中毒反應(yīng)癥狀（4）病理學(xué)檢查4、LD50 計(jì)算 LD50是經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得到的毒性參數(shù)，并可報(bào)告其95可信限。LD50(LC50)值是一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，較少受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體易感性差異的影響，較

11、為準(zhǔn)確，因此是最重要的急性毒性參數(shù)，也用來進(jìn)行急性毒性分級。 直接回歸法 將劑量對數(shù)值與死亡率(概率單位)的關(guān)系，進(jìn)行直線回歸，用最小二乘法求出a、b值。代入直線方程：ya十bX。式中，X為劑量對數(shù)值，y為死亡率的概率單位。利用此式即可求得受試化學(xué)物的LD50及其95可信區(qū)間。 % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 40 4.75 4.77 4.80 4.82 4.85 4.87 4.90 4.92 4.95 4.97 80 5.84 5.88 5.92 5.95 5.99 6.04 6.08 6.13 6.18 6.23 90 6.28 6.34 6.41 6.48 6.55 6.64

12、 6.75 6.88 7.05 7.33 百分率-概率單位換算表（二）急性毒性實(shí)驗(yàn)的其他方法 經(jīng)典的急性毒性試驗(yàn)和LD50的缺點(diǎn)：消耗的動(dòng)物量大獲得的信息有限測得的LD50值實(shí)際上僅是近似值 五種化合物的LD50值的實(shí)驗(yàn)室間變異化合物 范圍(mg/kg) 比值(最大值最小值)五氯酚 74620 8.38 水楊酸鈉 9302328 2.50苯胺 4791169 2.44乙酰苯胺 7233060 4.23氯化鎘 105482 4.59單次口服固定劑量試驗(yàn)法結(jié)果的評價(jià)劑量(mg/kg) 試 驗(yàn) 結(jié) 果 存活數(shù)2000mg/kg 用2000mg/kg試驗(yàn) 2000.0 用500mg/kg試驗(yàn) 該化合物

13、無嚴(yán)重急性中毒的危險(xiǎn)性 1、固定劑量法 2、急性毒性分級法 3. 上、下移動(dòng)法(updown method)或階梯法 第二個(gè)動(dòng)物接受化學(xué)物的劑量由第一只動(dòng)物染毒后的反應(yīng)決定，如果動(dòng)物死亡，則下一個(gè)劑量降低；如果動(dòng)物存活則下一個(gè)劑量增高，但是實(shí)驗(yàn)需要選擇一個(gè)比較合適的劑量范圍，使得大部分的動(dòng)物所接受的化學(xué)物劑量都會(huì)在真正的平均致死劑量左右。 三、急性毒性分級 目前國際上對外源化學(xué)物急性毒性分級的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。 外源化學(xué)物急性毒性分級(WHO)毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小時(shí)死亡24只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(mg/kg)對人可能致死劑量單位體重（g/kg ）總重(

14、g/60kg)劇毒高毒中等毒低毒微毒1150500500001010100100010000554435021800.050.050.55150.1330251000我國食品毒理急性毒性分級法1994急性毒性分級 大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg) 大致相當(dāng)于體重為 70kg人的致死劑量6級(極毒) 1 稍嘗，7滴5級(劇毒) 150 7滴1茶匙4級(中等毒) 51500 1茶匙35克3級(低毒) 5015000 35350克2級(實(shí)際無毒) 500115000 3501050克1級(無毒) 15000 1050克 課后作業(yè)為什么用LD50作為比較化合物急性毒性的指標(biāo)？有何優(yōu)缺點(diǎn)？如何克服？第三節(jié)

15、 亞慢性、慢性毒性及其評價(jià)方法一、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的概念 亞慢性毒性(subchronic toxicity)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)(通常13個(gè)月)重復(fù)染毒外源化學(xué)物所引起的毒性效應(yīng)； 慢性毒性(chronic toxiciy)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長期染毒外源化學(xué)物所引起的毒性效應(yīng)。一般是連續(xù)染毒6個(gè)月至兩年，甚至終生染毒。二、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的目的 1. 確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應(yīng)譜,并發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)的毒作用； 2. 研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官； 3. 研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作

16、用的劑量(NOAEL)，提出此受試物的安全限量參考值； 4. 研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性； 5. 亞慢性毒性試驗(yàn)為慢性毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)及觀察指標(biāo)選擇提供依據(jù)； 6. 確定不同動(dòng)物物種對受試物亞慢性和慢性毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。三、亞慢性毒性和慢性毒性的評價(jià)方法（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 一般要求兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一種為嚙齒類，另一種為非嚙齒類。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最好為純系甚至同窩動(dòng)物均勻分布于各劑量組。雌雄各半。亞慢性實(shí)驗(yàn)每組20只以上大鼠，慢性實(shí)驗(yàn)每組40100只。亞慢性毒性試驗(yàn)動(dòng)物的體重(年齡)應(yīng)較小，如小鼠應(yīng)為15g左右，大鼠100g左右。慢性毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物年齡應(yīng)更小，大鼠和小

17、鼠應(yīng)為初斷奶者。（二）染毒途徑 盡量模擬人類的接觸方式；應(yīng)與預(yù)期進(jìn)行慢性毒理試驗(yàn)的接觸途徑相一致。 染毒時(shí)間每日應(yīng)定時(shí)，以維持動(dòng)物血液中濃度穩(wěn)定。 常用的染毒途徑是經(jīng)胃腸道、經(jīng)呼吸道和皮膚染毒。（三）染毒期限 工業(yè)接觸毒物：亞慢性毒性13個(gè)月，慢性毒性6個(gè)月 環(huán)境毒物：亞慢性毒性36個(gè)月，慢性毒性12個(gè)月以上 如果慢性毒性實(shí)驗(yàn)與致癌實(shí)驗(yàn)結(jié)合，染毒期限最好是接近或等于終生染毒。動(dòng)物研究期限相當(dāng)于壽命期()和人染毒的時(shí)間物種研究期限(月)相當(dāng)于壽命期()研究期限(月)相當(dāng)于人(月)13612241361224大鼠4.112.025.04999 34 101202 404 808兔1.44.59.0

18、18.36 12 36 72 145 289狗0.822.54.99.8206.5 20 40 81162豬0.822.54.99.8206.5 20 40 81162猴0.551.6 3.36.6134.5 13 27 61107（四）劑量分組 至少3個(gè)劑量組和1個(gè)對照組。 高劑量組：出現(xiàn)較明顯的毒性效應(yīng)，死亡率小于10或無死亡 中劑量組：輕微毒性，即觀察到最低有害作用劑量（LOAEL） 低劑量組：不出現(xiàn)中毒反應(yīng)，即未觀察到有害作用劑量（NOAEL） 亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)：可參考兩個(gè)數(shù)值，一是以急性毒性的閾劑量為亞慢性試驗(yàn)的最高劑量；一是以此化合物L(fēng)D50的1/201/5為最高劑量。 慢性毒性實(shí)驗(yàn)

19、：劑量的選擇可參考三組數(shù)據(jù)。1、亞慢性NOAEL或其1/5 1/2劑量為慢性毒性試驗(yàn)的最高劑量，以這一閾劑量的1/501/10為慢性毒性試驗(yàn)的預(yù)計(jì)閾劑量組，并以其1/100為預(yù)計(jì)的慢性無作用劑量組2、亞慢性試驗(yàn)的LOAEL的1/2、1/4、1/8分三組3、急性毒性的LD50劑量為出發(fā)點(diǎn)，即以LD50 的1/10劑量為慢性試驗(yàn)的最高劑量。以LD50的1/100為預(yù)計(jì)慢性閾劑量，以LD50 的1/1000為預(yù)計(jì)的無作用劑量組。（五）觀察指標(biāo)1、中毒癥狀：每日觀察動(dòng)物有無中毒癥狀和程度，外觀和行為有無異常2、體重：每周稱重一次3、食物利用率：記錄每日飼料消耗量，計(jì)算食物利用率（每攝入100g飼料所增長的體重克數(shù)）。4、實(shí)驗(yàn)室檢查（1）血液學(xué)檢查（2）尿液檢查（3）血液生化檢查5、病理及病理組織學(xué)檢查 凡是在實(shí)驗(yàn)過程中死亡的動(dòng)物均應(yīng)及時(shí)解剖檢查，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有動(dòng)物都要?dú)⑺罊z查。慢性毒性實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)中期進(jìn)行一次檢查。（1）系統(tǒng)解剖：包括肉眼觀察動(dòng)物固定在解剖板上，解剖頸部(頜下腺、腮腺、局部淋巴結(jié)等) 取一側(cè)乳腺及腹部皮膚；開腹并擴(kuò)展切口(胰、脾、生殖器官、腎、腎上腺、直腸、胃、十二指腸、空腸、回腸、腸系膜淋巴結(jié)、肝臟等) 開胸(舌、喉、氣管、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、心、肺、胸腺) 剝離左后肢(肌肉、坐骨神經(jīng)、股骨)；頭皮、耳； 開顱(顱神經(jīng)、