1、第8章發(fā)酵過(guò)程控制每種微生物對(duì)溫度的要求可用最適溫度、最高溫度、最低溫度來(lái)表征。在最適溫度下，微生物生長(zhǎng)迅速；超過(guò)最高溫度微生物即受到抑制或死亡；在最低溫度范圍內(nèi)微生物尚能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度非常緩慢，世代時(shí)間無(wú)限延長(zhǎng)。在最低和最高溫度之間，微生物的生長(zhǎng)速率隨溫度升高而增加，超過(guò)最適溫度后，隨溫度升高，生長(zhǎng)速率下降，最后停止生長(zhǎng)，引起死亡。 發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制微生物受高溫的傷害比低溫的傷害大，即超過(guò)最高溫度，微生物很快死亡；低于最低溫度，微生物代謝受到很大抑制，并不馬上死亡。這就是菌種保藏的原理。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制1、微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜結(jié)構(gòu)物理化學(xué)性質(zhì)有密切關(guān)系根

2、據(jù)細(xì)胞膜的液體鑲嵌模型，細(xì)胞在正常生理?xiàng)l件下，膜中的脂質(zhì)成分應(yīng)保持液晶狀態(tài)，只有當(dāng)細(xì)胞膜處于液晶狀態(tài)，才能維持細(xì)胞的正常生理功能，使細(xì)胞處于最佳生長(zhǎng)狀態(tài)微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致。二、微生物與溫度相關(guān)性的原理發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制什么是液晶狀態(tài)？液晶狀態(tài)是指某些有機(jī)物在發(fā)生固相到液相轉(zhuǎn)變時(shí)的過(guò)渡狀態(tài)稱為液晶態(tài)。由固態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐壕B(tài)的溫度稱為熔點(diǎn)，以T1表示；由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)的溫度稱為清亮點(diǎn)，以T2表示。T1與T2之間的溫度稱為液晶溫度范圍。那么為什么不同微生物對(duì)溫度的要求不同呢？根據(jù)細(xì)胞膜脂質(zhì)成分分析表明，不同最適溫度生長(zhǎng)的微生物，其膜內(nèi)磷脂組成有很大區(qū)別。嗜熱菌只含飽

3、和脂肪酸，而嗜冷菌含有較高的不飽和脂肪酸。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)人們采用二種方案來(lái)研究酶在低溫條件下的結(jié)構(gòu)完整性和催化功能：(1)通過(guò)自然或誘導(dǎo)突變，將特定殘基發(fā)生改變的蛋白與其天然結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比；(2)對(duì)比同屬嗜熱、嗜溫及嗜冷菌的蛋白結(jié)構(gòu)通過(guò)對(duì)嗜冷酶的蛋白質(zhì)模型和x一射線衍射分析表明，嗜冷酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強(qiáng)，酶結(jié)構(gòu)的柔韌性增加，使酶在低溫下容易被底物誘導(dǎo)產(chǎn)生催化作用發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制 嗜冷菌具有在0合成蛋白質(zhì)的能力。這是由于其核糖體、酶類以及細(xì)胞中的可溶性因子等對(duì)低溫的適應(yīng)，蛋白質(zhì)翻譯的錯(cuò)誤率最低。許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質(zhì)，一方面是由于

4、其核糖體對(duì)低溫的不適應(yīng)，翻譯過(guò)程中不能形成有效的起始復(fù)合物，另一方面是由于低溫下細(xì)胞膜的破壞導(dǎo)致氨基酸等內(nèi)容物的泄露。3、蛋白質(zhì)合成發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制4、合成冷休克蛋白低溫微生物適應(yīng)低溫的另一機(jī)制是合成冷休克蛋白將大腸桿菌從370C突然轉(zhuǎn)移到100C條件時(shí)細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)合成一組冷休克蛋白，它們對(duì)低溫的生理適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，檢測(cè)嗜冷酵母的冷休克反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)冷刺激后冷休克蛋白在很短時(shí)間內(nèi)大量產(chǎn)生。耐冷菌由于生活在溫度波動(dòng)的環(huán)境中，它們必須忍受溫度的快速降低，這與它們產(chǎn)生的冷休克蛋白是密切相關(guān)的。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制二、溫度的影響與控制（一）溫度對(duì)發(fā)酵的影響1、溫度影響反應(yīng)速率

5、發(fā)酵過(guò)程的反應(yīng)速率實(shí)際是酶反應(yīng)速率，酶反應(yīng)有一個(gè)最適溫度。從阿累尼烏斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 積分得 E=E活化能Kr速率常數(shù)發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制K與溫度有關(guān)E越大溫度變化對(duì)K的影響越大發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制溫度對(duì)菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成的影響可能是不同的青 霉 素120C300C發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制2、溫度影響發(fā)酵方向四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時(shí)產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當(dāng)溫度低于300C時(shí)，這種菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達(dá)到350C時(shí)，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。溫度還影響基質(zhì)溶解度，氧在發(fā)

6、酵液中的溶解度也影響菌對(duì)某些基質(zhì)的分解吸收。因此對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度要嚴(yán)格控制。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制（二）最適溫度的選擇1、根據(jù)菌種及生長(zhǎng)階段選擇微生物種類不同，所具有的酶系及其性質(zhì)不同，所要求的溫度范圍也不同。如黑曲霉生長(zhǎng)溫度為370C，谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌的生長(zhǎng)溫度為30320C，青霉菌生長(zhǎng)溫度為300C。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制在發(fā)酵前期由于菌量少，發(fā)酵目的是要盡快達(dá)到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長(zhǎng)迅速；在中期菌量已達(dá)到合成產(chǎn)物的最適量，發(fā)酵需要延長(zhǎng)中期，從而提高產(chǎn)量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。因?yàn)樵谏缘蜏囟认掳被岷铣傻鞍踪|(zhì)和核酸的正常途徑

7、關(guān)閉得比較嚴(yán)密有利于產(chǎn)物合成。發(fā)酵后期，產(chǎn)物合成能力降低，延長(zhǎng)發(fā)酵周期沒(méi)有必要，就又提高溫度，刺激產(chǎn)物合成到放罐。如四環(huán)素生長(zhǎng)階段280C，合成期260C后期再升溫；黑曲霉生長(zhǎng)370C，產(chǎn)糖化酶32340C。但也有的菌種產(chǎn)物形成比生長(zhǎng)溫度高。如谷氨酸產(chǎn)生菌生長(zhǎng)30320C，產(chǎn)酸34370C。最適溫度選擇要根據(jù)菌種與發(fā)酵階段做試驗(yàn)。根據(jù)生長(zhǎng)階段選擇發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制例：林可霉素發(fā)酵的變溫培養(yǎng)問(wèn)題的提出接種后10h左右已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨后是10h左右的加速生長(zhǎng)期，在40h左右對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期基本完成，在50h左右轉(zhuǎn)入生產(chǎn)期主要問(wèn)題：如何維持適度的菌體濃度和延長(zhǎng)分泌期？適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度可以延緩

8、菌體的衰老和維持相當(dāng)數(shù)量的有強(qiáng)生產(chǎn)能力的菌絲體存在根據(jù)生長(zhǎng)階段選擇溫度發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制變溫培養(yǎng)的正交設(shè)計(jì)發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制結(jié)論：前60h按31控制，縮短了適應(yīng)期使發(fā)酵提前轉(zhuǎn)入生產(chǎn)階段，同時(shí)菌絲體已有相當(dāng)量的積累，為大量分泌抗生素提供了物質(zhì)基礎(chǔ)60小時(shí)后將罐溫降至3O使與抗生素合成有關(guān)的酶的活性增強(qiáng)，抗生素分泌量有所增加，同時(shí)因分泌期的延長(zhǎng)有利于進(jìn)一步積累抗生素發(fā)酵進(jìn)入后期罐溫再回升至31 使生產(chǎn)菌在生命的最后階段最大限度的合成和排出次級(jí)代謝產(chǎn)物。溫度變化及其控制2、根據(jù)培養(yǎng)條件選擇溫度選擇還要根據(jù)培養(yǎng)條件綜合考慮，靈活選擇。通氣條件

9、差時(shí)可適當(dāng)降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。培養(yǎng)基稀薄時(shí)，溫度也該低些。因?yàn)闇囟雀郀I(yíng)養(yǎng)利用快，會(huì)使菌過(guò)早自溶。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制3、根據(jù)菌生長(zhǎng)情況菌生長(zhǎng)快，維持在較高溫度時(shí)間要短些；菌生長(zhǎng)慢，維持較高溫度時(shí)間可長(zhǎng)些。培養(yǎng)條件適宜，如營(yíng)養(yǎng)豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長(zhǎng)?？偟膩?lái)說(shuō)，溫度的選擇根據(jù)菌種生長(zhǎng)階段及培養(yǎng)條件綜合考慮。要通過(guò)反復(fù)實(shí)踐來(lái)定出最適溫度。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制三、發(fā)酵過(guò)程引起溫度變化的因素（一）發(fā)酵熱Q發(fā)酵發(fā)酵熱是引起發(fā)酵過(guò)程溫度變化的原因。所謂發(fā)酵熱就是發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量。什么叫凈熱量呢？在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生菌分解基質(zhì)產(chǎn)生

10、熱量，機(jī)械攪拌產(chǎn)生熱量，而罐壁散熱、水分蒸發(fā)、空氣排氣帶走熱量。這各種產(chǎn)生的熱量和各種散失的熱量的代數(shù)和就叫做凈熱量。發(fā)酵熱引起發(fā)酵液的溫度上升。發(fā)酵熱大，溫度上升快，發(fā)酵熱小，溫度上升慢?，F(xiàn)在來(lái)分析發(fā)酵熱產(chǎn)生和散失的各因素。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制1、生物熱Q生物在發(fā)酵過(guò)程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來(lái)，這散發(fā)出來(lái)的熱就叫生物熱。微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制生物熱與發(fā)酵類型有關(guān)微生物進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生的熱比

11、厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的熱多一摩爾葡萄糖徹底氧化成CO2和水好氧：產(chǎn)生287.2千焦耳熱量， 183千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?104.2千焦以熱的形式釋放厭氧：產(chǎn)生22.6千焦耳熱量， 9.6千焦耳轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣芑衔?13千焦以熱的形式釋放二個(gè)例子中轉(zhuǎn)化為高能化合物分別為63.7和42.6發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制 培養(yǎng)過(guò)程中生物熱的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的時(shí)間性。生物的大小與呼吸作用強(qiáng)弱有關(guān)在培養(yǎng)初期，菌體處于適應(yīng)期，菌數(shù)少，呼吸作用緩慢，產(chǎn)生熱量較少。菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，菌體繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌體也較多，所以產(chǎn)生的熱量多，溫度上升快，必須注意控制溫度。培養(yǎng)后期，菌體已基本上停止繁殖，主要靠菌體內(nèi)的酶系進(jìn)行

12、代謝作用，產(chǎn)生熱量不多，溫度變化不大，且逐漸減弱。如果培養(yǎng)前期溫度上升緩慢，說(shuō)明菌體代謝緩慢，發(fā)酵不正常。如果發(fā)酵前期溫度上升劇烈，有可能染菌，此外培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)越豐富，生物熱也越大。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制2、攪拌熱Q攪拌在機(jī)械攪拌通氣發(fā)酵罐中，由于機(jī)械攪拌帶動(dòng)發(fā)酵液作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，造成液體之間，液體與攪拌器等設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生可觀的熱量。攪拌熱與攪拌軸功率有關(guān)，可用下式計(jì)算： Q攪拌P8604186.8（焦耳/小時(shí)） P攪拌軸功率 4186.8機(jī)械能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮艿臒峁Ξ?dāng)量電機(jī)功率P= E額定電壓I額定電流cos功率因素，1千瓦時(shí)8604186.8焦耳發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制3、蒸發(fā)熱Q蒸發(fā)

13、 通氣時(shí)，引起發(fā)酵液的水分蒸發(fā)，水分蒸發(fā)所需的熱量叫蒸發(fā)熱。此外，排氣也會(huì)帶走部分熱量叫顯熱Q顯熱，顯熱很小，一般可以忽略不計(jì)。4、輻射熱Q輻射發(fā)酵罐內(nèi)溫度與環(huán)境溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過(guò)罐體向外輻射。輻射熱的大小取決于罐溫與環(huán)境的溫差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超過(guò)發(fā)酵熱的5。Q發(fā)酵Q生物Q攪拌Q蒸發(fā)Q輻射發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制（二）發(fā)酵熱的測(cè)定有二種發(fā)酵熱測(cè)定的方法。一種是用冷卻水進(jìn)出口溫度差計(jì)算發(fā)酵熱。在工廠里，可以通過(guò)測(cè)量冷卻水進(jìn)出口的水溫，再?gòu)乃砩系弥啃r(shí)冷卻水流量來(lái)計(jì)算發(fā)酵熱。Q發(fā)酵GCm(T出T進(jìn))Cm水的比熱G冷卻水流量另一種是根據(jù)罐溫上升速率來(lái)計(jì)算。先自控，

14、讓發(fā)酵液達(dá)到某一溫度，然后停止加熱或冷卻，使罐溫自然上升或下降，根據(jù)罐溫變化的速率計(jì)算出發(fā)酵熱。發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制根據(jù)化合物的燃燒值估算發(fā)酵過(guò)程生物熱的近似值。因?yàn)闊嵝?yīng)決定于系統(tǒng)的初態(tài)和終態(tài)，而與變化途徑無(wú)關(guān)，反應(yīng)的熱效應(yīng)可以用燃燒值來(lái)計(jì)算，特別是有機(jī)化合物，燃燒熱可以直接測(cè)定。反應(yīng)熱效應(yīng)等于反應(yīng)物的燃燒熱總和減去生成物的燃燒熱的總和。H（H）反應(yīng)物（H）產(chǎn)物如谷氨酸發(fā)酵中主要物質(zhì)的燃燒熱為：葡萄糖 159555.9KJ/Kg谷氨酸 15449.3KJ/Kg玉米漿 12309.2KJ/Kg菌體 20934KJ/Kg尿素 10634.5KJ/Kg發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制可根據(jù)實(shí)測(cè)

15、發(fā)酵過(guò)程中物質(zhì)平衡計(jì)算生物熱。例如某味精廠50M3發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程測(cè)定結(jié)果的主要物質(zhì)變化如表：發(fā)酵時(shí)間（h）0661212181831糖3730.324.041.7谷氨酸 5.9 15.4 23.9尿素2.96.0菌體 4.8 6.0 1.2玉米漿2.43.00.6發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵1218小時(shí)的生物熱為：Q生物24159555.90.612309.2610634.51.22093415.415449.3191098.1KJ/M3191098.1631849.7每小時(shí)的生物熱為31849.7KJ/M3發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制四、利用溫度控制提高產(chǎn)量例1 利用熱沖擊處理技術(shù)提高發(fā)

16、酵甘油的產(chǎn)量背景：（1）酵母在比常規(guī)發(fā)酵溫度髙10200C的溫度下經(jīng)受一段時(shí)間刺激后，胞內(nèi)海藻糖的含量顯著增加。（2）Lewis發(fā)現(xiàn)熱沖擊能提高細(xì)胞對(duì)鹽滲透壓的耐受力（3）Toshiro發(fā)現(xiàn)熱沖擊可使胞內(nèi)3磷酸甘油脫氫酶的活力提高1525，并導(dǎo)致甘油產(chǎn)量提高發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制實(shí)驗(yàn)：甘油發(fā)酵是在髙滲透壓環(huán)境中進(jìn)行的，因此可望通過(guò)熱沖擊來(lái)提高發(fā)酵甘油的產(chǎn)量正交條件A 沖擊溫度（0C） 40，45，50 B 開(kāi)始時(shí)機(jī)（h） 8，16，30 C 沖擊時(shí)間（分） 15，30，60結(jié)果發(fā)酵16小時(shí)，450C沖擊30分鐘最佳，發(fā)酵96小時(shí)后甘油濃度提高32.6，發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)見(jiàn)圖（A）16h,450C

17、,30min（B）12h,450C,30min發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制A 溫度；B 開(kāi)始時(shí)機(jī)；C 沖擊時(shí)間發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制A比B好發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制例2 重組大腸桿菌人Cu/Zn-SOD的高表達(dá)Lac啟動(dòng)子，用乳糖作誘導(dǎo)劑 270C 300C 340C 370CSOD 4966 14270 6590 4638比活 810 1471 679 526蛋白 6.129 9.70 9.79 11.88OD600 7.41 10.72 11.78 24.77發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制原因：1、乳糖被用于合成菌體和其它蛋白，減少了合成SOD的原料，隨

18、著溫度升高，蛋白和菌濃都增加。2、高溫下可能SOD降解速率增加，雜蛋白增加3、低溫下由于比生長(zhǎng)速率低，質(zhì)粒脫落減少4、低溫下菌的衰老減緩，死亡率低發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制小 結(jié)微生物最適生長(zhǎng)溫度微生物對(duì)溫度的要求不同與它們的膜結(jié)構(gòu)有關(guān)微生物的生長(zhǎng)溫度與細(xì)胞膜的液晶溫度范圍相一致微生物對(duì)溫度的要求與酶分子結(jié)構(gòu)的區(qū)別有關(guān)，如蛋白構(gòu)象穩(wěn)定性因素改變，活性位點(diǎn)關(guān)鍵區(qū)域氨基酸的取代，離子束縛作用(ion binding)減弱，蛋白核心區(qū)域疏水作用下降等發(fā)酵工程控制溫度變化及其控制溫度對(duì)發(fā)酵的影響：溫度影響反應(yīng)速率溫度影響發(fā)酵方向最適溫度的選擇根據(jù)菌種生長(zhǎng)階段選擇根據(jù)培養(yǎng)條件選擇菌種的生長(zhǎng)情況發(fā)酵工程控制