1、三種不同檢測(cè)方法對(duì)診斷結(jié)核病的比較池云生張東浩吉林省結(jié)核病醫(yī)院檢驗(yàn)科130500【摘要】 目的 將診斷結(jié)核病的蛋白芯片法與金標(biāo)法及抗酸染色法三種檢測(cè)方 法進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)三種方法在臨床中的應(yīng)用價(jià)值。方法用蛋白芯片法、金標(biāo) 法及抗酸染色法檢測(cè)125例確診結(jié)核病人、50例肺部其它疾病患者和健康體檢 者的血清標(biāo)本，并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果蛋白芯片法、金標(biāo)法及抗酸染色法 檢出結(jié)核分枝桿菌的靈敏度為64%，72%及22.7%，前兩者比較無(wú)顯著性差異 (P0.05)，但均高于抗酸染色法(P0.05)。三者的特異性分別為90%，76.7%及 96.7%。結(jié)論蛋白芯片法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，與金標(biāo)法及抗酸染色法比

2、較，具有 簡(jiǎn)便、快速、敏感性較高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是臨床輔助診斷結(jié)核病的有效方法?！娟P(guān)鍵詞】 蛋白芯片；結(jié)核分枝桿菌；比較；診斷結(jié)核病是嚴(yán)重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病，被列入我國(guó)法定重大傳染 病。為了實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目標(biāo)，臨床上現(xiàn)已開展了多種針對(duì)于結(jié) 核病診斷的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)項(xiàng)目。我院以開展的檢測(cè)項(xiàng)目有蛋白芯片法、金標(biāo)法、抗 酸染色法、PCR-熒光探針?lè)?、結(jié)核菌培養(yǎng)等多種方法。根據(jù)臨床應(yīng)用情況，現(xiàn)就 相對(duì)簡(jiǎn)便易行的蛋白芯片法、金標(biāo)法、抗酸染色法進(jìn)行比較，來(lái)評(píng)價(jià)三種方法在 臨床中的應(yīng)用價(jià)值，以便更好地為結(jié)核病防治的臨床應(yīng)用提供及時(shí)準(zhǔn)確的信息。結(jié)核蛋白質(zhì)芯片(protein chip，

3、PC)是近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種 新方法，其基本原理是以微孔濾膜為載體，利用微陣列技術(shù)將純化的結(jié)核菌脂阿 拉伯甘露糖(LAM)、蛋白16 KDa(rTPA16)和38KDa(rTPA38)等三種抗原固相于 同一膜片上，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，再以免疫金作為標(biāo)記物在膜 上顯色，然后放入芯片閱讀儀，在專門軟件的支持下對(duì)抗原點(diǎn)陣的灰度值進(jìn)行分 析，以達(dá)到檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的目的。為了評(píng)價(jià)此方法的臨床應(yīng)用價(jià)值，本文將 此法與免疫膠體金法及常規(guī)的抗酸染色法作一比較，現(xiàn)報(bào)告如下：1材料與方法1.1材料標(biāo)本來(lái)源：125例確診結(jié)核病人血清由我院內(nèi)科肺結(jié)核確診病人 提供，50例肺部其它疾病患者和

4、健康體檢者的血清來(lái)源于本院胸外科、內(nèi)科和 門診體檢人員。 主要儀器和試劑：蛋白芯片閱讀儀、結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片 試劑盒均為南京大淵生物技術(shù)公司提供；結(jié)核分枝桿菌免疫膠體金診斷試劑盒為 上海奧普生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；抗酸染色相關(guān)試劑，根據(jù)全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作 規(guī)程（第3版）由實(shí)驗(yàn)室自行配置。1.2方法1.2.2蛋白芯片法：在芯片上標(biāo)記上樣品編號(hào)，在芯片盒窗口內(nèi)滴加200p l 試劑A，使膜表面完全浸濕；將待檢血清100 l加入窗口中，待血清完全滲入 后，再滴加300 p l試劑B；待試劑B完全滲入后，滴加500 p l試劑C；待試 劑C完全滲入后，最后滴加300p l試劑D；反應(yīng)完畢后30 min內(nèi)

5、，將芯片放入 芯片識(shí)別儀進(jìn)行結(jié)果分析。在確保沒有開啟任何應(yīng)用程序的情況下，把芯片盒內(nèi) 的小光盤放人光驅(qū)，機(jī)器會(huì)自動(dòng)進(jìn)入“生物芯片檢測(cè)軟件”，然后按程序操作， 并打印出分析結(jié)果。結(jié)核桿菌3種特異性抗體，即抗脂阿拉伯甘露糖（LAM）、16KDa 及38KDa抗體，如果任一抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，結(jié)果則判為陽(yáng)性。整個(gè)操作過(guò)程需 30min左右。1.2.2金標(biāo)法（DIGFA）：利用結(jié)核桿菌特異性外膜抗原，采用斑點(diǎn)免疫金滲濾 試驗(yàn)（DIGFA）原理進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按說(shuō)明書進(jìn)行操作。1.2.3抗酸染色法（AFS）:參照全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第3版。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析概率的比較采用X2檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1 175例標(biāo)本三種

6、檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷的關(guān)系 見表1。表1 175例標(biāo)本三種檢測(cè)結(jié)果比較分組#PC檢出率（%）DIGFA檢出率（%）AFS檢出率（%）結(jié)核組12564 (80/125)72 (90/125)22.7 (33/125)對(duì)照組5010(5/50)23.3(12/50)3.3(2/50)注：P0.05（與對(duì)照組比較），P0.05（與AFS法比較）。2.2三種檢測(cè)方法的靈敏度、特異性比較蛋白芯片法、金標(biāo)法及抗酸染色法檢 出結(jié)核分枝桿菌的靈敏度為64%，72%及22.7%，特異性分別為90%，76.7%及96.7%。2.3蛋白芯片法結(jié)核病組三種結(jié)核茵抗原的抗體構(gòu)成比 三種結(jié)核菌抗原的抗 體陽(yáng)性率以抗LAM抗

7、體的陽(yáng)性率最高，為57.33%（72/125），其次為抗38KDa 抗體44%（55/125），最低為抗16KDa抗體20% （25/125）。三種抗體各組合結(jié)果見表2。表2結(jié)核病組三種結(jié)核菌抗原的抗體構(gòu)成比LAM16KDa38KDan百分比（%）+1411.2+4032+1512+75.6+10.8+32.445363討論20世紀(jì)90年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得的飛速發(fā)展，研究者 也將分子生物學(xué)的原理引入了結(jié)核試驗(yàn)研究范圍。自1989年其被引入結(jié)核病的 診斷以來(lái)，立即成為結(jié)核病細(xì)菌學(xué)診斷領(lǐng)域中備受關(guān)注的焦點(diǎn)。結(jié)核蛋白芯片即 是利用結(jié)核菌的特異性細(xì)胞壁脂多糖抗原LAM和經(jīng)基因工程重組

8、DNA技術(shù)生產(chǎn) 純化的38KDa及16KDa特異性抗原固相于同一膜片上，使抗原抗體反應(yīng)在固相膜 上快速進(jìn)行，再以免疫金作為標(biāo)記物在膜上顯色，以用于結(jié)核病的臨床檢測(cè)。LAM是分枝桿菌屬細(xì)胞壁的重要組成部分，屬特異性抗原，具有較強(qiáng)的免疫 原性，其檢測(cè)的靈敏度較高，但除結(jié)核分枝桿菌外，其它分枝桿菌也有LAM成 分，因此其特異性相對(duì)較低。結(jié)核分枝桿菌38KD抗原與16KD抗原是結(jié)核分枝桿 菌所特有的抗原，它與其它非結(jié)核分枝桿菌不存在交叉反應(yīng)，其診斷的特異性較 高。以上結(jié)果可見，結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片檢測(cè)結(jié)核的靈敏度為64%，特異性較 高，為90%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道基本一致。在125例結(jié)核病人中，有45例蛋白芯

9、片法 檢測(cè)為陰性，導(dǎo)致其靈敏度降低，這可能是某些結(jié)核病人的血液中產(chǎn)生抗原和相 應(yīng)抗體復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致游離抗體滴度降低，如低于設(shè)定顯示疾病的cutoff值， 則此時(shí)顯示為陰性。另外50例健康體檢者中有4例蛋白芯片法檢測(cè)為陽(yáng)性，這 可能是受潛伏結(jié)核或者環(huán)境中分枝桿菌污染的影響，或者是結(jié)核有效治療后的個(gè) 體其抗體依然存在多年所導(dǎo)致。金標(biāo)法使用的是用現(xiàn)代生物技術(shù)提純的結(jié)核分枝桿菌特異性外膜抗原，引進(jìn) 斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(DIGFA)原理，用于結(jié)核病IgG的檢測(cè)。本文顯示的靈敏度 和特異性分別為72%, 76.7%，與相關(guān)報(bào)道基本一致。從表1結(jié)果可看出，膠 體金結(jié)核抗體法存在一定程度的假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題

10、，假陽(yáng)性的產(chǎn)生可能是人群 感染結(jié)核桿菌十分普遍，部分人體對(duì)結(jié)核抗原反應(yīng)較強(qiáng)所致。另外就是金標(biāo)法采 用的是提純的結(jié)核分枝桿菌外膜抗原，難免會(huì)和其它非結(jié)核分枝桿菌發(fā)生交叉反 應(yīng)。假陰性產(chǎn)生的原因可能是：不同人群機(jī)體免疫水平存在差異；處于不同臨床 感染期的結(jié)核患者；血液中存在免疫抑制因子或抗原抗體復(fù)合物等因素，使機(jī)體 血清中結(jié)核抗體水平產(chǎn)生差異，從而產(chǎn)生假陰性。因此，在應(yīng)用膠體金結(jié)核抗體 快速檢測(cè)法時(shí)，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀與其它檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，并通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察， 從而進(jìn)行臨床診斷。在結(jié)核病的臨床診斷方法中，抗酸染色法雖然具有簡(jiǎn)便、快速、特異性高的 優(yōu)點(diǎn)，是目前最主要的結(jié)核確診手段，但其陽(yáng)性率較低，約2

11、535%，還存在 著大約65%75%涂片陰性或培養(yǎng)陰性可疑結(jié)核病的診斷問(wèn)題同。從結(jié)果可見， 結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片陽(yáng)性檢出率48.57% (85/175)顯著高于抗酸菌涂片鏡檢 法20% (30/175)，表明蛋白芯片結(jié)核抗體的檢測(cè)對(duì)于不排痰的結(jié)核病患者或者 涂片鏡檢陰性、不明原因的胸水、不能區(qū)別的結(jié)核病的鑒別診斷等具有重要意義， 能顯著提高檢測(cè)的靈敏度。另外在30例抗酸菌涂片鏡檢陽(yáng)性標(biāo)本中有2例蛋白 芯片法檢測(cè)為陰性，這可能是其它非結(jié)核分枝桿菌如戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝 桿菌所導(dǎo)致，同時(shí)也證實(shí)了蛋白芯片法診斷結(jié)核病較為特異。從表2可見，用LAM和2種重組結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原分別檢測(cè)不同的病 人

12、其反應(yīng)有所不同，究其原因，可能是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌抗原多而復(fù)雜，在宿主 體內(nèi)表達(dá)的數(shù)量、種類或時(shí)機(jī)可能隨病人的個(gè)體免疫背景和病程而異，從而表現(xiàn) 出不同的抗原譜所致。其中單一抗體陽(yáng)性率是17.6% (22/125)，兩種抗體陽(yáng)性 率是35.2% (44/125)，三種抗體陽(yáng)性率是11.2%(14、125)，所有抗體陽(yáng)性檢出 率是64%(80、125)。因此，針對(duì)結(jié)核多種抗原的蛋白芯片法在保證特異性的基 礎(chǔ)上提高了檢測(cè)的靈敏度。綜上所述，結(jié)核分枝桿菌蛋白芯片法診斷結(jié)核病，相對(duì)金標(biāo)法及抗酸染色法 而言，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性較高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是臨床輔助診斷結(jié)核病 的一種有效方法，值得在臨床推廣。金

13、標(biāo)法檢測(cè)試劑盒采用的純化的特異性外膜 蛋白抗原具有較高的免疫原性，特異性較強(qiáng)，本檢測(cè)法雖為單孔測(cè)定，但由于根 據(jù)結(jié)核病體液免疫反應(yīng)規(guī)律，對(duì)診斷結(jié)核血清抗體水平的界值作了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整， 使其靈敏度不致太高，因而能有效地區(qū)別現(xiàn)癥感染和既往感染，本文所測(cè)定結(jié)果 與國(guó)內(nèi)其他作者報(bào)告接近，基本達(dá)到臨床診斷作用，對(duì)肺結(jié)核的治療轉(zhuǎn)歸也有一 定的監(jiān)測(cè)作用?？顾崛旧z測(cè)結(jié)核桿菌的特異性高，但靈敏度很低，故一般 用于臨床以確診病人的排菌監(jiān)測(cè)。參考文獻(xiàn)：朱中元，王海波，劉愛國(guó)，等.抗結(jié)核分枝桿菌多種抗原的抗體檢測(cè)蛋白芯片研究.中 國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2004，4(6)： 907910.孔忠順，管波清，古淑香，等.血清抗脂阿拉伯甘露糖及38kD抗體檢測(cè)對(duì)涂陰肺結(jié) 核及肺外結(jié)核診斷價(jià)值.中國(guó)防癆雜志，2002，24(3)： 1401