1、個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)微陣列基因芯片技術(shù)規(guī)范前言微陣列基因芯片是基于DNA分子雜交技術(shù)原理研制，通過(guò)探針結(jié)合堿基互補(bǔ)序列的單鏈核酸，從而確定其相應(yīng)序列來(lái)識(shí)別基因或其產(chǎn)物。能夠同時(shí)快速檢測(cè)多個(gè)基因及其多個(gè)位點(diǎn)，在多態(tài)性分析、突變分析、基因表達(dá)譜測(cè)定及雜交測(cè)序等多領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。臨床診斷技術(shù)使用的微陣列基因芯片，可快速鑒定病原體、檢測(cè)遺傳突變及基因表達(dá)，更早更方便的檢測(cè)腫瘤基因標(biāo)志，檢測(cè)藥物反應(yīng)和代謝相關(guān)基因多態(tài)性來(lái)指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。本規(guī)范旨在對(duì)個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)中采用微陣列基因芯片檢測(cè)核酸序列以及基因表達(dá)進(jìn)行一般性技術(shù)指導(dǎo)，不包括行政審批要求。本規(guī)范由全國(guó)生物芯片標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAC/TC 42

2、1）提出。本規(guī)范起草單位：全國(guó)生物芯片標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)、清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院、生物芯片北京國(guó)家工程研究中心、北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所。本規(guī)范起草人：項(xiàng)光新、李元源、王輝、鄧濤、孫義民、張治位、張川、邢婉麗、程京。目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc389579853 1.適用范圍 1.適用范圍本規(guī)范適用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)開(kāi)展微陣列基因芯片個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)服務(wù)。檢測(cè)服務(wù)需遵循國(guó)家衛(wèi)生主管部門或各專業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布的疾病診療指南或國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委醫(yī)政醫(yī)管局個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)專家委員會(huì)發(fā)布的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)指南。2.聲明/警告本規(guī)范所稱微陣列基因芯片診斷技術(shù)是指從醫(yī)療機(jī)構(gòu)獲得的臨床樣本中，提取核酸

3、（DNA或RNA），進(jìn)行必要的擴(kuò)增和標(biāo)記，標(biāo)記后的靶標(biāo)與基因芯片進(jìn)行分子雜交，通過(guò)基因芯片掃描儀器獲得基因芯片雜交的圖像與數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)程序分析，并給出檢測(cè)報(bào)告的全過(guò)程。3.術(shù)語(yǔ)和定義（1）聚合酶鏈反應(yīng) polymerase chain reaction（PCR）聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反應(yīng)是一種對(duì)特定的DNA或RNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。（2）雜交 hybridization具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA）可以通過(guò)氫鍵的方式，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相結(jié)合。（3）突變 mutation是細(xì)胞中DNA核苷酸序列發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的改變。（4）點(diǎn)重復(fù) spot replicate

4、s每種探針在芯片上每個(gè)陣列中的重復(fù)次數(shù)。（5）探針 probe能夠與靶標(biāo)特異性結(jié)合的分子，多數(shù)情況下探針固定在基片上。（6）質(zhì)控探針quality control probe用來(lái)監(jiān)控芯片表面化學(xué)修飾、樣品制備和反應(yīng)過(guò)程等環(huán)節(jié)的質(zhì)量的探針。該探針只與反應(yīng)體系中外加的帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物的靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合，故可用于監(jiān)控探針和基片的結(jié)合質(zhì)量及探針和靶標(biāo)結(jié)合質(zhì)量等整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的質(zhì)量。（7）表面化學(xué)修飾質(zhì)控探針 surface modification control probe微陣列基因芯片上用來(lái)質(zhì)控基片的表面化學(xué)修飾質(zhì)量的探針。（8）內(nèi)標(biāo)探針 internal control probe微陣列基因芯

5、片上用來(lái)質(zhì)控檢測(cè)過(guò)程中核酸提取、擴(kuò)增反應(yīng)、芯片雜交反應(yīng)等過(guò)程是否正常的探針。（9）陽(yáng)性質(zhì)控探針 positive control probe設(shè)置在微陣列基因芯片上的質(zhì)控探針，無(wú)論被檢測(cè)樣品的結(jié)果如何，均能產(chǎn)生可以被識(shí)別的信號(hào)。（10）陰性質(zhì)控探針 negative control probe設(shè)置在微陣列基因芯片上的質(zhì)控探針，無(wú)論被檢測(cè)樣品的結(jié)果如何，均不會(huì)產(chǎn)生可被識(shí)別的信號(hào)。4.樣本處理4.1樣本類型樣本類型可以是全血、濾紙干血斑、新鮮組織、穿刺組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、腦脊液、骨髓、羊水、毛囊、精液、糞便、尿液、脫落細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、其他體液（如痰液）等。4.2樣本采集、運(yùn)輸與保存樣本采集

6、、運(yùn)輸與保存須遵循全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第四版)和個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南，其中新生兒濾紙干血斑采集須符合新生兒遺傳疾病篩查血片采集技術(shù)規(guī)范。樣本采集種類和采集量，如使用經(jīng)CFDA批準(zhǔn)的商品試劑，須按照所使用的商品微陣列基因芯片檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書規(guī)定。樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。對(duì)于提取DNA的樣本，可以在室溫（1825）下運(yùn)送，盡量在8 h之內(nèi)到達(dá)。如條件允許，樣本應(yīng)采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。如為RNA，短時(shí)間內(nèi)的運(yùn)送如10 min左右，可室溫下運(yùn)送，如為較長(zhǎng)時(shí)間，則應(yīng)在加冰條件下運(yùn)送，建議在4 h送至實(shí)驗(yàn)室。如條件允許，應(yīng)使用液氮或者保存在特殊試劑中運(yùn)輸。對(duì)于檢

7、測(cè)靶標(biāo)為DNA的樣本，在28可保存3天。對(duì)于檢測(cè)靶標(biāo)為RNA的樣本，一旦采集送到實(shí)驗(yàn)室后，則應(yīng)在-20以下凍存。如為血循環(huán)中的RNA，最好不要使用血清樣本，而應(yīng)使用EDTA抗凝盡快分離后的血漿樣本。臨床體液樣本長(zhǎng)期（超過(guò)兩周）保存應(yīng)在-70下。4.3樣本質(zhì)量保證（1）嚴(yán)格按照樣本采集規(guī)范進(jìn)行采集，正確運(yùn)輸，保存樣本；對(duì)采集、運(yùn)輸與保存過(guò)程不符規(guī)范的樣本，予以拒絕接收。對(duì)各種樣本類型應(yīng)按檢測(cè)要求建立采集的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）。（2）正確進(jìn)行樣本處理，嚴(yán)格按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書操作。（3）有專用的樣本核酸提取操作室，并配備相應(yīng)的專用儀器設(shè)備。（4）設(shè)定專人保管制度，詳細(xì)記錄樣本信息，保證樣本信

8、息不丟失、錯(cuò)位。4.4樣本信息保存被檢測(cè)樣本要求唯一編號(hào)，實(shí)驗(yàn)前仔細(xì)核對(duì)和檢查。實(shí)驗(yàn)室須具備樣本保存的基本條件，須配備數(shù)據(jù)保存及保證數(shù)據(jù)安全的軟、硬件設(shè)施，相關(guān)數(shù)據(jù)保存不少于5年。5.檢測(cè)各步驟分述5.1核酸分離采用微陣列基因芯片說(shuō)明書規(guī)定的方法或指定的商品化試劑盒。提取RNA時(shí)，須迅速滅活RNA酶防止對(duì)RNA的降解，須嚴(yán)格遵循已經(jīng)證明行之有效的提取方法和操作規(guī)范，比如須佩戴一次性手套口罩、使用RNase-free的試劑耗材等。5.2核酸定量（如適用）使用紫外分光光度計(jì)法或熒光染料法。在檢測(cè)核酸濃度時(shí)須注意：一是檢測(cè)核酸濃度的分光光度計(jì)（或者染料法使用的酶標(biāo)儀）須建立標(biāo)準(zhǔn)操作程序，并注意維護(hù)；

9、二是每次檢測(cè)前，須同時(shí)檢測(cè)已知濃度的對(duì)照樣本，確保濃度測(cè)定準(zhǔn)確。確認(rèn)特定檢測(cè)芯片的最低檢測(cè)限和檢測(cè)范圍，所提取核酸濃度和質(zhì)量須能滿足微陣列基因芯片的檢測(cè)需要，必要時(shí)純化、稀釋或濃縮。舉例來(lái)說(shuō)，遺傳性耳聾基因檢測(cè)芯片可以設(shè)定最低檢測(cè)限為100 ng/L人基因組DNA，檢測(cè)范圍為100 ng/L至300 ng/L人基因組DNA，核酸純度OD260/280=1.7-2.0，那么需要從臨床血液樣本中提取核酸，并用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，進(jìn)行必要的純化、稀釋或濃縮以滿足要求；若芯片設(shè)定最低檢測(cè)限為2 ng/L人基因組DNA，檢測(cè)范圍為2 ng/L至50 ng/L人基因組DNA，核酸純度OD260/280=1

10、.7-2.0，那么可以從臨床血液、血斑等說(shuō)明書中標(biāo)識(shí)的樣本中提取核酸，必要時(shí)用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，以及進(jìn)行純化、稀釋或濃縮以滿足要求。再舉例，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的微陣列芯片，對(duì)從臨床痰液中提取核酸，若說(shuō)明書中已經(jīng)規(guī)定了詳細(xì)步驟，并指出不必采用分光光度計(jì)檢測(cè)，那么可以省略核酸定量。5.3核酸擴(kuò)增和標(biāo)記擴(kuò)增反應(yīng)（如PCR、體外轉(zhuǎn)錄等）須遵循醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法，防止污染。熒光標(biāo)記為常用的樣品標(biāo)記方式，也可以對(duì)核酸樣品進(jìn)行納米金或磁珠等標(biāo)記。DNA樣品可在核酸擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)進(jìn)行RNA表達(dá)譜分析時(shí)，首先在體外把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行體外擴(kuò)增和熒光標(biāo)記。必要時(shí)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純

11、化。5.4芯片雜交按相應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的操作說(shuō)明將標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與雜交緩沖液混合，加到微陣列基因芯片上，放置于合適的溫度下雜交。雜交完成后，將芯片進(jìn)行洗滌干燥。5.5信號(hào)采集和數(shù)據(jù)分析使用基因芯片熒光掃描儀檢測(cè)微陣列基因芯片時(shí)，必須定期對(duì)掃描儀進(jìn)行校準(zhǔn)，通常為每周一次。設(shè)置合適的掃描參數(shù)，由軟件自動(dòng)分析得到信號(hào)值。需要采用專用算法程序得到檢測(cè)結(jié)果的，須由專業(yè)人員按照規(guī)定流程進(jìn)行分析。對(duì)于分析軟件判定為檢測(cè)失敗或者檢測(cè)位點(diǎn)信號(hào)丟失的樣本，須進(jìn)行重新檢測(cè)。重新檢測(cè)的過(guò)程同初次檢測(cè)一樣，包括核酸提取、擴(kuò)增、標(biāo)記，芯片雜交以及后續(xù)的圖像掃描及數(shù)據(jù)分析。6.結(jié)果報(bào)告被檢測(cè)樣本檢測(cè)報(bào)告須由專業(yè)結(jié)果報(bào)告系統(tǒng)按照統(tǒng)

12、一的標(biāo)準(zhǔn)格式自動(dòng)打印出報(bào)告，并給出具體檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)報(bào)告必須說(shuō)明檢測(cè)方法的局限性和適用范圍。檢測(cè)報(bào)告須由專業(yè)人員（具備相應(yīng)資質(zhì)的醫(yī)師）向被檢測(cè)者進(jìn)行解讀。7.質(zhì)量控制（1）微陣列基因芯片須符合中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布的DNA微陣列芯片通用技術(shù)條件（GB/T 28639-2012）所規(guī)定的性能要求。在每個(gè)陣列中應(yīng)設(shè)置表面化學(xué)修飾質(zhì)控探針、陽(yáng)性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、內(nèi)標(biāo)質(zhì)控探針以及空白對(duì)照。（2）微陣列基因芯片須經(jīng)過(guò)分析性能驗(yàn)證，包括檢測(cè)靈敏度、陽(yáng)性符合率、陰性符合率、批內(nèi)重復(fù)性。用靈敏度參考品對(duì)抽檢的微陣列基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的要求。用陽(yáng)性參考品對(duì)抽檢的微陣列

13、基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定陽(yáng)性符合率應(yīng)符合相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的要求。用陰性參考品對(duì)抽檢的微陣列基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定陰性符合率應(yīng)符合相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的要求。用重復(fù)性參考品對(duì)同一批生產(chǎn)的至少2張芯片的10個(gè)子陣列平行檢測(cè)，各次測(cè)定結(jié)果應(yīng)正確一致。（3）檢測(cè)相關(guān)儀器須獲得CFDA醫(yī)療器械注冊(cè)證書。儀器需定期維護(hù)和校驗(yàn)。（4）臨床基因芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室須按照醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量控制，并參加室間質(zhì)量評(píng)價(jià)或進(jìn)行有效的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。（5）須建立基因芯片診斷技術(shù)相關(guān)器材登記制度，保證基因芯片、基因提取標(biāo)記和分子雜交試劑的來(lái)源可追溯。不得違規(guī)重復(fù)使用一次性器材和試劑。（6）檢測(cè)人員上崗前須獲得臨床

14、基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員培訓(xùn)證書，同時(shí)相關(guān)操作須符合實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求（GB19489-2008）。8.注意事項(xiàng)（1）建立健全微陣列基因芯片檢測(cè)及相關(guān)數(shù)據(jù)的保密制度，對(duì)臨床微陣列基因芯片檢測(cè)獲得的基因診斷數(shù)據(jù)，應(yīng)保證僅用于被檢者本人的診斷和基于提高診斷水平所進(jìn)行的醫(yī)學(xué)科學(xué)研究。未經(jīng)被檢測(cè)者允許不得隨意公開(kāi)，傳播被檢測(cè)者檢測(cè)結(jié)果。（2）涉及遺傳基因信息的臨床檢測(cè)項(xiàng)目，被檢者須簽署知情同意書。9.參考文獻(xiàn)1 GB/T 27990-2011，生物芯片基本術(shù)語(yǔ)。2 GB/T 28639-2012，DNA微陣列芯片通用技術(shù)條件。3 GB 19489-2008，實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求。4 衛(wèi)生部辦公

15、廳?；蛐酒\斷技術(shù)管理規(guī)范(試行)。 20105 衛(wèi)生部辦公廳。醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法。20106 衛(wèi)生部辦公廳。新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010年版）。20107 衛(wèi)生部醫(yī)政司。全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第三版)。南京：東南大學(xué)出版社，20069 衛(wèi)計(jì)委醫(yī)政醫(yī)管局。個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南。待批準(zhǔn)。10 Clinical and laboratory standands institute (CLSI). Diagnostic nucleic acid microarrays, approved guideline. CLSI document MM12-A (ISBN 1-56238-608-5). 200611