1、1.概述結核桿菌菌體主要成份及其感染免疫過程答：菌體成份與作用結核桿菌無內毒素，也不產生外毒素和侵襲性酶類，其致病作用主要靠菌體成份，特別是胞壁中所含的大量脂質。脂質含量與結核桿菌的毒力呈平行關系，含量愈高毒力愈強。.脂質(Lipide):磷脂能刺激單核細胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶組織溶解不完全，形成干酷樣壞死。脂肪酸在脂質中比重較大，其中6,6二分枝酰a,a海澡糖(6,6Dimycocyla,aDtrehalose)具有破壞細胞線粒體膜，毒害微粒體酶類，抑制中性粒細胞游走和吞噬 作用，引起慢性肉牙腫。具有該物質的結核桿菌毒株，在液體培養(yǎng)基中能緊密粘成索狀，故稱為索狀因子(cor

2、dfactor)。蠟質 D為胞壁中的主要成分，是一種肽糖脂(Piptidoglycolipids)與分枝菌酸(My-colic acid)復合物，能引起遲發(fā)型變態(tài)反應，并具有佐劑作用。硫酸腦甘脂(salfatides)和硫酸多酰基化海澡糖(Multiasiylated trehalose salfate)在結核桿菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬細胞中的吞噬體與溶 酶體融合，使結核桿菌在細胞內存活。這一類糖脂能結合中性紅染料。產生中性紅反應，借此可鑒定結核桿菌有無毒力。.蛋白質(Protein):結核桿菌菌體內都含有數(shù)種蛋白質，其中重要的蛋白質是結核菌素(tuberculin)。結核茵素與蠟質D結合

3、，能引起較強的遲發(fā)型變態(tài)反應。其他蛋白質可引起機體產生相應 的 抗 體， 但 無 保 護 作 用。.多糖質(Polysuccharides):多糖質常與脂質結合存在于胞壁中，主要有半乳糖，甘露醇、阿 拉拍糖等。多糖質可使中性粒細胞增多，引起局部病灶細胞浸潤。.核酸(Nucleic acid):結核桿菌的核糖體核糖核酸(Ribonucleie acid ribosonic, rRNA)是本菌的免疫原，刺激機體產生特異性細胞免疫。機體感染結核分支桿菌 (Mycobacterium tuberculosis, MTB)后的免疫屬于有菌免疫，即只有MTB在體 內存在時才有免疫力，一旦體內的 MTB被殺

4、滅，免疫也隨之消失。機體對 MTB的抗感染免疫主要是細 胞免疫。其基本過程是：MTB侵入呼吸道后原肺?中的巨嗜細胞(M。)不能防止所吞噬的MTB生長，但可釋放大量炎癥因子，吸引血液中的單核細胞至局部病灶。這種單核細胞在致敏T細胞釋放的細胞因子的作用下可在病灶中殺死MTB。因此，集體針對MTB的細胞免疫是多細胞、多因子參與的復雜過程。免疫與變態(tài)反應：結核桿菌的免疫原rRNA和變應原結核菌素可誘發(fā)機體產生由T淋巴細胞介導的兩種免疫應答反應，即細胞免疫和遲發(fā)型變態(tài)反應。人類對結核桿菌的感染率很高，但發(fā)病率卻較低，這表明人體感染結核桿菌可獲得一定的抗結核 免疫力?？菇Y核免疫力的持久性，依賴于結核桿菌在

5、機體內的存活，一旦體內結核桿菌消亡，抗結核 免疫力也隨之消失，這種免疫稱為有菌免疫或傳染性免疫( Infection immunity )?？菇Y核免疫主要是細胞免疫，包括致敏的T淋巴細胞和被激活的巨噬細胞。致敏的T淋巴細胞可直接殺死帶有結核桿菌的靶細胞，同時對釋放多種作用于世噬細胞的淋巴因子，使巨噬細胞聚集在病 灶周圍形成以單核細胞為主的增生性炎癥。被激活的巨噬細胞極大地增強對結核桿菌的吞噬消化，抑 制繁殖，阻止擴散，甚至消毀的能力，充分分揮細胞免疫的作用。2.簡述結核桿菌基因組學、比較基因組學、轉錄組學與蛋白質組學研究進展。對結核分枝桿菌基因組學、蛋白質組學、后基因組學研究，可從一個細胞生命

6、整體去研究，能弄 清其致病機制、感染的方法，為結核分枝桿菌胞內生活周期、結核分枝桿菌病早期診斷、疫苗免疫、 新藥研發(fā)，提供堅厚的基礎。(1)基因組學1998年英國Sanger中心和法國 Pasteur研究所合作完成了結核分枝桿菌的全基因組測序工作， 并在2002年進行了重新注釋。全基因組序列由4.4Mb(4411529bp)組成，包才4411個基因，具有潛在編碼能力的基因約有3977個，約占90.2%;有3924個開放閱讀框，其中約40%有功能，44%1能有功能，16嘛為孤兒序列，與其它微生物的序列無相似性；基因組富含 GC堿基，G+C含量高達65.6%。DNA重復序列度高，可能與結核桿菌的修

7、復機制非常忠實有關。特征之一是：9磯因組編碼2個富含甘氨酸蛋白質新家簇；編碼富含甘氨酸的酸性蛋白質，占10%;這些蛋白與結核桿菌抗原變異、逃避免疫有關。另一個特征是，有大量編碼脂肪酸代謝酶的基因，大腸桿菌僅有50個，而結核桿菌有250多個；結核桿菌有FASI和FASII兩種脂肪酸合成酶系統(tǒng)；FASII型系統(tǒng)可合成臘樣的結核菌醇二分枝菌酸，它 是致病分枝桿菌細胞壁上的特有成分。結核分枝桿菌序列測定前確定的毒力因子僅3個過氧化物酶，其功能是抵抗宿主巨噬細胞產生的活性氧。序列測定后發(fā)現(xiàn)了一些新的毒力因子：分泌重復蛋白，與細菌在宿主內繁殖有關；具溶血活性蛋白質；與細菌入侵、存活有關過氧化氫酶；與細菌在

8、細胞內存活有關因子，包括調控細菌在細胞內存活狀況等。(2)分枝桿菌比較基因組學：結核桿菌復合菌群的各菌種在DNA水平上的同源性大于 99.95%。牛分枝桿菌 M. bovis和牛分枝桿菌BCG菌株的染色體內有 7個缺失區(qū)域(deleted regions RDs) 。提示結核桿菌復合菌群各菌種間的 缺失區(qū)域的分布與宿主特異性和毒力相關基因相一致。應用微陣列技術，檢測BCG不同子代菌株基因組的多樣性，共發(fā)現(xiàn) 16個RDs,某些RDs是某種菌株特異性的，全部BCG菌株均缺失9個RDs(61個ORF),但是H37Rv均未缺失這些區(qū)域。所有的BCG菌株缺失RD1區(qū)，但是其它結核桿菌復合菌群中菌種均未缺

9、失該區(qū)域。該區(qū)域缺失可以認為是BCGM毒的原因。綜合比較基因組分析的結果提示：現(xiàn)今使用的不同BCG菌株間遺傳的多樣性，其也可說明不同疫苗的抗結核的差異。由于位于基因兩側IS6110拷貝之間同向同源重組的結果，結核桿菌復合菌基因丟失概率非常高，至少存在5個這樣區(qū)域?？傊?，插入和缺失是結核桿菌復合菌群基因組可塑性的主要根源。(3)分枝桿菌轉錄組：轉錄組(transcriptome)是指細菌產生的全套轉錄產物。Alland 等建立了差異表達技術 (DECAL),用于檢測mRNA的差異表達。應用DECAL分析結核桿菌對異煙脫治療反應的表達差異，發(fā)現(xiàn) iniA、iniB、iniC三個基因表達上調，asd

10、基因表達下調。另一個作用于細胞膜的抗結核藥乙胺丁醇，可誘導iniABC基因的表達。因此iniABC功能在細胞膜生物合成中起關鍵作用。最近用于研究結核桿菌和巨噬細胞相互作用的一種技術是轉錄序列選擇性俘獲技術(selectivecapture of transcribed sequences SCOTS)。這種技術應用消減雜交和PCR檢測人巨噬細胞中表達差異的基因。許多基因的轉錄受巨噬細胞內化作用的影響，包括兩個替代轉錄因子(sigE, sigh),它們與應激反應下巨噬細胞的存活有關多聚乙酸合成酶pks2 ,多聚乙酬:在潰瘍分枝桿菌的致病中起重要作用。編碼異檸檬裂合酶的aceA基因，該酶證明是結核

11、桿菌在感染的小鼠中長期滯留所必不可少的。研究結核桿菌對INH的轉錄反應，檢到 FASH系統(tǒng)中編碼多聚乙酬:的基因過度表達，證實蛋白組學 的發(fā)現(xiàn)。另一個被誘導基因是fbpC,編碼含量豐富的分泌性抗原85-C,該抗原具有海藻糖分枝桿菌轉移酶活性，其與分枝桿菌細胞壁合成終末步驟有關。其它 INH誘導基因有fadE23和fadE24 ,每個基 因都是編碼與脂肪酸氧化有關，這是為降解INH治療過程中堆積起來脂肪酸而作出的反應。另一個在INH治療中被誘導的基因是ahpC,其是對INH次級毒性作用的反應。其它兩套基因尚待進一步的研究，其中之一編碼推測的流出系統(tǒng)，該系統(tǒng)在天然耐藥中起重要作用，己通過基因失活而

12、得以證實。 第二套基因與DECA沖鑒定的iniAB類同。(4)分枝桿菌蛋白質組應用雙向電泳、質譜等技術開展蛋白質組學研究，比較結核桿菌不同生長時期、不同生理狀態(tài)或不同環(huán)境壓力下的蛋白質組差異。對卡介苗在靜置和搖動培養(yǎng)環(huán)境下蛋白質組進行比較，發(fā)現(xiàn)至少有45個差異蛋白。其中 RV2623,cysA22cysA3, Gap. Acr在靜置培養(yǎng)環(huán)境中高表達，RV2623在搖動環(huán)境中不表達，該蛋白經(jīng)鑒定為ATP結合蛋白家族的新成員，這些蛋白質在低氧情況下也是高表達。另有研究發(fā)現(xiàn)，Ag85A, rpoB, pab, invA 和invB 在巨噬細胞中表達，但 Ag85B. Ag85C. rpoV 和ESA

13、T6僅在 體外表達而未發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞中表達。蛋白質組也可通過對致病菌株和減毒株蛋白質組比較發(fā)現(xiàn)特異 質點。這些特異質點可能就是毒力因子。應用雙向電泳、質譜技術對致病株H37Rv和卡介苗的蛋白質組比較，發(fā)現(xiàn)了25個特異質點，對其中僅存在于致病株的特異質點進行研究，發(fā)現(xiàn) 12個為卡介苗缺失的基因所編碼。研究比較了致病株 H37Rv和減毒株的蛋白質組，發(fā)現(xiàn)三個顯著蛋白質點只存在于H37Rv中。減毒株 H37Ra的Rv2347c的Rv3620c序列的59位的氨基酸突變?yōu)榻K止子，終止肽鏈的延伸，可能與其毒力下降有關。MPT63是與結核桿菌的毒力有關的一種特異性分泌蛋白，對其晶體結構的研究表明，它在細菌與

14、感染宿主相互作 用中起促進胞飲吞噬作用，而存在于結核桿菌中的小分子熱休克蛋白和孔蛋白OmpAW該菌的侵染及體內長期潛伏密切相關?；蚪M規(guī)模檢測毒力有關的表型主要通過建立突變菌株庫，然后評估突變菌株在動物模型中的生 一長情況，己經(jīng)發(fā)展的轉座子突變系統(tǒng)可以破壞非致死基因，這些基因可以標記示蹤每個突變體在動 物模型中的生長情況。這種稱為簽名標記突變(signature- tagged mutagenesis)方法已用于小鼠動物模型。被本測的1927個突變型中，16個突變菌株毒力減弱，而且大多數(shù)突變菌株被定位基因與脂質 代謝有關。其它的突變體相當于編碼預測的跨膜蛋白的基因的插入突變，其中有一個突變體定

15、位于脂 蛋白基因modA目前，尚不能全局性地分析脂質組成情況，但是脂基因組學(lipogenomics)的方法可能是未來研究的重要組成部分。人們發(fā)現(xiàn)標記的分枝桿菌細胞壁的組成成分可高效地從感染的巨噬細胞轉移到未 感染的巨噬細胞。因此，這些組成成分的釋放可能是影響細胞間和細胞內的生理過程。分枝桿菌的脂 基因組學對認識分枝桿菌疾病的發(fā)病機理極為重要。假如結核桿菌基因組編碼了大量與脂質代謝有關 的酶，那么將基因型和脂質類型的信息結合起來仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。比較基因組學和功能基因組學的進展，我們對結核桿菌胞內生活周期和發(fā)病機制的認識將達到一 個新的水平。使用基因組學獲得的各種假說將得到驗證，這些新的

16、認識將轉變?yōu)樾碌乃幬铩⒃\斷試劑 和疫苗。3 .引起豬免疫抑制的病毒病有哪些？它們是如何導致豬免疫抑制的?豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV) PRRSV能夠選擇性地在巨噬細胞中復制 ，并導致其數(shù)量減少，降 低肺泡巨噬細胞的吞噬殺菌作用，還可通過產生一些有抑制淋巴細胞功能的細胞因子(cytokines),使淋巴細胞的功能受到短暫的影響，從而引起豬免疫功能下降。據(jù)李華，楊漢春等報道，豬群感染PRRSV后，豬 瘟疫苗的免疫應答受到嚴重抑制。 Rossow等試驗感染證實，各種年齡的豬接種不同的 PRRSV毒株，其病 理變化主要在肺和淋巴結；Thanawongnwech等研究結果表明，豬血管內巨噬細胞

17、對 PRRSV極為敏感，表 現(xiàn)為直接導致受感染的巨噬細胞對血液中異常顆粒物質的清除能力降低。同時對肺泡洗液檢查，證實巨噬細胞數(shù)量明顯減少。正常豬肺泡洗液巨噬細胞占所見細胞的95 %,PRRSV感染豬則為50 %。豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2) PCV-2主要侵入患豬肺臟、胸腺、脾臟中，致使循環(huán)B細胞和T細胞及淋巴器官中的 B、T淋巴細胞數(shù)量減少和萎縮，從而導致免疫才制的發(fā)生；PCV在巨噬細胞(PAM)介導和 分裂素誘導下，明顯抑制淋巴細胞的增生，從而干擾正常免疫功能；PCV還可誘導 B淋巴細胞凋亡，造成 體液免疫無應答；PCV-2還可引起繼發(fā)性免疫缺陷，發(fā)病或感染豬存在短暫的不能激發(fā)有效的免疫應

18、答現(xiàn) 象。豬流感病毒(SIV)某些SIV能引起豬的免疫器官嚴重損傷，淋巴細胞大量減少，還可導致B細胞在外源性抗原刺激后所產生的免疫球蛋白的結構以及抗原反應性發(fā)生改變；某些SIV能引起外周血T淋巴細胞的轉化率顯著降低，并引起脾、胸腺及盲腸扁桃體的出血性變化，從而顯著地抑制豬的細胞免疫功能。另外,SIV主要侵襲豬呼吸道上皮細胞，并在此大量增殖，最終導致上皮細胞脫落、壞死以及肺部嗜中性粒細胞浸潤，阻塞呼吸道并損傷肺組織。豬瘟病毒(HCV) HCV對豬淋巴細胞和單核細胞有特殊嗜性，受感染的單核巨噬細胞功能的改變影響免疫系統(tǒng)，導致淋巴細胞衰減、T細胞活性受抑制，并伴隨淋巴器官和骨髓的衰退性變化。當豬感染

19、豬瘟 后機體免疫功能減退，體內常在寄生的巴氏桿茵、沙門氏菌借機大量繁殖，毒力增強而發(fā)生致病作用，而使豬瘟的病情復雜化，增加了死亡率。偽狂犬病病毒(PRV) PRV感染豬時，病毒首先在鼻咽上皮和扁桃體內復制 ，并隨這些位置的淋巴液擴 散至附近的淋巴結，在單核細胞和肺泡巨噬細胞內復制并損害其殺菌和細胞毒功能，從而降低機體的免疫力。豬細小病毒病(PPV) PPV主要集中在淋巴組織，在肺泡巨噬細胞和淋巴細胞內大量復制，損害巨噬細胞的吞噬功能和淋巴細胞的母細胞化能力，從而引起機體免疫力下降。非洲豬瘟病毒（ASFV） ASFV可導致病豬外周血淋巴細胞減少和淋巴網(wǎng)狀內皮組織細胞壞死。盡管 尚未證明ASFV能

20、在T細胞和B細胞中復制，但其能在單核細胞和巨噬細胞內復制并損害其功能。.引起豬免疫抑制的細菌病有哪些？它們是如何導致豬免疫抑制的?胸膜肺炎放線桿菌（APP） APP主要定居于扁桃體并粘附到肺泡上皮，可被肺泡巨噬細胞迅速吞噬或吸附并產生毒素，這些細胞毒素對肺泡巨噬細胞、肺內皮細胞及上皮細胞有潛在的毒性，降低肺泡巨噬細胞的吞噬殺菌作用，引起免疫抑制。豬大腸桿菌（E. coli）大腸桿菌產生腸毒素吸附并定居在腸道下部，導致腸系膜淋巴結萎縮，淋巴細胞減少，破壞機體的防御機制，免疫應答減弱，使機體處于一種免疫抑制狀態(tài)。附紅細胞體（Eperyt hrozoon）附紅細胞體導致機體紅細胞的免疫粘附活性降低，

21、紅細胞免疫功能低下外周血T淋巴細胞總數(shù)減少，活性降低，細胞免疫功能低下，機體處于極度虛弱狀態(tài)，抵抗能力下降。近年 來的臨床實踐證明，附紅細胞體容易和多種疾病混合感染，特別是附紅細胞體容易和圓環(huán)病毒、豬瘟病毒 混合感染，加重病情。豬弓形體（Toxoplasma gondi）弓形體在宿主體內繁殖的過程中，大量的免疫細胞受到了弓形體的損害 ：破壞機體的免疫系統(tǒng)，最終導致免疫抑制。豬肺炎支原體（Myh）豬肺炎支原體破壞了呼吸道上皮的完整性，從而引起單核細胞流入細支氣管和血管周圍，刺激機體產生促炎細胞因子，降低巨噬細胞的吞噬和清除能力，而抑制性T細胞的活動增強，導致 呼吸道免疫力減弱，抗病力下降。.除了

22、病原因子外，還有哪些因素可以引起豬免疫抑制？試述這些因素引起豬免疫抑制的機理。藥物因素某些藥物如慶大霉素、四環(huán)素、強力霉素抑制淋巴細胞的趨化性；磺胺甲基異嗯吵、四環(huán)素、強力霉素、先鋒霉素抑制淋巴細胞的轉化；氯霉素、利福平、強力霉素抑制抗體的產生；四環(huán)素、強力霉素、二性霉素 B抑制巨噬細胞的吞噬作用；維生素K3、四環(huán)素、氯霉素、磺胺類藥物抑制中性粒 細胞的功能等，從而影響免疫效果。糖皮質激素類藥物如地塞米松、潑尼松、可的松等具有抗免疫作用 性激素如睪丸激素、雄激素等對免疫應答有抑制作用。理化因素某些重金屬（如鉛、鎘、汞、神）、工業(yè)化學物質（如過量的氟）等可損傷淋巴細胞或巨噬 細胞,干擾機體免疫系

23、統(tǒng)正常的生理機能，過多攝入會使免疫組織器官活性降低，抗體生成減少；大量放射線輻射或大劑量紫外線照射動物可殺傷骨髓干細胞而破壞其骨髓功能，結果因嚴重損傷造血干細胞而導致造血功能和免疫功能喪失；某些化合物如鹵化苯、鹵素、農藥等可引起免疫系統(tǒng)組織的部分甚至全部 萎縮以及活性細胞的破壞，進而引起免疫失敗；人醫(yī)已證實苯酚類與甲醛消毒劑廣泛頻繁的應用對人類有 明 顯 的 免 疫 抑 制 與 致 癌 作 用。營養(yǎng)性因素：某些維生素（如復合維生素B、維生素C等）和微量元素（如銅、鐵、鋅、硒等）是免疫 器官發(fā)育及淋巴細胞分化、增殖、受體表達、活化及合成抗體和補體的必需物質，若缺乏或過多或各成分 間搭配不 當，能

24、誘導機體繼發(fā)性免疫缺 陷。應激因素當豬群處于應激狀態(tài)（過冷、過熱、擁擠、轉群、混群、斷奶、換料、打斗、創(chuàng)傷、饑餓、缺氧、限飼、長途運輸、噪音和約束等）時,可以使機體神經(jīng)系統(tǒng)抑制，肌肉松弛，胸腺出血，免疫細胞大量減少，腎上腺皮質機能降低，血漿類固醇水平提高，同時體內產生異常代謝產物（如熱應激產生熱應 激蛋白），從而導致機體免疫功能的降低 ，不能夠正常地產生相應的免疫反應，降低免疫效果。同時因蛋白質分解代謝增強，用于產生免疫球蛋白的原料相對較少，此時進行疫苗免疫時，抗體形成減少，體內抗體水平 低 下， 不 能 達 到 預 期 免 疫 效 果。霉菌毒素：中毒霉菌毒素不僅可使肝細胞的變性壞死、淋巴結出

25、血水腫，嚴重破壞體內的免疫器官引起機體嚴重的免疫抑制，還會抑制蛋白質合成，影響抗體產生，并且能引起胸腺萎縮，吞噬細胞功能和補體產生能力下降。集約化生產：集約化生產方式使豬的活動范圍極大地受到限制，導致心肺功能減退；加之集約化生產中許多人為應激 因素，無疑影響 了 免疫功能。弱毒疫苗的廣泛應用：已知PR、PPA等弱毒疫苗會對豬體造成幾周的免疫抑制。疫苗佐劑美國 M. Hoogland等人證實在PCV-2感染的早期（21d），所有佐劑（油包水、氫氧化鋁）者B會 加重PCV-2感染引起的淋巴組織缺損的嚴重程度；而在感染后35d才由包水佐劑仍可加重病損的程度。.從臨床經(jīng)驗中如何識別豬免疫抑制？答 ：（

26、一） 從 臨 床 經(jīng) 驗 中 識 別：不能用常理解釋同窩仔豬中部分發(fā)病與死亡的現(xiàn)象6.2斷奶至中豬階段散發(fā)病例不斷，免疫程序并無明顯差錯 6.3病程較長，抗感染療效差6.4豬群中同時發(fā)生多種疾病綜合癥6.5條件性的病原微生物（巴氏桿菌/附紅細胞體）以及一些弱毒苗可引發(fā)疾病6.6剖檢常有非典型的CSF、PR、PRRS或典型的MH、PCV的病變（二）血清學識別：接種后部分個體的抗體水平始終低下，沒有任何原因可以解釋這一現(xiàn)象 （三）特殊識別：1.總免疫球蛋白測定淋巴細胞活力測定 2.T-淋巴細胞轉化試驗 3.其它檢測措施.如何預防免疫抑制綜合癥？答：7.1嚴格堅持豬群的全進全出，至少產房與保育舍要求

27、做到；7.2徹底預防支原體肺炎；7.3添加免疫增強劑；7.4應用免疫激動劑；7.5盡量避免免疫抑制因子的干擾；7.6采用淘汰母豬的血清治療.禽白血病對養(yǎng)禽業(yè)的危害性分析。答：（1）禽白血病是最早識別的傳染性腫瘤病，是研究最復雜、最為深入的病，是最難控制的禽病，是中國最被忽視的禽病，是種禽場最為頭疼的禽病。（2）主要危害：發(fā)生腫瘤；死亡和淘汰率增加；生產性能（產蛋量、胴體品質等）下降；免疫抑制；垂直傳播。（3）嚴重影響育種和生產：陽性率高達 30%-40% ;發(fā)病率為 5%-25% ;死淘率為 5%-20% ;產蛋 率下降10%-25% ;雞苗健活率下降10%-20% ;雞苗的免疫效果差，抗體水

28、平達不到防疫的要求。.我國禽白血病的流行新特點。答：（1）分布廣。（2）傳播快。（3）影響大。（4）難控制。（5）病情復雜。.禽白血病遺傳選育的分子基礎。答：遺傳選育在禽白血病控制中有著重要地位，抗性基因選擇是其技術關鍵，禽白血病的抗性基因具有以下特點：（1）具有對病毒感染的細胞性抵抗力：遵循孟德爾模式，有獨立的常染色體位點（tva, tvb, tvc）控 制宿主對ALV引起感染的應答；每個 tv位點存在易感性和抗性的等位基因；每個位點可能有多個等位 基因。（2）具有對腫瘤發(fā)生的抵抗力：有遺傳抗性的雞對相應亞群的白血病和肉瘤病毒感染和腫瘤形成有抵 抗力；通常不會形成抗體；一般用 RSV （肉瘤

29、病毒）研究。.國際動物源性耐藥監(jiān)測體系的進展。從1994年起世界衛(wèi)生組織總部傳染疾病監(jiān)測控制處負責指導、協(xié)調各國的細菌耐藥性監(jiān)測工作。世界衛(wèi)生組織細菌耐藥性監(jiān)測合作中心啟動了旨在收集全球細菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)的WHONET系統(tǒng)。現(xiàn)國內、外多數(shù)監(jiān)測網(wǎng)使用的分析軟件屬該系統(tǒng)。約有315個醫(yī)院和400多個實驗室分別參加了美國醫(yī)院內感染監(jiān)測系統(tǒng)（NNIS）和歐洲耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（EARSS）。始于1992年的Alexander和1997年的MYs-TIC 和SENTRY監(jiān)測網(wǎng)從開始立足于歐盟和美國，現(xiàn)逐年擴大監(jiān)測網(wǎng)的地區(qū)范圍。國內也有少數(shù)實驗室 參力口 SENTRY的工作。國內細菌耐藥性監(jiān)測（1）地區(qū)性細菌耐

30、藥性監(jiān)測網(wǎng)（2）跨地區(qū)細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（3）國家細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng).我國動物源性耐藥性研究的進展。.我國獸用抗菌藥物耐藥性的現(xiàn)狀抗菌藥在養(yǎng)殖業(yè)的大量使用，隨之而來的是抗菌藥耐藥性不斷產生并越來越嚴重。國內對獸醫(yī)領域抗菌藥的耐藥性缺乏有計劃和系統(tǒng)的監(jiān)測，所以，對我國獸用抗菌藥的耐藥性情況很難做出準確的評價。但總的來說，由于抗菌藥的濫用和不合理應用十分普遍，故耐藥性是相當嚴重的。許多臨床工作者反映抗菌藥的效果比以前差，用藥劑量不斷加大，這雖然是臨床工作者的反映，但也從一個側面反映了耐藥性的嚴重。.對獸用抗菌藥物耐藥性的研究大腸桿菌I型整合子/耐藥基因盒的分子流行病學調查細菌基因盒-整合子系統(tǒng)（gen

31、e cassette -integron system）是20世紀90年代新發(fā)現(xiàn)的可移動的基因元件（Hall, 1991）。以上述分離的大腸桿菌耐藥菌株為標本 用常規(guī)PCR方法擴增整合酶基因對I型整合子流行情況進行了調查，并以TD - PCR擴增、同源性酶譜分析及直接測序相結合的方法調查整合子插入耐藥基因盒的種類，研究豬場大腸桿菌I型整合子/耐藥基因盒的分子流行病學。結果表明，豬場大腸桿菌I型整合子流行較普遍，192株分離菌中有105株攜帶I型整合子，檢出率為54.7% , I型整合子多數(shù)位于質粒上；豬場大腸桿菌存在 6種I型整合 子流行，其中整合二氫葉酸還原酶 （dhfr）和氨基糖腺昔轉移酶

32、（aadA2）兩種耐藥基因的I型整合子流行最 普遍,檢出率達36. 6%。從不同來源分離的大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)以小豬群分離菌的I型整合子檢出率最高，飼養(yǎng)員最低。比較還發(fā)現(xiàn)，菌株攜帶整合子及耐藥基因盒的情況與其耐藥譜及多重耐藥表型有密切關系，敏感菌、單耐藥及二耐藥菌株幾乎不存在I型整合子和耐藥基因盒，而耐受3種抗菌藥物以上的多重耐藥菌株，I型整合子和耐藥基因盒檢出率顯著提高，提示I型整合子可能與細菌的多重耐藥有關（吳聰明，2003）。耐氟唾諾酮類大腸桿菌gyrA基因突變研究從患有大腸桿菌病的動物分離大腸桿菌，并對其進行生化鑒定。按常規(guī)方法測定其對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、麻保沙星的M I

33、C,篩選出5株M IC為4128mg/ l的耐藥菌株（其中豬源2株、雞2株、犬1株）。同時，用亞M IC連續(xù)遞增法傳 代培養(yǎng)獲得禽大腸桿菌（O78）和貓大腸桿菌對恩諾沙星的高度耐藥菌各1株（M IC分別為64mg/ l和8mg/ l）。從7株耐藥菌提取DNA,經(jīng)PCR擴增并分別進行測序，將測序結果與文獻發(fā)表的大腸桿菌敏感 株的gyrA基因的相應區(qū)域進行同源性分析。結果表明，各菌株均在第 83位和87位的氨基酸上發(fā)生了突變，同源性都是98. 3%淇中犬源耐藥菌的突變?yōu)镾er83-Leu, Asp87-Tyr;其余6株耐藥菌的突變均為Ser83-Leu, Asp87 -Asn。這兩個突變位點與文獻

34、報道的耐藥決定區(qū)的突變相同，預示gyrA基因Ser83和Asp87突變可能參與構成大腸桿菌對氟唾諾酮類的耐藥機制(廖曉萍,2002)。耐氟唾諾酮類雞毒支原體gyrA的基因突變研究對臨床分離的3株雞毒支原體(FL、HS1和HS2)和實驗室經(jīng)恩諾沙星和環(huán)丙沙星誘導的2株支原體(S6 - 10和F14 - 8)對6種氟唾諾酮類藥物恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、沙拉沙星、氧氟沙星和麻保沙星測定其M IC,均表現(xiàn)不同程度的耐藥，其MIC范圍為232 d g/ml。對上述菌株提取 DNA,經(jīng)酶切鑒定和質粒 PCR鑒定，確認轉化子含有 gyrA基因 目的片段后，進行測序并用 DNASIS分析軟件對測序結果進

35、行分析。結果顯示，臨床分離的3株雞毒支原體中，1株在gyrA亞基QRDR未發(fā)生任何取代，2株則在第83位有一相同的氨基酸取代(Ser83f Ile),其中1株還發(fā)生第87位取代(Glu87-Gly)，誘導的2株耐藥菌，S6 - 10株在恩諾沙星藥物壓力下獲得的 耐藥株最常見的突變位點是gyrA第83位(Ser83f Ile),高水平耐藥株在第 82位增加1個氨基酸取代位點(Asp82-Gly)，但在第87位不發(fā)生任何取代；而S6 - 10株在環(huán)丙沙星藥物壓力下獲得的耐藥株首先在 第87位發(fā)生突變(Glu87-Gln /Gly),高水平耐藥株在第 83位增加1個突變位點(Ser83-Ile) 。

36、 F14 - 8 株在兩種藥物壓力誘導下產生的耐藥株最常見的突變位點是gyrA第87位(Glu87 - Gln /Gly),高水平耐藥侏在第83位增加1個氨基酸取代位點(Ser83f Ile)。在發(fā)現(xiàn)上述耐藥株突變位點的同時，對部分較低水平耐藥的菌株卻未發(fā)現(xiàn)gyrA的任何位點突變，暗示可能存在其他突變位點或耐藥機制，尚待進一步研究(蔣紅霞，2002)。耐氟唾諾酮類豬源沙門氏菌gyrA基因突變研究從廣東某豬場分離3株高水平耐氟唾諾酮類藥物的沙門氏菌(M IC764 g g/ml)，通過PCR方法擴增gyrA基因片段，然后進行克隆測序。結果表明，3株沙 門氏菌均發(fā)生 Ser83 ( TCC) -P

37、he( TTC)及Asp87 (GAC) - Asn (AAC)突變 淇中1株還發(fā)生了 His78 (CAT) -Tyr ( TAT)的突變，國內外尚未見報道，這一突變位點對而t藥性的意義，有待進一步的研究。由此可見，高度耐藥的豬霍亂沙門氏菌的gyrA基因可發(fā)生雙位點突變，個別菌株還可能發(fā)生3位點突變。由于測定的菌株不多，上述結果尚待進一步重復驗證.動物源細菌耐藥性的擴散與傳遞從對大腸桿菌耐藥性的調查結果，各類養(yǎng)殖場動物、環(huán)境和飼養(yǎng)員分離的大腸桿菌耐藥性趨勢分存均很相似，而且三種來源的大腸桿菌之間還存在不少相同耐藥譜的多耐藥菌株，尤其是動物源及環(huán)境源的分離菌更為接近，這表明耐藥菌在動物、環(huán)境和

38、飼養(yǎng)員之間可能存在擴散、傳遞現(xiàn)象。雖然許多現(xiàn)象表明耐藥菌株的耐藥因子可以通過某種機制傳遞給人類病原菌，但動物源細菌耐藥性可否向人類病原菌傳遞的問題一直存在著爭論。據(jù)Hunter報道，從應用安普霉素(ap ramycin)多年的豬場的仔豬糞便，周圍環(huán)境和牧場主的糞便中均分離到耐安普霉素的大腸桿菌，這些耐藥菌株中都含有一個相似的大約為62kb的耐藥質粒，而且這些質粒可以互相傳遞。國內這方面的研究報道很少只有胡子鑒曾通過大腸桿菌耐藥譜調查和脈沖場凝膠電泳比較相同或相似耐藥譜之間的親緣關系，結果發(fā)現(xiàn)同一養(yǎng)殖場不同動物個體及飼養(yǎng)員相同或相近耐藥譜的菌株，其脈沖場凝膠電泳指紋相似，因此認為同處一環(huán)境對氟唯

39、諾酮類耐藥的大腸桿菌可能由克隆傳播造成的。關于細菌耐藥性的擴散機制和方式，國際上已經(jīng)作了非常廣泛深入的研究，細菌除通過基因突變獲得 耐藥性外，還可通過攜帶可轉移遺傳因子包括質粒、轉座子和噬菌體等使耐藥性擴散傳播。20世紀90年代又發(fā)現(xiàn)了細菌耐藥性的整合子/基因盒系統(tǒng)(Hall, 1991)，根據(jù)我們的調查，豬場分離的大腸桿菌I型整合子及耐藥基因盒檢出率達54. 7% ,而且攜帶兩個整合子的現(xiàn)象較普遍，占整盒子檢出率的15. 2%，由于整盒子潛在的基因捕獲及整合表達能力，將來可能會更廣泛流行，尤其是在藥物選擇壓力持續(xù)作用下，這種可能性更大，對細菌耐藥性的傳播可能是一種嚴重的威脅。13.細菌對臨床

40、常用抗菌藥物耐藥機制的研究進展(1)滅活酶和鈍化酶的產生。細菌能產生可破壞抗菌藥物或使之失去抗菌作用的酶，使藥物在作用于菌體前即被破壞或失效。如 3-內酰胺酶，氨基糖昔類鈍化酶，氯霉素乙酰轉移酶，紅霉素酯酶和其它 滅活酶。(2)抗菌藥物滲透障礙(3)主動外排耐藥機制(4)藥物作用靶位的改變(5)代謝途徑或代謝狀態(tài)改變14.禽流感病毒的致病性和毒力主要有哪些基因決定的，這些基因的主要功能有哪些?(1.) HA基因HA與細胞受體結合后，病毒被內吞到細胞中，病毒囊膜與吞噬小體進行膜融合時需要HA蛋白裂解為HA1和HA2 ,在HA2上形成膜融合區(qū)來誘導融合的發(fā)生。HA: HA蛋白即血凝素蛋白，由片段

41、4編碼，是典型的 1型糖蛋白，是流感的主要表面抗原之一。HA在感染過程中唄水解為HA1,HA2兩條，他是感染細胞的先決條件；HA蛋白具有良好的免疫原性，能誘導機體產生中和抗體；也是病毒發(fā)生抗原變異的主要蛋白之一，可以幫助病毒逃脫免疫系統(tǒng) 的監(jiān)視，是 A型流感病毒致病性的主要決定因素。(2.) NA基因NA是一種唾液酸酶，可以在病毒感染靶細胞時，識別細胞表面流感病毒受體末端的唾液酸殘基，使 病毒能夠進入細胞。NA的另一個功能是為要出芽的病毒粒子清理通道，有利于病毒粒子的成熟和釋 放。NA:神經(jīng)氨酸由片段 6編碼，是除血凝素基因外另一個主要的表面抗原。NA可特異性裂解細胞表面流感病毒受體末端的唾液

42、酸殘基，為病毒粒子從感染的細胞中釋放出來創(chuàng)造條件。此外，NA蛋白還具有良好的免疫原性，能誘導機體產生相應的中和抗體。M基因M1和M2是由M基因編碼的，M1蛋白是病毒粒子中最豐富的蛋白，在病毒粒子出芽和裝配過程中起 著關鍵性的作用。M:基質蛋白 M是病毒粒子中含量最多的蛋白，由片段 7編碼，由M1,M2兩種蛋白組成，具有特異 性，是劃分流感病毒型的主要依據(jù)之一。M蛋白在病毒感染早期可影響病毒的生長速度及子代病毒的裝配。M1構成病毒粒子蛋白質外殼的主要成分，可以調節(jié)子代病毒顆粒的裝配，并穩(wěn)定顆粒核心部 分；M2蛋白可誘導抑制是病毒復制的抗體，是 CTL的靶抗原。(4.)NS基因NS1與dsRAN結

43、合抑制IFN- “ / 3的轉錄調控因子的激活從而在流感病毒抗宿主免疫學反應和致病性 中起主要作用。NS:是非結構蛋白，由片段 8編碼NS1,NS2兩種蛋白。NS1可幫助病毒逃離宿主免疫反應。(5.)PB2 基因病毒的復制蛋白與病毒的復制有關，特別是627位點的改變對病毒的毒力有重大影響。PB2:與流感病毒的宿主限制性及致病性密切相關。有資料表面其627位氨基酸對禽流感病毒感染動物種屬特異性具有決定性作用。(6.)NP基因NP蛋白是流感病毒粒子中主要的結構蛋白，NP蛋白上有親核信號，與 cRNA和vRNA形成復合物引導她們向細胞核定向移動。NP:蛋白是一種核蛋白，由片段 5編碼，具有型特異性，

44、與聚合酶蛋白和vRNA結合形成核糖核蛋白顆粒RNP,可以穩(wěn)定 vRNA,防止被 RNA酶的降解，而且還參與病毒基因組的復制和轉錄，在決 定病毒的宿主范圍上也起著重要的作用。此外，PB1: PB1基因還編碼 PB1-F2,該蛋白具有通過誘導巨噬細胞凋亡降低宿主的免疫反應；介導細胞殺傷作用阻礙抗原遞呈細胞對后天免疫的調節(jié)而增加繼發(fā)細菌感染的可能性，從而使病毒的致病 性增加；同時誘導細胞凋亡。PB2、PB1、PA分別由片段1, 2, 3編碼，共同組成了流感病毒的RNA聚合酶復合物，發(fā)揮 RNA酶的作用，負責 mRNA和vRNA的復制和轉錄。注：黑體字只需在論述題答，簡答題只需答非黑體字部分。15.動

45、物RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)的建立方法有幾種？每種方法各有什么優(yōu)缺點?答：1)以T7 RNA聚合酶為基礎的病毒拯救系統(tǒng) 以表達T7RNAP的痘病毒為基礎的體內拯救系統(tǒng)及缺點優(yōu)點：T7RNAP能夠有效地促進大量 RNA在體內進行車t錄，這些 RNA都是在哺乳動物細胞的細胞質 中，通過T7RNAP控制T7啟動子而啟動轉錄的。缺點:T7RNAP痘毒株系統(tǒng)由于痘病毒株而引起該系統(tǒng)一些缺陷。痘毒株對宿主細胞有致細胞病變 作用，子代痘病毒的釋放同時也會干擾拯救病毒子代病毒的釋放，降低了從克隆DNA中拯救病毒的效率，這也干擾對目的產物的分析。該系統(tǒng)輔助病毒感染可以產生相對較快的細胞病變效應，從而也會引起病毒拯

46、救困難。在感染細 胞期間，致細胞病變效應限制了病毒拯救和在該細胞上病毒繁殖的時間期限。這使得對生長緩慢的高 度致弱病毒或病毒載體進行拯救非常困難。輔助病毒的使用還會在拯救過程中引入一種生物學感染性 抗原。對這類問題有嚴格的要求 ：(1)輔助病毒的起源和傳代背景必須被充分的證明；(2)輔助病毒繁殖從來沒有經(jīng)過未知起源牛血清的處理，否則，這可能會使其有暴露于牛的海綿狀腦病的危險；(3)在拯救過程中的輔助病毒使用必須嚴格的被檢驗，以確保不存在外來抗原的干擾，這些外來抗原可能是通過在 牛、豬、或鳥類的衍化物質中暴露而被引入同源重組常常在全長基因組和輔助質粒之間，通過疫苗毒 株的DNA聚合酶而頻繁發(fā)生。

47、在真核中T7RNAP是否能夠維持足夠高的活性及建立高效的拯救系統(tǒng)難以保證T7RNAP為基礎的無痘病毒的拯救系統(tǒng)優(yōu)點：不需要考慮子代痘病毒的釋放同時也會干拯救病毒子代病毒的釋放的問題。具有能夠表達 充足T7RNAP的穩(wěn)定細胞系，T7RNAP基因能夠穩(wěn)定的被整合到細胞的基因組中，并且能夠在不同的 靶細胞內，在沒有發(fā)生變異的情況下，高水平表達。缺點：穩(wěn)定表達T7RNAP的細胞系很難建立和培養(yǎng)。在選擇壓力下進行傳代，很難建立一個不缺 失T7RNAP活性的穩(wěn)定細胞系。此外，該方法在疫苗研制中的應用可能會受到限制，因為用于疫苗候 選株的細胞系的確認是很困難的。要建立具有高效拯救效率的細胞系，還要注意選擇合

48、適的逆轉錄病毒載體，要考慮它的轉錄啟動 子的轉錄效率以及與宿主基因組整合的效率和拷貝數(shù)。2)真核RNA聚合酶I拯救系統(tǒng)優(yōu)點：RNA聚合酶I轉錄產物5端不加帽，3,端不加尾，故沒有冗余序列。RNA聚合酶I是細胞核內含量豐富的酶，它能轉錄出精確的rRNA(類似于流感病毒的vRNA)。該酶還能在特定的啟動子和終止子序列處啟動/終止轉錄，Pol I終止子位點高度精確。RNA聚合酶I系統(tǒng)比RNP直接轉染系統(tǒng)更為有效，因為它能進行體外轉錄、蛋白質純化和體外RNP裝配。其轉染效率較高，原因在于 293T細胞具有很高的轉染效率，并且細胞中具有足夠的RNA聚合酶I和較高的轉錄效率，能隨著細胞增殖保證RNA聚合酶

49、工的供給。缺點：該系統(tǒng)病毒產毒量特別低的缺點。由于RNA聚合酶I轉錄活性具有特異性，在不同宿主和細胞里表現(xiàn)不同活性。3)真核RNA聚合酶n拯救系統(tǒng)RNA聚合酶H位于核質內，它負責合成核不均一RNA(hnRNA),即mRNA的前體。目前商品真核載體絕大多數(shù)都是利用RNA聚合酶n啟動子和終止子序列構建的載體。所用的啟動子多數(shù)集中在人的巨細 胞病毒(humaneytomegalovirus , hCMV)、猿病毒 40(simianvirus40 , Sv40)等啟動子。 優(yōu)點：除了負鏈病毒拯救負責合成病毒蛋白外，在正鏈病毒也有利用。在病毒基因組cDNA的5,和3,同時引進HDV核酶，這樣產生5,不

50、加帽，3,不含有冗余序列 的病毒RNA ,并在實驗中取得不錯的效果。通過轉染重組DNA質粒，直接使用真核生物 RNAPol n啟動子去驅動病毒cDNA轉錄。 缺點：CMV的轉錄本5,有帽子結構，影響了病毒 RNA的感染性。利用Pol n系統(tǒng)可能帶來一級轉錄本被剪輯的風險，這也可能阻止這個拯救系統(tǒng)對特異的病毒的 成功應用。在病毒基因組cDNA的5,和3,同時引進HDV核酶的切割效率是有限的，它要求在轉錄本的3, 端要有必要的修飾，切割效率低，還有許多病毒基因組兩端含有冗余序列也可能是導致該系統(tǒng)拯救效 率低的原因。4）poi I -poi n雙啟動子拯救系統(tǒng)在poi I啟動子與終止子間插入 poi

51、 n啟動子和多聚腺甘酸，再將病毒基因插入該系統(tǒng)，利用細胞酶系統(tǒng) 拯救出病毒；優(yōu)點：可以在拯救株上引入多個變異位點，減弱毒株活性，研制出安生性更好的弱毒疫苗。拯救效率 相對較高。缺點：拯救的病毒變異可能性大。16.反向遺傳系統(tǒng)在生物醫(yī)學研究中的應用有哪些？請舉例說明。答：1）病毒基因功能方面：RNA病毒感染性克隆的構建，突破了對單一基因研究的局限，從病毒整體與分子之間、病毒與宿主關系方面研究病毒的毒力和致病性?？梢圆扇』蚯贸?、插入、置換或構建嵌和 病毒等方法對病毒基因功能進行研究。如Nishigahara將G蛋白基因替換事先構建的弱毒株RC-HL反向遺傳學系統(tǒng)中相應基因，制備出嵌合病毒。將該嵌

52、合病毒腦內接種小鼠后，與Nishigahara株一樣可以引起小鼠死亡。證明G基因是RV毒力決定基因，也表明 G蛋白在病毒吸附過程中具有重要作用。比較 RC- HL 株和Nishigahara株的G蛋白基因后發(fā)現(xiàn)242、255、268位的氨基酸發(fā)生了變異。在構建的弱毒株RC-HL 反向遺傳系統(tǒng)中逐步把 242、255、268位的氨基酸替換為Nishigahara株的G蛋白基因，發(fā)現(xiàn)任何一個 氨基酸被替換后致病性都會增加。將弱毒rHEP株G基因333位氨基酸替換為精氨酸后致病性大大增加。進一步證實G蛋白333位氨基酸是毒力決定位點。2）闡明病毒的起源和致病機制方面： 這方面禽流感病毒 H5N1株和

53、1918西班牙流感人類及動物 RNA病 毒株的例子可供借鑒。目前 SARS病毒的家貓、雪貂動物模型已經(jīng)建立，從野生動物上分離到的SARS病毒也測出全序列將來可結合感染性克隆對病毒起源和致病性進行研究。3）新型疫苗方面：主要有以下幾個方面：（1）尋找出與毒力相關位點，通過對毒力決定性基因的缺失或 修飾得到一種無毒或減毒毒株，以此制備新型的減毒活疫苗。如缺失FMDV細胞吸附位點的編碼序列或前導蛋白酶的編碼序列可得到FMD的減毒毒株，將其作成減毒活疫苗免疫動物可獲得較好的免疫效果。（2）研制嵌合疫苗，開發(fā)多價疫苗，例如在DEN4感染性克隆的基礎上構建型間嵌合體，表達DEN1、DEN2、DEN3的結構

54、蛋白，以此為基礎做成多價疫苗，能為實驗動物提供保護作用。（3）新型核酸疫苗即RNA疫苗，RNA疫苗克服了 DNA疫苗可能引起細胞轉化的潛在危險，也解決了 DNA疫苗進 入細胞核困難、表達量低下的缺陷。因此RNA疫苗是一類很具希望的新型疫苗。（4）利用感染性克隆作為現(xiàn)有減毒活疫苗的種子批，可以減少生產批次間的差異，保持疫苗的穩(wěn)定性和安全性。4） RNA病毒載體方面：RNA病毒載體與傳統(tǒng)活病毒載體相比，以RNA病毒作為載體具有如下優(yōu)點：（1）基因組較小利于操作。（2）多數(shù)感染哺乳動物的RNA病毒只在胞漿中增殖和轉錄基因組，引起特異病毒 蛋白的高效表達，并且可防止宿主對外源性RNA的核剪切造成的損害

55、。源基因的表達不受宿主的控制，RNA病毒沒有DNA相，避免了病毒DNA整合到宿主細胞 DNA上。（4）有些正鏈病毒，其裸 RNA基 因組轉染適當細胞后可作為 mRNA直接由宿主內質網(wǎng)翻譯成病毒蛋白，這是其作為基因表達載體的關鍵。（5）宿主譜廣，幾乎適用于所有的哺乳動物和禽類。例如以黃熱病毒骨架表達乙型肝炎病毒prM和E蛋白，可用作預防黃熱和乙腦的二聯(lián)疫苗，也可以表達DE2的prM和E蛋白，能給實驗動物提供保護作用。以狂犬病毒為載體，表達人類免疫缺陷病毒l型gag蛋白的病毒能夠作為理想疫苗株；以狂犬病毒為載體，增加狂犬病毒自身一個G基因表達的重組病毒，與原病毒相比，對鼠有很強的免疫原性，但致病性

56、降低。以狂犬病毒為載體，表達禽流感病毒血凝素（hemagglutinin, HA）糖蛋白，可刺激機體產生細胞和體液免疫，以探索以狂犬病毒為載體的新型基因工程疫苗.26.狂犬病毒的基因組有何特點？如何應用反向遺傳操作技術改造狂犬病毒？答：狂犬病病毒（RV）屬于彈狀病毒科狂犬病毒屬，可引起人和多種動物的狂犬病。其基因組為 12 kb左 右的單鏈負股RNA ,病毒基因結構為3-N-P-M-G-L-5 ,編碼5種功能不同的結構蛋白.即核蛋白 （N）, 磷蛋白（P）,基質蛋白（M）,糖蛋白（G）和大轉錄蛋白（L）,核蛋白（N）緊緊地包裹基因組 RNA,形成核糖核蛋白體復合物（RNP）。大蛋白（L）與磷蛋

57、白（P）是依賴RNA的RNA聚合酶復合體.基質蛋白（M）是RNP 與糖蛋白（G）胞漿域的橋梁.G蛋白是病毒的跨膜蛋白，由胞漿域和胞外域2部分組成，可誘導感染動物產生中和抗體，調節(jié)病毒的轉錄與復制，是病毒的主要免疫原蛋白。G、L基因序列之間是一個偽基因.病毒表達蛋白質的水平隨著基因組序列3到5的逐步轉錄而減弱。利用反向遺傳技術對狂犬病毒的分子生物學特性的研究包括病毒基因突變與功能的關系研究，基因重 排與功能的關系研究，病毒中基因缺失與病毒毒力的關系研究，狂犬病毒表達外源基因的研究等。舉 例如下：基因功能研究：為了研究RV的致病基因，Etessami等成功拯救出了 G基因的缺失病毒，體外實驗發(fā)現(xiàn)

58、病毒不能在細胞間傳播，感染小鼠后也未發(fā)現(xiàn)任何病理性變化。Ito等用RV強毒株Nishigahara將G蛋白基因替換事先構建的弱毒株 RC-HL反向遺傳學系統(tǒng)中相應基因，制備出嵌合病毒。將該嵌合病毒腦內 接種小鼠后，與Nishigahara株一樣可以引起小鼠死亡。證明G基因是RV毒力決定基因，也表明 G蛋白在病毒吸附過程中具有重要作用。比較RCHL株和Nishigahara株的G蛋白基因后發(fā)現(xiàn)242、255、268位的氨基酸發(fā)生了變異。在構建的弱毒株RC HL反向遺傳系統(tǒng)中逐步把 242、255、268位的氨基酸替換為Nishigahara株的G蛋白基因，發(fā)現(xiàn)任何一個氨基酸被替換后致病性都會增加

59、。將弱毒rHEP株G基因333位氨基酸替換為精氨酸后致病性大大增加。進一步證實G蛋白333位氨基酸是毒力決定位點。這也說明RV的致病機理是很復雜的。新型病毒載體的構建：Schnell等利用RV反向遺傳學操作系統(tǒng) SPBN制備出2株分別表達來源于 HIV-1實驗室適應株CXCR4 tropic和田間分離株dual-tropic的gpl60基因重組復制缺陷 RV。將上述病毒接種事先 經(jīng)重組HIV-1 gp120蛋白免疫的小鼠后，均可在血清中檢測出滴度高達1： 800白HIV-1中和抗體。Siler等同樣利用SPBN成功地構建了表達丙肝病毒E2蛋白的重組RV,將滅活或者純化的重組病毒免疫小鼠，可以誘

60、發(fā)針對E2蛋白強烈的細胞免疫應答。Smith等將炭疽桿菌的保護性抗原的第四域插入到 SPBN株G蛋白基因后的基因區(qū)，構建出表達G和炭疽桿菌保護性抗原的嵌合病毒，小鼠實驗表明能夠產生對RV和炭疽桿菌的保護性抗體。新型安全疫苗的開發(fā)：Fabe年構建了含有細胞色素 c基因的RV重組病毒，實驗證明可以顯著增強免疫 反應。之后，將RV重組病毒SPBNGA攜帶了 SADB19株的糖蛋白，其中333位的Arg由Glu替代，成年鼠 腦內接種后無致病性。此外，插入2個G的重組病毒RV SPBNGA GAN可以起GP的超表達，并且增強細胞的凋亡作用，活體平行試驗表明免疫原性增強。Muto等在構建的弱毒株rRc-H