1、共三十一頁(yè) 本課題(kt)學(xué)習(xí)目標(biāo) 體驗(yàn)(tyn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過(guò)程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們?cè)谘t蛋白的提取中分別起到什么作用。 主要原理： 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理共三十一頁(yè)3、課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法 4、課題難點(diǎn)(ndin)： 樣品的處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。共三十一頁(yè)血液血漿水 分固體物質(zhì)：血漿蛋白、無(wú)機(jī)鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì) 胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90）兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)2.提問(wèn)(tw

2、n)：血液有哪些成分？ 1.提問(wèn)(twn)：用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？ 雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取；人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白共三十一頁(yè)血紅蛋白兩個(gè)肽鏈兩個(gè)一肽鏈四個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有(hn yu)血紅素而呈紅色。血紅蛋白(xuhng dnbi)的特點(diǎn)：共三十一頁(yè)1.分離(fnl)生物大分子的基本思路： 選用一定的物理或化學(xué)的方法分離(fnl)具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提

3、取的原理： 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同種類的蛋白質(zhì)。 一、血紅蛋白的提取和分離共三十一頁(yè)（一） 凝膠色譜法（分配(fnpi)色譜法）2.凝膠： 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部(nib)有許多貫穿的通道。 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大 小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來(lái)進(jìn)行分離。1.概念：3.凝膠色譜法的原理 當(dāng)相對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢;而相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部

4、的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短，移動(dòng)速度較快。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。共三十一頁(yè)4.凝膠色譜法分離(fnl)蛋白質(zhì)的原理和具體過(guò)程共三十一頁(yè)凝膠色譜法分離(fnl)蛋白質(zhì)過(guò)程的動(dòng)畫(huà)演示共三十一頁(yè) （二）緩沖溶液(hun chn rn y) 1.概念(ginin): 在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液PH值基本保持不變的混合溶液。 能夠抵制外界的酸和堿對(duì)溶液PH值的影響，維持PH基本不變。2.作用:3.緩沖溶液的配制: 通常由12 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的

5、緩沖液。 4.提問(wèn)：在本課題中使用的緩沖液是:_ ,其目的是: 利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證 血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科 學(xué)研究(活性)磷酸緩沖液共三十一頁(yè) （三） 電泳(din yn)：1.概念(ginin)：帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。2.原理： 許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖

6、凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。共三十一頁(yè) 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其(yq)所帶電荷相反的電極移動(dòng)瓊脂糖凝膠電泳示意圖共三十一頁(yè) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 1、在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由單體(dn t)丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成(xngchng)交聯(lián)）丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)共三十一頁(yè) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。 （SDS的作用）為了(wi le

7、)消除凈電荷對(duì)遷移率的影響，可以在凝膠中加入SDS。2.原理(yunl)： SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。3. SDS作用機(jī)理:共三十一頁(yè)用SDS測(cè)定(cdng)蛋白質(zhì)分子量的方法 使用(shyng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量時(shí)，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，可以

8、測(cè)定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場(chǎng)上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。共三十一頁(yè) 二、實(shí)驗(yàn)(shyn)操作樣品處理(chl)粗分離純化純度鑒定1.樣品處理：（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過(guò)程 本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎 動(dòng)物的血液來(lái)分離血紅蛋白。(1)紅細(xì)胞的洗滌:洗滌目的: 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，洗滌次數(shù)不可過(guò)少。洗滌操作： 1、采集血樣。2、低速短時(shí)間離心（速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時(shí)間）6

9、、重復(fù)4、5步驟三次，直至上清液中已沒(méi)有黃色，表明洗滌干凈。共三十一頁(yè)(2)血紅蛋白(xuhng dnbi)的釋放： 加蒸餾水到原血液體積(tj)，再加40體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液： 過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min。試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜

10、置片刻后，分出下層的紅色透明液體。共三十一頁(yè)甲苯層（無(wú)色(w s)透明）白色薄層(bo cn)固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次共三十一頁(yè)(4)透 析： 過(guò)程：取1ml的血紅蛋白(xuhng dnbi)溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。 透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。共三十一頁(yè)透析過(guò)程(guchng)動(dòng)畫(huà)演示共三十一頁(yè)2.凝膠色譜(s p)操作:（1）凝膠色譜(s p)柱的制作： 取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)

11、，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項(xiàng)：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。頂塞的制作：打孔安裝玻璃管。組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。共三十一頁(yè)（2）凝膠色譜(s p)柱的裝填 凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。 凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。 凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱

12、裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得(bu de)有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。共三十一頁(yè) 洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/L的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時(shí)。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響(yngxing)液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。（2）凝膠色譜(

13、s p)柱的裝填50cm高共三十一頁(yè)（3）樣品加入(jir)與洗脫 調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。 滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)(ydng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。 洗脫：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。 收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一

14、致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功） 注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。共三十一頁(yè)（3）樣品(yngpn)加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要(byo)觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。共三十一頁(yè)思考(sko)下面的問(wèn)題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定(wndng)的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。 1、在血紅蛋白純化的整個(gè)過(guò)程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？ 2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該

15、收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 共三十一頁(yè) 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白(dnbi)除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。3、你能描述血紅蛋白分離的完整(wnzhng)過(guò)程嗎？共三十一頁(yè)（三）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）2.試劑(shj)的配制：鑒定血紅蛋白(xuhng dnbi)純度。1.目的：3.方法步驟：（

16、略）共三十一頁(yè)教學(xué)(jio xu)反饋 1凝膠色譜法是根據(jù)（ ）分離蛋白質(zhì)的有效方法。 A分子的大小 B相對(duì)分子質(zhì)量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度2緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來(lái)維持（ ）基本不變。 A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度3電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下向著與其所帶電荷（ ）的電極移動(dòng)。 A相同 B相反 C相對(duì) D相向(xingxing)4. 哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（ ）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。 A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動(dòng)蛋白 D肌球蛋白BBBA共三十一頁(yè)5血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的含量最多。 A白細(xì)胞 B血小板 C紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞6為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)?）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉7將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心(lxn)管中，離心(lxn)后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層， 其中第3層是（ ） A無(wú)色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物CDC共三十一頁(yè)內(nèi)容摘要本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)。瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿的通道。酸或強(qiáng)堿的影響使原來(lái)溶液PH值基本保持不變的混。能夠抵制外界的酸和堿對(duì)