1、DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展一、DNA序列測(cè)定的意義二、測(cè)序技術(shù)的建立三、DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展四、DNA測(cè)序技術(shù)的展望五、DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用 DNA的序列測(cè)定是分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達(dá)與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對(duì)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)了解。一、DNA序列測(cè)定的意義 人類基因組計(jì)劃（Human Genome ProjectHGP）于1990年正式啟動(dòng)，其主要目標(biāo)有：識(shí)別人類DNA中所有基因（超過(guò)10萬(wàn)個(gè)）；測(cè)定組成人類DNA的30億堿基對(duì)的序列；將這些信息儲(chǔ)存到數(shù)據(jù)庫(kù)中；

2、開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計(jì)劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會(huì)問題。已于2003年完成。人類基因組計(jì)劃是當(dāng)代生命科學(xué)一項(xiàng)偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價(jià)值。造福人類的HGP1949年, Frederick Sanger開發(fā)了測(cè)定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術(shù),1953年測(cè)定了胰島素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白質(zhì)的N端測(cè)序技術(shù),后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。1965年，Sanger等發(fā)明了RNA的小片段序列測(cè)定法,并完成了大腸桿菌5S rRNA的120個(gè)核苷酸的測(cè)定。同一時(shí)期,Ho

3、lley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA的序列測(cè)定。蛋白質(zhì)和RNA的測(cè)序技術(shù)二、測(cè)序技術(shù)的建立1975年，Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測(cè)定DNA序列。1977年， Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了雙脫氧鏈終止法,使得DNA序列測(cè)定的效率和準(zhǔn)確性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert報(bào)道了化學(xué)降解法測(cè)定DNA的序列。DNA測(cè)序技術(shù)的建立 DNA序列測(cè)定技術(shù)出現(xiàn)后,迅速超越了蛋白質(zhì)和RNA測(cè)序技術(shù),成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的技術(shù)。三、DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展第一代DNA測(cè)序技術(shù)第二代DNA測(cè)序技術(shù)第三代DNA測(cè)序技術(shù)1、第一代DNA測(cè)序技術(shù)第一代DNA

4、測(cè)序技術(shù)： 傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來(lái)的各種DNA測(cè)序技術(shù)。 第一代DNA測(cè)序技術(shù)包括：化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法、熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)和雜交測(cè)序技術(shù)。1.1 化學(xué)降解法基本原理: 利用特異的選擇性試劑，專一性的隨機(jī)斷裂DNA成不同長(zhǎng)短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類，從而測(cè)出DNA的序列。 將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂?每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶 分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體 電泳,讀取DNA的核苷酸順序技術(shù)路線堿基特異修飾方法GPh8.

5、0,用硫酸二甲酯對(duì) N7進(jìn)行甲基化,使 C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/L NaCl存在時(shí),可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù) 化學(xué)降解法剛問世時(shí)，準(zhǔn)確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來(lái)自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時(shí)造成的錯(cuò)誤。但化學(xué)降解法操作過(guò)程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡(jiǎn)便快速的Sanger法所代替。1.

6、2 雙脫氧鏈終止法 又稱為Sanger法。該法的原理是：利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribo nucleoside triphos phate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對(duì)原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長(zhǎng)短不一的引物延伸鏈，通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按53方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列 。 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH雙脫氧鏈末端終止法測(cè)序原理示意圖

7、 Sanger法因操作簡(jiǎn)便，得到廣泛的應(yīng)用。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測(cè)序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)。1.3 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù) 熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標(biāo)記代替同位素標(biāo)記，并用成像系統(tǒng)自動(dòng)檢測(cè)，從而大大提高了DNA測(cè)序的速度和準(zhǔn)確性。 目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied biosystems ，ABI)3730系列自動(dòng)測(cè)序儀即是基于毛細(xì)管電泳和熒光標(biāo)記技術(shù)的DNA測(cè)序儀。如ABI3730XL測(cè)序儀擁有96道毛細(xì)管，4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標(biāo)記，在通過(guò)毛細(xì)管時(shí)不同長(zhǎng)度的DNA片段上的4種熒光基團(tuán)被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CC

8、D檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別，并直接翻譯成DNA序列。目前所用自動(dòng)測(cè)序技術(shù)的改進(jìn)3730全自動(dòng)測(cè)序儀1.4雜交測(cè)序技術(shù) 該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測(cè)的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 雜交測(cè)序檢測(cè)速度快，采用標(biāo)準(zhǔn)化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測(cè)的成本，具有部分第二代測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測(cè)定。 通過(guò)幾十年的逐步改進(jìn), 第1 代測(cè)序儀的讀長(zhǎng)可以超過(guò)1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率可以高達(dá)99.999%, 測(cè)定每千堿基序列的成本是0.5 美元, 每天的數(shù)據(jù)通量可

9、以達(dá)到600000 堿基。 第一代測(cè)序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過(guò)重要的作用,如人類基因組計(jì)劃(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA測(cè)序技術(shù)。目前基于熒光標(biāo)記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動(dòng)測(cè)序儀仍被廣泛地應(yīng)用。 隨著人類基因組計(jì)劃的完成,人們進(jìn)入了后基因組時(shí)代,即功能基因組時(shí)代,傳統(tǒng)的測(cè)序方法已經(jīng)不能滿足深度測(cè)序和重復(fù)測(cè)序等大規(guī)?；蚪M測(cè)序的需求,這促使了新一代DNA測(cè)序技術(shù)的誕生。新一代測(cè)序技術(shù)即第二代測(cè)序技術(shù)。2、第二代DNA測(cè)序技術(shù) 第二代測(cè)序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GS FLX測(cè)序平臺(tái)、Illumina公司的Solexa Genom

10、e Analyzer測(cè)序平臺(tái)和ABI公司的SOLiD測(cè)序平臺(tái)。 第二代測(cè)序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)序,使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序或基因組深度測(cè)序變得方便易行。 第二代測(cè)序技術(shù)將片段化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭,隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)空間固定的PCR克隆陣列。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫(kù)片段的多個(gè)拷貝組成。然后進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)。由于所有的克隆都在同一平面上,這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行,每個(gè)延伸反應(yīng)所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行,從而獲得測(cè)序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測(cè)不斷重復(fù),最后經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)分析就可以獲得完整的DNA序列信息。 第二代

11、測(cè)序技術(shù)包括：454測(cè)序技術(shù)、Solexa測(cè)序技術(shù)和SOLiD測(cè)序技術(shù)。2.1 454測(cè)序技術(shù) 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個(gè)dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)的有無(wú)和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA序列的目的。 454生命科學(xué)公司在2005年最早推出了第二代測(cè)序平臺(tái)Genome Sequencer 20，并測(cè)序了支原體Mycoplasma genitalium的基因組。 并在2007年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測(cè)序系統(tǒng)一Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。羅氏在2005年便與454公司洽

12、談并購(gòu)事宜，2007年完成并購(gòu)，緊接著公布了DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一沃森(Jim Watson)的個(gè)人基因組，測(cè)序總花費(fèi)不到一百萬(wàn)美元。2.2 Solexa測(cè)序技術(shù) 核心技術(shù)：“DNA簇”和“可逆性末端終止” 。 原理：將基因組DNA的隨機(jī)片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flow cell），這些DNA片段經(jīng)過(guò)延伸和橋式擴(kuò)增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億計(jì)Cluster，每個(gè)Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團(tuán)的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過(guò)可逆性終止的SBS（邊合成邊測(cè)序）技術(shù)對(duì)待測(cè)的模板DNA進(jìn)行測(cè)序。 Illumina公司的新一代測(cè)序儀Genome An

13、alyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測(cè)序(Sequencingby Synthesis)的原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化樣本制備及大規(guī)模平行測(cè)序。 Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單，減少了樣品分離和制備的時(shí)間，配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到250 bp，每次運(yùn)行后可獲得超過(guò)20 GB的高質(zhì)量過(guò)濾數(shù)據(jù)，且運(yùn)行成本較低，是性價(jià)比較高的新一代測(cè)序技術(shù)。 SOLID通過(guò)連接反應(yīng)進(jìn)行測(cè)序。其基本原理是以四色熒光標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫(kù)準(zhǔn)備擴(kuò)增微珠與玻片連接連接測(cè)序 超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點(diǎn)，目前SOLID 3

14、單次運(yùn)行可產(chǎn)生50 GB的序列數(shù)據(jù)，相當(dāng)于17倍人類基兇組覆蓋度。2.3 SOLiD測(cè)序技術(shù)3、第三代DNA測(cè)序技術(shù) 第三代測(cè)序技術(shù)是以單分子測(cè)序?yàn)樘攸c(diǎn)的測(cè)序技術(shù)。如生物科學(xué)公司(BioScience Corporation)的HeliScope單分子測(cè)序儀(HeliScope SingleMolecular Sequencer)以及正在研制的太平洋生物科學(xué)公司(Pacific Biosciences)的單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technology和牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore T

15、echnologiesLtd)的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)等。 目前,我國(guó)也啟動(dòng)了第三代測(cè)序技術(shù)的研究。2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室”,利用各自的優(yōu)勢(shì)聯(lián)合研發(fā)國(guó)產(chǎn)第三代測(cè)序儀,第一臺(tái)樣機(jī)預(yù)計(jì)2013年問世,屆時(shí)有望緩解測(cè)序儀核心技術(shù)受制于國(guó)外公司的現(xiàn)狀。 第二代的高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用, 但是由于其測(cè)序速度、成本、準(zhǔn)確度等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測(cè)序解決方案。 單分子測(cè)序也就應(yīng)運(yùn)而生。第三代測(cè)序技術(shù)非常驚人！1、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測(cè)10個(gè)堿基，測(cè)序

16、速度是化學(xué)法測(cè)序的2萬(wàn)倍。2、它實(shí)現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長(zhǎng)的片段），一個(gè)反應(yīng)就可以測(cè)非常長(zhǎng)的序列。 二代測(cè)序現(xiàn)在可以測(cè)到上百個(gè)堿基，但是三代測(cè)序現(xiàn)在就可以測(cè)幾千個(gè)堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達(dá)到99.9999%。4、可直接測(cè)RNA序列。5、可直接測(cè)甲基化的DNA序列。 2008年4月，Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上報(bào)道了他們開發(fā)的真正的單分子測(cè)序技術(shù),并利用該技術(shù)對(duì)一個(gè)M13病毒基因組進(jìn)行重測(cè)序。 這項(xiàng)技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測(cè)序,

17、是因?yàn)樗耆邕^(guò)了前述3種高通量測(cè)序依賴的基于PCR擴(kuò)增的信號(hào)放大過(guò)程,真正達(dá)到了讀取單個(gè)熒光分子的能力。 斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最近利用Heliscope單分子測(cè)序儀,用了48 000美元的試劑和4個(gè)星期的時(shí)間,對(duì)一名白人男子的基因組進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序的覆蓋度達(dá)28倍,覆蓋了90%的人類參考基因組。序列讀長(zhǎng)24-70 bp,平均讀長(zhǎng)為32 bp,并鑒定出280萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)和752個(gè)拷貝數(shù)變異。3.1 HeliScope單分子測(cè)序儀 Pacific bioscience 在Science上報(bào)道了他們的基于SMART技術(shù)的單分子測(cè)序技術(shù),該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶,在聚合反應(yīng)的同時(shí)就可以讀取

18、測(cè)序產(chǎn)物,目前一期的讀取速度為3bp / s,但他們聲稱在2013 前實(shí)現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。Pacific技術(shù)目前在研究大腸桿菌基因組時(shí)的評(píng)價(jià)讀長(zhǎng)為586個(gè)堿基,有些能達(dá)到2805堿基,新儀器的單個(gè)讀長(zhǎng)已達(dá)10351個(gè)堿基,而且有望實(shí)現(xiàn)更大的讀長(zhǎng),而且準(zhǔn)確率99.9999%。 3.2 單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù) 英國(guó)牛津納米公司成功研制出了基于納米孔的單分子測(cè)序技術(shù),該技術(shù)讀取數(shù)據(jù)的速度更快,而且成本會(huì)大大降低 。 在該測(cè)序技術(shù)平臺(tái)中,DNA分子以一次一個(gè)堿基的速度依次通過(guò)納米小孔,利用核酸外切酶的特性來(lái)識(shí)別出不同的DNA堿基,同時(shí)還能檢測(cè)出堿基是否被甲基化等相關(guān)的重要信息。3.3 納米孔單分子測(cè)序技術(shù) 據(jù)2010 年7 月30 日Xiao Yan（Nano Lett，July 30，2010）報(bào)道，美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員開發(fā)出一個(gè)納米級(jí)的碳基平臺(tái)，可用于電子探測(cè)單個(gè)DNA 分子。該技術(shù)最終有望在快速DNA 電子測(cè)序方面發(fā)揮“用武之地”。這個(gè)納米平臺(tái)由石墨烯制成。研究小組利用電子束技術(shù)，在石墨烯膜上燒灼出納米大小的小孔，在電場(chǎng)的作用下，微小的DNA鏈就可以穿過(guò)這些孔洞。通過(guò)電子測(cè)量手段檢測(cè)DNA 的易位，再根據(jù)DNA 的4 個(gè)堿基各自獨(dú)特的“電子簽名”，就可以快速完成DNA 測(cè)序。探測(cè)單個(gè)DNA 分子技術(shù)開啟高通