1、實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)材料四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟五、思考題一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解抗生素和抗生素抗性的作用機(jī)制。2.掌握藥敏試驗(yàn)的原理和臨床意義。3.掌握藥敏試驗(yàn)擴(kuò)散法的實(shí)驗(yàn)操作。二、實(shí)驗(yàn)原理1.抗生素作用機(jī)制影響細(xì)胞壁的合成，如青霉素、萬古霉素；抑制蛋白質(zhì)的合成，如四環(huán)素、氯霉素；作用于細(xì)胞膜，如多粘菌素、多烯類化合物；抑制核酸的合成，如利福平、氯喹；干擾酶系統(tǒng)，如大環(huán)內(nèi)酯類。 2.抗生素抗性作用機(jī)制青霉素-內(nèi)酰氨分子相似于肽聚糖單體，可與轉(zhuǎn)肽酶抑制性結(jié)合，從而抑制肽聚糖多鏈的合成（主要針對(duì)G+細(xì)菌)。1929年英國科學(xué)家弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉具有抗葡萄球菌的能力；1939年

2、，牛津大學(xué)弗洛里與錢恩二人利用發(fā)酵的方法，成功提取出了青霉素抗性質(zhì)粒編碼-內(nèi)酰氨酶，可以破壞青霉素分子中的酰氨鍵從而使青霉素失活。氯霉素與氯霉素抗性細(xì)菌細(xì)胞的70S核糖體是合成蛋白質(zhì)的主要細(xì)胞成分，它包括50S和30S兩個(gè)亞基。氯霉素通過可逆地與50S亞基結(jié)合,阻斷轉(zhuǎn)肽酰酶的作用，從而使新肽鏈的形成受阻，抑制蛋白質(zhì)合成（廣譜抗菌）?；蚪M突變導(dǎo)致抗生素分子不能與作用位點(diǎn)結(jié)合?？剐再|(zhì)粒含有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，修飾氯霉素分子。與16S rRNA結(jié)合抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。抗性質(zhì)粒編碼一個(gè)蛋白泵可以將四環(huán)素分子泵到細(xì)菌細(xì)胞外面。四環(huán)素和四環(huán)素抗性3.藥敏試驗(yàn)1.稀釋法：待檢細(xì)菌接種于不同稀釋濃度的固體或

3、液體培養(yǎng)基上，測(cè)定MIC或MBC。2.擴(kuò)散法：抗菌藥物置于接種細(xì)菌的固體培養(yǎng)基上，測(cè)定待檢細(xì)菌的抑菌環(huán)。稀釋法MIC：Minimal inhibition concentrationMBC：Minimal bacteriocidal concentration抗菌藥物稀釋成不同濃度接種待測(cè)菌進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)定細(xì)菌的最低抑制濃度(MIC）或最低殺菌濃度（MBC） 精確擴(kuò)散法接種待測(cè)菌在固體培養(yǎng)基上將抗菌藥物置于接菌培養(yǎng)基上抗菌藥物向培養(yǎng)基中擴(kuò)散，形成濃度梯度抑制細(xì)菌的生長，從而出現(xiàn)抑菌環(huán)根據(jù)抑菌環(huán)的大小，判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感度 定性三、實(shí)驗(yàn)材料被檢細(xì)菌:麥?zhǔn)媳葷峁芩幟艏埰?滅菌生理鹽水培養(yǎng)皿和棉簽四、

4、實(shí)驗(yàn)方法和步驟細(xì)菌培養(yǎng)比濁稀釋菌液涂布貼藥敏紙片無菌操作1.細(xì)菌培養(yǎng)：挑取菌落45個(gè)，接種于肉湯培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)612小時(shí)。2.比濁：取1ml的細(xì)菌懸液，用麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)定濃度。3.稀釋：根據(jù)測(cè)定的濃度和終濃度（1.5億/ml），計(jì)算出需要補(bǔ)加的生理鹽水的量，進(jìn)行稀釋和矯正。4. 菌液涂布：用無菌的棉拭子蘸取上述細(xì)菌懸液，用棉拭子涂于瓊脂表面，蓋好平皿，在室溫干燥510 min，待平皿表面稍干后再放含藥紙片。5. 貼藥敏紙片：用鑷子取出含藥紙片貼在涂有細(xì)菌的平皿表面，之后輕輕按壓。（將學(xué)號(hào)或姓名寫在平皿上）直徑9cm6.將平皿放在37溫箱中培養(yǎng)1618h，觀察結(jié)果。7.結(jié)果觀察：次日上午9:30-10:00，407室有無污染；有無抑菌環(huán)；量其直徑大小(mm)。