1、生化工程進展堵國成江南大學 生物工程學院第1頁，共205頁?，F(xiàn)代生化工程的主要研究內(nèi)容發(fā)酵過程的優(yōu)化控制技術(shù)2.生化過程的模型化3.高密度培養(yǎng)技術(shù)4.代謝工程和代謝網(wǎng)絡(luò)控制5.新型生化反應(yīng)器的研究和開發(fā)6.新型發(fā)酵和產(chǎn)品分離技術(shù)第2頁，共205頁。發(fā)酵過程的優(yōu)化控制第一部分 緒論一. 發(fā)酵過程優(yōu)化在生化工程中的地位二. 發(fā)酵過程優(yōu)化的目標和研究內(nèi)容三. 發(fā)酵過程優(yōu)化的研究進展四. 流加發(fā)酵過程的優(yōu)化控制第3頁，共205頁。一. 發(fā)酵過程優(yōu)化在生化工程中的地位現(xiàn)代生物技術(shù)不僅能在生產(chǎn)新型食品、飼料添加劑、藥物的過程中發(fā)揮重要的作用，還能經(jīng)濟、清潔地生產(chǎn)傳統(tǒng)生物技術(shù)或一般化學方法很難生產(chǎn)的特殊化學

2、品，在解決人類面臨的人口、糧食、健康、環(huán)境等重大問題的過程中必將發(fā)揮積極的作用如何才能更好地發(fā)揮現(xiàn)代生物技術(shù)的作用？以工業(yè)微生物為例，選育或構(gòu)建一株優(yōu)良菌株僅僅是一個開始，要使優(yōu)良菌株的潛力充分發(fā)揮出來，還必須優(yōu)化其發(fā)酵過程，以獲得較高的產(chǎn)物濃度(便于下游處理)、較高的底物轉(zhuǎn)化率(降低原料成本)和較高的生產(chǎn)強度(縮短發(fā)酵周期)第4頁，共205頁。發(fā)酵過程優(yōu)化的主要研究內(nèi)容第一個方面是細胞生長過程研究第二個方面是微生物反應(yīng)的化學計量第三個方面是生物反應(yīng)過程動力學的研究（主要研究生物反應(yīng)速率及其影響因素）第四個方面的內(nèi)容是生物反應(yīng)器工程（包括生物反應(yīng)器及參數(shù)的檢測與控制）二. 發(fā)酵過程優(yōu)化的研究內(nèi)

3、容和目標第5頁，共205頁。發(fā)酵過程優(yōu)化的目標使細胞生理調(diào)節(jié)、細胞環(huán)境、反應(yīng)器特性、工藝操作條件與反應(yīng)器控制之間這種復雜的相互作用盡可能地簡化，并對這些條件和相互關(guān)系進行優(yōu)化，使之最適于特定發(fā)酵過程的進行發(fā)酵過程優(yōu)化的基礎(chǔ)是進行生物反應(yīng)宏觀動力學和生物反應(yīng)器的研究第6頁，共205頁。如何實現(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化控制？第7頁，共205頁。生物反應(yīng)過程動力學動力學模型的建立發(fā)酵過程優(yōu)化控制實現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化控制的過程第8頁，共205頁。生物反應(yīng)動力學的研究內(nèi)容：是有關(guān)生物的、化學的與物理過程之間的相互作用，諸如生物反應(yīng)器中發(fā)生的細胞生長、產(chǎn)物生成、傳遞過程等生物反應(yīng)動力學研究的目的：是為描述細胞動態(tài)行為提

4、供數(shù)學依據(jù)，以便進行數(shù)量化處理第9頁，共205頁。建立動力學模型的目的：是為了模擬實驗過程，對適用性很強的動力學模型，還可以推測待測數(shù)據(jù)，進而確定最佳生產(chǎn)條件發(fā)酵過程優(yōu)化涉及非結(jié)構(gòu)模型和結(jié)構(gòu)模型的建立第10頁，共205頁。什么是非結(jié)構(gòu)模型？什么是結(jié)構(gòu)模型呢？第11頁，共205頁。非結(jié)構(gòu)模型把細胞視為單組分，則環(huán)境的變化對細胞組成的影響可被忽略，即細胞的生長處于所謂的平衡生長狀態(tài)，此基礎(chǔ)上建立的模型稱為非結(jié)構(gòu)模型非結(jié)構(gòu)模型是在實驗研究的基礎(chǔ)上，通過物料衡算建立起的經(jīng)驗或半經(jīng)驗關(guān)聯(lián)模型第12頁，共205頁。結(jié)構(gòu)模型由于細胞內(nèi)各組分的合成速率不同而使各組分增加的比例不同，即細胞生長處于非均衡狀態(tài)時，

5、必須運用從生物反應(yīng)機理出發(fā)推導得到的結(jié)構(gòu)模型在考慮細胞組成變化的基礎(chǔ)上建立的模型，稱為結(jié)構(gòu)模型第13頁，共205頁。生物反應(yīng)器工程的研究內(nèi)容生物反應(yīng)器的形式、結(jié)構(gòu)、操作方式、物料的流動與混合狀況、傳遞過程特征等是影響微生物反應(yīng)宏觀動力學的重要因素第14頁，共205頁。生物反應(yīng)器中復雜的相互關(guān)系第15頁，共205頁。三. 發(fā)酵過程優(yōu)化的研究進展20世紀40年代初抗生素工業(yè)的興起，標志著發(fā)酵工業(yè)進入了一個新階段40年代末一門反映生物和化工相交叉的學科生化工程誕生1954年, Hasting指出, 生化工程要解決的十大問題是深層培養(yǎng)、通氣、空氣除菌、攪拌、結(jié)構(gòu)材料、容器、冷卻方式、設(shè)備及培養(yǎng)基除菌、

6、過濾、公害1964年Aiba等人認為通氣攪拌與放大是生化工程學科的核心，其中放大是生化工程的焦點20世紀60年代中期，建立了無菌操作的一整套技術(shù)第16頁，共205頁。1973年Aiba等人進一步指出，在大規(guī)模研究方面，僅僅把重點放在無菌操作、通氣攪拌等過程的物理現(xiàn)象解析和設(shè)備的開發(fā)上是不夠的，應(yīng)當進一步開展對微生物反應(yīng)本質(zhì)的研究1979年，日本學者山根恒夫編著了生物反應(yīng)工程一書，認為生物反應(yīng)工程是一門以速度為基礎(chǔ)，研究酶反應(yīng)、微生物反應(yīng)及廢水處理過程的合理設(shè)計、操作和控制的工程學1985年，德國學者卡爾許格爾提出生物反應(yīng)工程的研究應(yīng)當包括兩個方面的內(nèi)容一是宏觀動力學，它涉及生物、化學、物理之間

7、的相互關(guān)系；二是生物反應(yīng)器工程，它主要涉及反應(yīng)器本身，特別是不同的反應(yīng)器對生物化學和物理過程的影響第17頁，共205頁。目前一般認為生物反應(yīng)工程是一門以生物反應(yīng)動力學為基礎(chǔ)，研究生物反應(yīng)過程優(yōu)化和控制以及生物反應(yīng)器的設(shè)計、放大與操作的學科生物反應(yīng)工程的研究主要采用化學動力學、傳遞過程原理、設(shè)備工程學、過程動態(tài)學及最優(yōu)化原理等化學工程學原理，也涉及到生物化學、微生物學、微生物生理學和遺傳學等許多學科領(lǐng)域，因此是一門綜合性很強的邊緣學科生化反應(yīng)工程的核心是生物反應(yīng)過程的數(shù)量化處理和動力學模型的建立，實現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化則是生物反應(yīng)工程的研究目標第18頁，共205頁。實現(xiàn)發(fā)酵過程的優(yōu)化與控制，必須解決的

8、五個問題:(1)系統(tǒng)動力學；(2)生物模型；(3)傳感器技術(shù)；(4)適用于生物過程的最優(yōu)化技術(shù)；(5)計算機檢測系統(tǒng)發(fā)酵罐之間的接口技術(shù)(如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、專家系統(tǒng))第19頁，共205頁。1) 針對有關(guān)發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)過程進行微生物生長和產(chǎn)物形成的動力學研究，提出新的或修正的動力學模型或表達式；2)結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品的開發(fā)，進行基因工程菌、哺乳動物細胞或植物細胞的生長動力學和產(chǎn)物形成動力學的研究；3)在動力學研究的基礎(chǔ)上進行過程優(yōu)化控制的研究，包括狀態(tài)觀察方程的建立、觀察數(shù)據(jù)的噪聲過濾、不可測參數(shù)及狀態(tài)的識別、過程離線或在線的優(yōu)化控制。其中尤以流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究報道居多有關(guān)運用生物反應(yīng)工程原理進行

9、發(fā)酵過程優(yōu)化控制的研究第20頁，共205頁。四. 流加發(fā)酵所謂流加發(fā)酵，即補料分批發(fā)酵(Fed-batch fermentation)，有時又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵，是指在分批發(fā)酵過程中間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的發(fā)酵方法第21頁，共205頁。分批、連續(xù)、流加操作方式的比較第22頁，共205頁。流加發(fā)酵的研究進展在20世紀70年代以前流加發(fā)酵的理論研究幾乎是個空白，流加過程控制僅僅以經(jīng)驗為主，流加方式也僅僅局限于間歇或恒速流加1973年日本學者Yoshida等人首次提出了“Fed-Batch Fermentation”這個術(shù)語，并從理論上建立了第一個數(shù)學模型，流加發(fā)酵的研究才開始進入理論研究

10、階段第23頁，共205頁。流加發(fā)酵所取得的三個方面的重大進展 20世紀70年代中后期對流加發(fā)酵過程的動力學解析 結(jié)合發(fā)酵過程的可測參數(shù)對流加過程進行反饋控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代謝物法、螢光法等）流加發(fā)酵的最優(yōu)化研究第24頁，共205頁。流加發(fā)酵最優(yōu)化研究的核心問題是找出最佳的底物流加方式，以維持發(fā)酵過程始終處于最佳狀態(tài)流加發(fā)酵最優(yōu)化的研究內(nèi)容包括： （1）狀態(tài)方程的建立 （2）目標泛函的確定 （3）最優(yōu)化底物流加方式的求解第25頁，共205頁。流加發(fā)酵的物料衡算式可以表達為：流加發(fā)酵的最優(yōu)化理論有：格林原理、龐特里金最小值(最大值)原理等第26頁，共205頁。在采

11、用流加發(fā)酵技術(shù)之前要考慮的兩個問題一、何時采用流加發(fā)酵方式？二、如何進行底物的流加？第27頁，共205頁。一、何時采用流加發(fā)酵方式？所用底物在高濃度時對菌體生長有抑制作用 高菌體濃度培養(yǎng)即高密度培養(yǎng)系統(tǒng)非生長耦聯(lián)性次級代謝產(chǎn)物(如產(chǎn)物的合成需要某些營養(yǎng)物質(zhì)或前體)利用營養(yǎng)突變體的系統(tǒng)(過量加入營養(yǎng)物只能使菌體迅速生長，而目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量會減少。而當營養(yǎng)物嚴重缺乏時，菌體生長受抑制，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量也會減小 ) 營養(yǎng)缺陷型菌株的培養(yǎng)第28頁，共205頁。二、如何進行流加發(fā)酵操作？1. 流加發(fā)酵類型2. 采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題？3.流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定4.合適的流加發(fā)酵類型的確

12、定5. 流加方式的應(yīng)用第29頁，共205頁。1.流加發(fā)酵類型流加發(fā)酵的分類類別流 加 方 式無反饋控制反饋控制恒流量流加、變流量流加和間歇流加直接控制流加、間接控制流加定值控制流加、程序控制流加、最優(yōu)控制流加第30頁，共205頁。2. 采用流加發(fā)酵應(yīng)該解決的關(guān)鍵問題(1) 流加什么物質(zhì)？ 補充微生物能源和碳源，如在發(fā)酵液中添加葡萄糖、 飴糖、液化淀粉。作為消泡劑的天然油脂，有時也能同時起到補充碳源的作用 補充菌體所需要的氮源，有機氮或氨水 加入某些微生物生長或合成需要的微量元素或無機鹽 加入酶合成誘導物或前體物質(zhì)第31頁，共205頁。(2) 如何流加？ a.底物流加速率 b.流加開始時間及總流

13、加時間 c.需控制的底物濃度第32頁，共205頁。3. 流加發(fā)酵過程中某些重要參數(shù)的確定最佳底物濃度的確定 (包括菌體生長階段和產(chǎn)物合成階段)b. 底物的消耗速率c. 菌體比生長速率()d. 菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yx/s) 及產(chǎn)物對底物的產(chǎn)率系數(shù)(Yp/s)第33頁，共205頁。4. 合適的流加發(fā)酵類型的確定a.恒速流加(包括單一速率和分階段恒速流加)b.指數(shù)速率流加c.底物在線測定后的反饋流加(如葡萄糖反饋流加)d. pH-state. DO-stat第34頁，共205頁。5. 流加方式的應(yīng)用(1) 恒速流加采用恒流速流加培養(yǎng)時，可得到如下的物料平衡方程式：細胞平衡：碳平衡：產(chǎn)物平衡：體積

14、平衡：第35頁，共205頁。恒流速流加過程中的流量F的確定：預(yù)試驗中所得出的流加時刻菌體對所流加基質(zhì)的消耗速率發(fā)酵液中殘留基質(zhì)濃度流加后需要控制的發(fā)酵液中的基質(zhì)濃度第36頁，共205頁。(2) 指數(shù)速率流加在菌體生長階段采用指數(shù)速率流加法的幾點假設(shè)如下：(a) 發(fā)酵罐內(nèi)為理想混合；(b) 葡萄糖為唯一限制性碳源；(c) 殘留菌體對葡萄糖的產(chǎn)率系數(shù)(YX/s)為常數(shù)；(d) 菌體生長遵循Monod方程。第37頁，共205頁。對底物葡萄糖進行衡算，則： F為體積流加速率(L/h)，S0為流加液中基質(zhì)濃度(g/L)，Yx/s為菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)(g/g)，ms為細胞比維持系數(shù)(g/g/h)，X為菌

15、體濃度(g/L)，V為培養(yǎng)液體積(L)，為菌體比生長速率(h-1)。 第38頁，共205頁。對菌體量的變化進行物料衡算，則：假定為常數(shù)，則上式積分可得： 第39頁，共205頁。 由于生長符合Monod方程是S的函數(shù)，要使恒定，S必須恒定，則有：第40頁，共205頁。其中tF為開始指數(shù)速率流加的時間，ttF，XF和VF分別為tF時刻的菌體濃度和發(fā)酵液體積 指數(shù)速率流加的速率F的表達式為:第41頁，共205頁。指數(shù)速率流加方式在實際過程中的注意事項：方程中各參數(shù)要預(yù)先求知應(yīng)用時流加速率F可采用階梯遞增方式進行設(shè)定第42頁，共205頁。高生產(chǎn)率和高細胞密度發(fā)酵1. 細胞生長環(huán)境的優(yōu)化策略(1)培養(yǎng)基

16、組成的優(yōu)化(2)特殊營養(yǎng)物的添加(3)限制代謝副產(chǎn)物的積累2. 培養(yǎng)模式(1)所培養(yǎng)細胞的具體代謝行為(2)利用抑制性底物合成目的產(chǎn)物的潛力(3)誘導條件以及測量細胞培養(yǎng)各項參數(shù)的能力3. 誘導策略4. 細胞循環(huán)發(fā)酵 (應(yīng)用限制：作用于進入過濾單元的細胞的剪應(yīng)力太大；系統(tǒng)的放大存在許多實際困難)第43頁，共205頁。第二部分 發(fā)酵過程優(yōu)化原理一.發(fā)酵過程優(yōu)化的微生物反應(yīng)原理二.發(fā)酵過程數(shù)量化方法 三.微生物反應(yīng)動力學 四.微生物反應(yīng)優(yōu)化的一般原理第44頁，共205頁。 一.發(fā)酵過程優(yōu)化的微生物反應(yīng)原理 1. 大腸桿菌生長過程中觀察到下列現(xiàn)象(1)在大腸桿菌快速生長期間，生物合成的中間體很少滲漏

17、到胞外培養(yǎng)基中，結(jié)構(gòu)單元(氨基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率一致(2)大腸桿菌胞內(nèi)的大分子物質(zhì)隨比生長速率而變化(3)一旦生長培養(yǎng)基中的結(jié)構(gòu)單元足夠，細胞就不再合成這些物質(zhì)(4)特定的代謝途徑代謝特定的底物，只有底物存在時，細胞才合成相應(yīng)的酶(5)若兩個不同的底物同時存在于培養(yǎng)基中，細胞先合成能在一種底物上以較高比生長速率生長的酶系，當這種底物消耗完畢，再合成利用另一底物的酶。第45頁，共205頁。2. 細胞生長過程可分為三個步驟：(1)底物傳遞進入細胞(2)通過胞內(nèi)反應(yīng)，將底物轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎|(zhì)和代謝產(chǎn)物(3)代謝產(chǎn)物排泄進入非生物相，即胞外培養(yǎng)基第46頁，共205頁。3. 底物、代

18、謝產(chǎn)物和細胞質(zhì)成分的定義為：底物是一種存在于初始非生物相或者攝入物中起作用的可交換的化合物代謝產(chǎn)物是一種作為代謝物產(chǎn)生于某代謝途徑進入非生物相的化合物細胞質(zhì)成分是一種細胞利用底物產(chǎn)生的不可交換的化合物第47頁，共205頁。研究表明在膜上可能存在三種不同的運輸機制：(1)自由擴散(2)協(xié)助擴散(3)主動運輸前兩種機制是沿著濃度梯度進行運輸，是被動的過程，在運輸過程中不需要提供外部能量。而主動過程逆著濃度梯度進行運輸，需要輸入一定的吉布斯自由能。第48頁，共205頁。 微生物體內(nèi)不同底物和代謝產(chǎn)物的擴散過程第49頁，共205頁。4. 微生物細胞的胞內(nèi)反應(yīng)(1)分解代謝反應(yīng) 糖類在轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物(C

19、O2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同時，還形成ATP、NADH和NADPH。NADH和NADPH都在分解代謝反應(yīng)中產(chǎn)生，但NADPH主要消耗于合成代謝中，NADH則主要消耗于分解代謝途徑，如氧化磷酸化(2)生物合成和聚合反應(yīng) 為了合成細胞物質(zhì)，需要合成結(jié)構(gòu)單元并將其聚合。合成蛋白質(zhì)需消耗大量的自由能，細胞一般根據(jù)其自身需求來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成,其合成由蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(PSS)負責，該系統(tǒng)中核糖體是主要部分 E. coli中大約70%的能量和還原力用于合成蛋白質(zhì)第50頁，共205頁。合成E. coli細胞對前體代謝物的需求細胞合成所需要的結(jié)構(gòu)單元數(shù)在75100之間，這些物質(zhì)都是從12種前體代謝物合成得到

20、的，這些前體代謝物就是分解代謝反應(yīng)的中間產(chǎn)物，因此分解代謝在細胞生長過程中起著雙重的作用(為生物合成提供能量和前體代謝物)第51頁，共205頁。（3）次級細胞代謝 細胞代謝和生長過程偶聯(lián)在一起的過程，稱之為初級代謝 但許多工業(yè)上重要的產(chǎn)品，其合成反應(yīng)并不與生長過程偶聯(lián)，我們稱之為次級代謝，這些反應(yīng)合成的產(chǎn)物叫次級代謝產(chǎn)物，就象初級代謝形成的產(chǎn)物叫初級代謝產(chǎn)物一樣 （？）乳酸是初級代謝產(chǎn)物，但它是乳酸菌在非生長條件下形成的，許多其它的初級代謝產(chǎn)物也同樣是在非生長條件下產(chǎn)生的 第52頁，共205頁。初級代謝產(chǎn)物定義為“在細胞生長所需要的反應(yīng)中形成的產(chǎn)物”可能比較確切一些次級代謝產(chǎn)物定義為“在那些對

21、于細胞生長不重要的反應(yīng)中形成的產(chǎn)物”第53頁，共205頁。一些工業(yè)上重要的初級和次級代謝產(chǎn)物一覽第54頁，共205頁。二.發(fā)酵過程數(shù)量化方法發(fā)酵過程的數(shù)量化處理包括：1. 發(fā)酵過程的速度2. 化學計量學和熱力學3. 生產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率只有當變量可測量時，才有可能對發(fā)酵過程進行數(shù)量化處理第55頁，共205頁。1. 發(fā)酵過程的速度發(fā)酵過程的速度概念第56頁，共205頁。發(fā)酵過程常規(guī)的參數(shù)及其測量第57頁，共205頁。菌體生長速度為 氧和底物利用速度為 P、C和HV生成速度為:第58頁，共205頁。細胞生長的比速率為： 底物消耗的比速率為qs 產(chǎn)物形成的比速率為qp：第59頁，共205頁。 氧消耗

22、的比速率為qo： 二氧化碳生成的比速率 為qc：發(fā)酵熱生成的比速率：第60頁，共205頁。2. 化學計量學化學計量方程 表示通用化了的碳源 根據(jù)元素分析得出的細胞組成 表示產(chǎn)物第61頁，共205頁。 3. 產(chǎn)率系數(shù)(1)宏觀產(chǎn)率系數(shù)宏觀產(chǎn)率系數(shù)(或稱得率系數(shù))Yi/j是化學計量學中一種非常重要的參數(shù)，常用于對碳源等底物形成菌體或產(chǎn)物的潛力進行評價，其中i表示菌體或產(chǎn)物，j表示底物例如，菌體對底物的產(chǎn)率系數(shù)可表示為：第62頁，共205頁。生物反應(yīng)過程中宏觀產(chǎn)率系數(shù)的定義總覽第63頁，共205頁。有時，以摩爾為單位表示產(chǎn)率系數(shù)更有利：相似的概念可用于表達重要的常數(shù)： 值在實踐中對推導元素平衡方程很

23、重要，對與氧化磷酸化有關(guān)的理論問題也有重要意義第64頁，共205頁。假設(shè)發(fā)酵過程中完全沒有菌體生成，則YP/S可達理論最高值，稱為理論代謝產(chǎn)物產(chǎn)率（a）根據(jù)化學計量關(guān)系計算例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化學計量方程為依此計算，=147/180=0.82此處沒有考慮反應(yīng)過程中NADH及ATP等輔助底物的生成和消耗(2)理論代謝產(chǎn)物產(chǎn)率第65頁，共205頁。（b）由生物化學計量關(guān)系計算根據(jù)由底物生成目標代謝產(chǎn)物的代謝途徑，進行代謝過程中有關(guān)NAD(P)+和ATP等輔底物的物料衡算，結(jié)合化學計量關(guān)系可求出上式：由該反應(yīng)式得=(14713)/(12180)=0.75此處-酮戊二酸的氨基化還原反應(yīng)中

24、所需要的NADPH由異檸檬酸脫氫反應(yīng)供給!！用生化計量式時, 必須清楚有關(guān)的代謝途徑第66頁，共205頁。(c) 實際發(fā)酵過程中的產(chǎn)率系數(shù)在實際發(fā)酵中，產(chǎn)率是變化的，產(chǎn)率取決于下列因素：Y= f (菌株、底物、m、；、tm、OTR、C/N，P/O)式中m為混合度，S為底物濃度，為平均滯留時間，tm為混合時間，OTR為氧傳遞速度，C/N為碳氮比，P/O為磷氧比第67頁，共205頁。另外，Papoutsakis和Lim(1981)用碳流分支的概念來解釋菌體產(chǎn)率變化的原因：其中r1和r分別為碳源分支代謝途徑1和途徑2的反應(yīng)速度，MX和MS為菌體和底物的分子量，x是SX反應(yīng)的化學計量系數(shù)，可見產(chǎn)率只隨

25、r或r變化在甲基營養(yǎng)菌中存在兩種不同的碳代謝流：同化(r2)和氧化(r1)碳源和其它營養(yǎng)物的濃度或溫度、pH等培養(yǎng)條件的任何變化都可能引起r或r變化這一概念表明，甲基營養(yǎng)菌菌體產(chǎn)率的變化是一個動力學問題，而不是生物合成問題第68頁，共205頁。三. 微生物反應(yīng)動力學1. 被攝入到微生物細胞內(nèi)的底物中，一部分轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物，還有一部分則轉(zhuǎn)化為新生細胞的組成物質(zhì)。因此，對微生物反應(yīng)動力學進行研究，至少要對底物、菌體和產(chǎn)物三個狀態(tài)變量進行數(shù)學描述2. 微生物反應(yīng)是很多種物質(zhì)參與的復雜代謝過程的綜合結(jié)果。因此，微生物反應(yīng)的動力學方程只能通過數(shù)學模擬得到第69頁，共205頁。3. 進行數(shù)學模擬的難點在于

26、細胞的生長、繁殖代謝是一個復雜的生物化學過程，該過程既包括細胞內(nèi)的生化反應(yīng)，也包括胞內(nèi)與胞外的物質(zhì)交換，還包括胞外的物質(zhì)傳遞及反應(yīng)4. 為了優(yōu)化反應(yīng)過程，首先要進行合理的簡化，在簡化的基礎(chǔ)上建立過程的物理模型，再據(jù)此推導得出數(shù)學模型。第70頁，共205頁。微生物反應(yīng)動力學模型的分類第71頁，共205頁。（一）細胞生長動力學模型1. 無抑制作用的細胞生長動力學溫度和pH恒定時，對于某一特定培養(yǎng)基組分的濃度s，Monod方程為式中: max稱為最大比生長速率(h-1)，Ks稱為半飽和 常數(shù)(g/L)底物消耗速率方程對應(yīng)為第72頁，共205頁。Monod方程應(yīng)滿足(1)菌體生長為均衡型非結(jié)構(gòu)生長；(

27、2)培養(yǎng)基中只有一種底物是生長限制性底物；(3)菌體產(chǎn)率系數(shù)恒定第73頁，共205頁。2. 細胞生長穩(wěn)定期和延遲期的Monod型動力學(1) 延遲期動力學模型的建立 (2) 生長穩(wěn)定期動力學模型的建立式中和是經(jīng)驗常數(shù)，取=max和=xmax，第74頁，共205頁。3. 微生物死亡期和內(nèi)源代謝(1) 微生物死亡期的動力學模型 Kd為比死亡速率 (h-1) 對應(yīng)于由底物生成菌體的一級反應(yīng)速率為(2) 內(nèi)源代謝的動力學模型 或：ms為細胞的維持系數(shù)(s-1)，Y*X/S為最大細胞產(chǎn)率第75頁，共205頁。4. 底物和產(chǎn)物抑制的動力學模型(1) 底物抑制動力學(Andrew底物抑制模型)式中KIS是底

28、物抑制常數(shù)( 2) 產(chǎn)物抑制動力學（Hinshelwood模型）式中，P為產(chǎn)物濃度，k為動力學常數(shù)或：式中KIP為產(chǎn)物抑制常數(shù)第76頁，共205頁。（二）微生物產(chǎn)物形成動力學模型Gaden根據(jù)產(chǎn)物生成速率和細胞生長速率之間的關(guān)系，將產(chǎn)物形成區(qū)分為三種類型類型也稱為偶聯(lián)模型（醇類、葡萄糖酸、乳酸）類型也稱部分偶聯(lián)模型（檸檬酸、氨基酸） 類型也稱為非偶聯(lián)模型（抗生素、酶、維生素、多糖）第77頁，共205頁。上述三種類型外還有一種模型是qP與負偶聯(lián)的模型，例如黑曲霉生產(chǎn)黑色素，其qP與的關(guān)系可表示為：當考慮到產(chǎn)物可能存在分解時：式中，kd為產(chǎn)物分解常數(shù)第78頁，共205頁。四. 微生物反應(yīng)優(yōu)化的一般

29、原理1. 發(fā)酵過程優(yōu)化的一般步驟(1) 反應(yīng)過程的簡化是指把工藝過程的復雜結(jié)構(gòu)壓縮為少數(shù)系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以用關(guān)鍵變量來表示(2) 定量化系統(tǒng)、準確地檢測發(fā)酵過程的各種參數(shù)(3) 分離是指在生物過程和物理過程的各種速度相互不影響的情況下，精心設(shè)計實驗以獲得關(guān)于生物和物理現(xiàn)象的數(shù)據(jù)第79頁，共205頁。(4) 數(shù)學建模數(shù)學模型是能以簡化的形式表征過程行為，并實現(xiàn)特定目的的數(shù)學公式數(shù)學模型可將特定結(jié)果通用化，并為推論系統(tǒng)的其它性質(zhì)提供基礎(chǔ)建立數(shù)學模型的主要目標是：(a)為了預(yù)見任何系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化率或生產(chǎn)率；(b)用以檢查在各種操作條件下工廠操作的性質(zhì)和行為，檢查模型適用的范圍(包括外推性)；(c)用于進

30、行工藝優(yōu)化和計算機模擬；(d)用于檢測出可能重要但被忽視了的參數(shù)；(e)檢查是否已有效地區(qū)分生物現(xiàn)象和物理現(xiàn)象；(f)有助于闡明反應(yīng)機理第80頁，共205頁。2. 分批微生物反應(yīng)過程的優(yōu)化最優(yōu)化的目標函數(shù)：產(chǎn)量、生產(chǎn)率、純利潤等，有時也對這些指標的其中二個以上進行多目標函數(shù)優(yōu)化最優(yōu)化的操作變量：反應(yīng)時間、培養(yǎng)基組成、溫度、pH、溶氧等* 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化 預(yù)先設(shè)定XT為最大菌體濃度，則由可得到底物Si的初始濃度為第81頁，共205頁。無機離子或生長因子等一旦被細胞吸收，在細胞內(nèi)保持元化學狀態(tài)，且含量恒定不變。這類營養(yǎng)物質(zhì)稱為儲存性底物?？筛鶕?jù)這些物質(zhì)在菌體內(nèi)的實際含量，用類似于上式的方法確定其

31、需要量當代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量與培養(yǎng)基組成之間的關(guān)系很復雜，不能用解析函數(shù)的方式表示時，可采用實驗設(shè)計法確定最優(yōu)初始濃度利用最優(yōu)實驗設(shè)計法，即使不能提高產(chǎn)量，也可探索培養(yǎng)基組分的最小需用量，從而避免不必要的浪費第82頁，共205頁。第三部分 生物反應(yīng)過程的系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù)一.系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù)概述二.ATP再生系統(tǒng)及其在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用三.有機廢水處理和聚羥基烷酸生產(chǎn)的耦合系統(tǒng)四.生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)第83頁，共205頁。一.系統(tǒng)優(yōu)化技術(shù)概述1.系統(tǒng)的定義奧地利理論生物學家貝塔朗菲于1937年第一次提出,系統(tǒng)是“一個相互作用的諸要素的綜合體”。我國科學家錢學森對系統(tǒng)的定義是“系統(tǒng)是由相互作用和相

32、互依賴的若干組成部分結(jié)合而成的，具有特定功能的有機整體，而且這個整體又是它從屬的更大的系統(tǒng)的組成部分”換句話說，系統(tǒng)是同類或相關(guān)事物按一定的內(nèi)在聯(lián)系組成的整體第84頁，共205頁。2. 系統(tǒng)的一般形態(tài)有：(一)自然系統(tǒng)和人造系統(tǒng)(二)實體系統(tǒng)和概念系統(tǒng)(三)封閉系統(tǒng)與開放系統(tǒng)(四)靜態(tài)系統(tǒng)和動態(tài)系統(tǒng)(五)對象系統(tǒng)和行為系統(tǒng)(六)控制系統(tǒng)和因果系統(tǒng)第85頁，共205頁。3. 系統(tǒng)應(yīng)當具備四個基本特征(一)整體性(系統(tǒng)是由兩個以上有一定區(qū)別又有一定相關(guān)的要素所組成，系統(tǒng)的整體性主要表現(xiàn)為系統(tǒng)的整體功能 )(二)相關(guān)性(各要素組成了系統(tǒng)是因為它們之間存在相互聯(lián)系、相互作用、相互影響的關(guān)系 )(三)目

33、的性(系統(tǒng)具有能使各個要素集合在一起的共同目的，而且人造系統(tǒng)通常具有多重目的)(四)環(huán)境適應(yīng)性(環(huán)境是指出現(xiàn)于系統(tǒng)以外的事物的總稱，相對于系統(tǒng)而言，環(huán)境是一個更高級的、復雜的系統(tǒng)。系統(tǒng)必須適應(yīng)外部環(huán)境的變化，能夠經(jīng)常與外部環(huán)境保持最佳的適應(yīng)狀態(tài)，才能得以存在) 第86頁，共205頁。4.生物反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)化的基本思想:整體優(yōu)化的思想，對所研究的對象采用定性或定量的模型優(yōu)化技術(shù)，使系統(tǒng)整體目標最優(yōu)第87頁，共205頁。5. 生物反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)化方法的原則主要有以下幾個方面：(一)系統(tǒng)整體性原則:不能從系統(tǒng)的局部得出有關(guān)系統(tǒng)整體的結(jié)論；分系統(tǒng)的目標必須服從于系統(tǒng)整體的目標(二)系統(tǒng)有序相關(guān)原則:系統(tǒng)的有序

34、性，是系統(tǒng)有機聯(lián)系的反映，系統(tǒng)的任何聯(lián)系都是按一定等級和層次進行的，都是秩序井然、有條不紊的 (三)系統(tǒng)目標優(yōu)化原則:優(yōu)化問題是在不可控參數(shù)發(fā)生變化的情況下，根據(jù)系統(tǒng)的目標，經(jīng)常、有效地確定可控參數(shù)的數(shù)值，使系統(tǒng)經(jīng)常處于最優(yōu)狀態(tài)(四)系統(tǒng)動態(tài)性原則:系統(tǒng)優(yōu)化是一個比較復雜的過程，研究對象內(nèi)部復雜的相互作用和外部環(huán)境的多變性，使系統(tǒng)本身呈現(xiàn)出動態(tài)特性 (五)系統(tǒng)分解綜合原則：分解是將系統(tǒng)中具有密切相關(guān)關(guān)系的要素進行分組；綜合則是完成新系統(tǒng)的籌建過程，即選擇具有性能好、適用性強的分系統(tǒng)(六)系統(tǒng)創(chuàng)造思維原則：其一是把陌生的事物看作熟悉的東西，用已有的知識加以辯識和解決；其二是把熟悉的對象看作陌生的

35、東西，用新的方法、新的原則加以研究，從而創(chuàng)造出新的理論，新的技術(shù)。 第88頁，共205頁。生物反應(yīng)系統(tǒng)示意圖第89頁，共205頁。6.生物系統(tǒng)介紹：(1)生物產(chǎn)品合成的能量(ATP)或輔因子(NADH)再生系統(tǒng)(2)廢水生物處理的厭氧好氧組合處理系統(tǒng)(3)生物反應(yīng)與產(chǎn)物提取的耦合系統(tǒng)(4)有機廢水處理和有用物質(zhì)生產(chǎn)的耦合系統(tǒng) 第90頁，共205頁。二. ATP再生系統(tǒng)及其在谷胱甘肽生物合成中的應(yīng)用 1. ATP再生系統(tǒng)的定義及分類ATP再生系統(tǒng)可定義為一個需要ATP的生物酶反應(yīng)系統(tǒng)與一個ATP生物合成系統(tǒng)所構(gòu)成的耦合系統(tǒng)按底物的不同分類,ATP再生系統(tǒng)可分為:(1)轉(zhuǎn)移高能磷酸基的反應(yīng)系統(tǒng)(以

36、高能化合物作為底物 )(2)采用碳水化合物作為基質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)(以碳水化合物和磷酸基團作為底物)利用碳水化合物為基質(zhì)的ATP再生系統(tǒng)根據(jù)酶源的不同又可分為：(1)自耦合系統(tǒng)(2)種間耦合系統(tǒng)第91頁，共205頁。自耦合ATP再生系統(tǒng)示意圖 第92頁，共205頁。種間耦合ATP再生系統(tǒng)示意圖 第93頁，共205頁。2. 建立自耦合系統(tǒng)和種間耦合系統(tǒng)必須滿足以下條件(1)用于合成產(chǎn)物的酶的活性必須足夠強且穩(wěn)定(2)能大量提供廉價、穩(wěn)定的前體物質(zhì)(3)再生ATP的活性足夠強且穩(wěn)定，能與生物合成酶反應(yīng)成功地耦合(4)提供廉價的能量底物(如葡萄糖)和磷酸基團供體(如無機磷酸鹽)以利于ATP再生(5)若有類

37、似于分解反應(yīng)的有害副反應(yīng)，則必須對其加以控制(6)若底物或預(yù)定的產(chǎn)物不能透過細胞膜，則必須設(shè)法提高膜的通透性第94頁，共205頁。3. 兩 種系統(tǒng)的不同之處：自耦合ATP再生系統(tǒng)只用到一種微生物，故該菌中必須同時具有需要ATP的生物合成反應(yīng)的酶活性和再生ATP的酶活性種間耦合ATP再生系統(tǒng)采用不同的微生物，一種作為ATP合成活性的供體，另一種作為與此相偶聯(lián)的生物合成酶活性的供體以E. coli作為合成酶活性的受體菌和具有較強ATP生物合成活性的產(chǎn)氨短桿菌或面包酵母組合而成的種間耦合反應(yīng)系統(tǒng)第95頁，共205頁。4.自耦合ATP再生系統(tǒng)（1）GMP(5-鳥苷酸鈉鹽)生產(chǎn)過程 XMPNH3ATPG

38、MPAMPPPi（2）ATP(腺嘌呤核苷-5-三磷酸鈉鹽)生產(chǎn)過程 葡萄糖PRPP(磷酸核糖焦磷酸) 腺嘌呤PRPPAMPPpi產(chǎn)氨短桿菌同時具有PRPP(磷酸核糖焦磷酸)生物合成活性與ATP生物合成活性，可利用腺嘌呤為前體生產(chǎn)ATP(3) GSH(谷胱甘肽)的生產(chǎn)過程GluCysATP-GC(-谷氨酰半胱氨酸)-GCGlyATPGSHADPPi 第96頁，共205頁。谷胱苷肽的生物合成過程第97頁，共205頁。5. 種間耦合ATP再生系統(tǒng)（1）IMP(5-肌苷酸鈉鹽)的生產(chǎn)過程 Inosine(肌苷)ATPIMPADP（2）CDP(胞苷二磷酸)膽堿的生產(chǎn)過程 氯化膽堿ATP磷酸膽堿ADP C

39、TP磷酸膽堿CDP膽堿 在 （1）和（2）中均采用重組E. Coli和產(chǎn)氨短桿菌 （3）GSH的生產(chǎn)過程，可采用兩種系統(tǒng)：共固定化系統(tǒng)(S. cerevisiae和E. coli細胞一起固定化在同一聚丙烯酰胺凝膠中)和混合固定化系統(tǒng)(S. cerevisiae和E. coli分別用聚丙烯酰胺凝膠固定化后再混合使用)第98頁，共205頁。6. ATP再生系統(tǒng)存在的問題（1）除了合成產(chǎn)物所需的關(guān)鍵酶以外，細胞內(nèi)還有許多種酶，其中一些具有分解活性，能將反應(yīng)的底物和預(yù)定的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物（2）微生物細胞具有很強的自我保護功能，作為滲透屏障的細胞膜可防止胞內(nèi)物質(zhì)滲出。但當細胞用作酶源時，這種屏障就會阻礙

40、底物和產(chǎn)物進出細胞第99頁，共205頁。7. 解決ATP再生系統(tǒng)存在問題的辦法( 1) 抑制副反應(yīng)的方法對于具有分解、轉(zhuǎn)移底物或產(chǎn)物為副產(chǎn)物的酶，可通過選育缺失該酶活性的突變株，或優(yōu)化反應(yīng)條件使副產(chǎn)物的形成降低到最小的限度( 2) 提高膜通透性的方法干燥細胞或用溶劑、表面活性劑處理細胞都可以提高細胞膜的通透性第100頁，共205頁。（3）固定化微生物細胞的方法該法具有以下優(yōu)勢不需要提取和純化酶的過程；細胞可以重復使用；可以實現(xiàn)連續(xù)操作；反應(yīng)器占地?。环磻?yīng)控制容易；要處理的液體體積小；可以獲得高純度產(chǎn)品；工廠污染減輕缺點：固定化操作較為繁瑣研究由固定化細胞組成的ATP再生系統(tǒng)生產(chǎn)有用物質(zhì)的過程，

41、仍是這一領(lǐng)域今后的發(fā)展方向第101頁，共205頁。三. 有機廢水處理和聚羥基烷酸生產(chǎn)的耦合系統(tǒng) 工合成塑料污染的主要特點是(1)污染范圍廣。江河湖泊，田野山川無處不有(2)污染物增長量快。全世界每年對塑料的需求量為1億噸。由于價廉、易老化，塑料用量的增加導致其廢棄物也迅速增加，傾入海洋的塑料垃圾達數(shù)十萬噸，陸上的更是難以計數(shù)(3)處理困難。塑料具有耐酸堿、抗氧化、難腐蝕、難降解的特性，埋地處理百年不爛；燃燒時產(chǎn)生大量有毒氣體，如HCl、硫氧化物、碳氧化物等(4)回收利用難。塑料制品種類繁多，難以分揀回收(5)對生態(tài)環(huán)境危害大。地膜降低耕地質(zhì)量，農(nóng)作物植株矮小，抗病力差；殘膜隨風飄動，對周圍環(huán)境

42、、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)都有很大的影響第102頁，共205頁。生物可降解塑料的特點：聚羥基烷酸酯(Polyhydroxyalkoates，簡稱PHAs)是生物可降解材料的一個研究熱點。其中聚-羥基丁酸(簡稱PHB)及3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的共聚物(簡稱P(3HB-co-3HV)或PHBV)是PHAs族中研究和應(yīng)用最廣泛的兩種多聚體PHAs作為一種有光學活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如質(zhì)輕、彈性、可塑性、耐磨性、抗射線等外，更重要的是其還具有生物可降解性和生物可相容性。已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然環(huán)境中9個月后，可基本上被完全降解，而用合成塑料制作的同樣物品，完全降解的

43、時間約需100年第103頁，共205頁。有機廢水的資源化處理有機廢水是地球環(huán)境的一大污染源，但同時也是一種資源，近幾十年來，有機廢水的資源化技術(shù)發(fā)展極其迅速，已被認為是消除有機廢水污染的最經(jīng)濟有效的途徑之一用于高濃度有機廢水處理的厭氧消化技術(shù)，自20世紀50年代以后得到了迅速發(fā)展，先后出現(xiàn)了厭氧濾池(AF)、上流式厭氧污泥床反應(yīng)器(UASB)、附著膜厭氧膨脹床反應(yīng)器(AAFEB)、厭氧流化床反應(yīng)器等，其中UASB的應(yīng)用最為廣泛該反應(yīng)器能培養(yǎng)并保持大量活性高、沉降性能好的顆粒污泥，因而反應(yīng)器的處理能力大大提高，水力停留時間大大縮短第104頁，共205頁。有機廢水的厭氧處理有機廢水的厭氧發(fā)酵過程是

44、一個復雜的有多種微生物類群參加的生物化學過程，通常可分為酸性發(fā)酵階段(產(chǎn)酸)和甲烷化階段(產(chǎn)甲烷)兩階段產(chǎn)酸階段主要是有機廢水中復雜的大分子有機物在厭氧條件下被水解和產(chǎn)酸細菌發(fā)酵成為有機酸，如丁酸、乙酸、乳酸和丙酸等。此階段的細菌種類多，代謝能力強，繁殖速度快。產(chǎn)甲烷階段主要是產(chǎn)酸階段產(chǎn)生的小分子有機酸被產(chǎn)甲烷菌利用轉(zhuǎn)化為甲烷第105頁，共205頁。不同研究者的厭氧發(fā)酵產(chǎn)物第106頁，共205頁。有機廢水處理和PHAs生產(chǎn)耦合系統(tǒng)理論依據(jù)是（1）有機廢水在厭氧處理過程中，產(chǎn)酸微生物能將廢水中生物可降解的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿佑袡C酸，如乙酸、丙酸、乳酸、丁酸以及其它可溶性小分子化合物（2）真養(yǎng)產(chǎn)

45、堿桿菌在好氧、碳源充足、貧氮的條件下能利用有機酸在胞內(nèi)大量積累PHAs 將有機廢水酸化反應(yīng)器與PHAs發(fā)酵罐相組合，可使酸化反應(yīng)器為R. eutrophus 提供相對穩(wěn)定、較佳的底物，從而在發(fā)酵罐中相對廉價地生產(chǎn)出PHAs 第107頁，共205頁。主要內(nèi)容包括以下五個方面1. 有機廢水生產(chǎn)PHAs的初步條件；2. R. eutropha發(fā)酵生產(chǎn)PHAs最佳有機酸種類的確定，包括以有機酸為底物生產(chǎn)PHAs的代謝機理、理論產(chǎn)率和PHAs發(fā)酵的實際產(chǎn)率；3. 高效厭氧酸化工藝，包括酸化率達100%時有機酸分布的工藝學條件等；4. 在小型發(fā)酵罐中，以不同濃度的酸化廢水為碳源進行分批發(fā)酵實驗，在對PHA

46、s發(fā)酵過程動力學分析的基礎(chǔ)上，建立較為合理的PHAs發(fā)酵過程動力學模型；5. 進行了有機廢水生產(chǎn)PHAs流加發(fā)酵的初步研究，比較了分批和流加發(fā)酵過程中丁酸對PHAs產(chǎn)率的變化第108頁，共205頁。 有機廢水酸化和PHAs生產(chǎn)耦合系統(tǒng)進水池 泵 UASB酸化反應(yīng)器 出水池 分離濃縮系統(tǒng)濃縮的有機酸 PHA發(fā)酵罐第109頁，共205頁。1. 有機廢水生產(chǎn)PHAs的初步研究有機廢水生產(chǎn)PHAs是指R. eutropha 以有機廢水厭氧酸化的產(chǎn)物為生產(chǎn)PHAs的基質(zhì)在一定溫度下，影響有機廢水酸化的主要因素：(a) 水力停留時間(HRT)(b) pH值(進水堿度)第110頁，共205頁。酸化階段HRT

47、對發(fā)酵階段PHAs濃度的影響進水堿度對發(fā)酵階段PHAs濃度的影響第111頁，共205頁。2. R. eutropha 利用不同有機酸生產(chǎn)PHAs 的比較研究目前研究采用的PHAs生產(chǎn)方式通常有兩種:一種是一步發(fā)酵法，即細胞生長與PHAs積累相偶聯(lián)；另一種是兩步發(fā)酵法，即微生物生長和PHA積累分兩階段進行，第一階段細胞大量形成，第二階段細胞基本不繁殖而PHAs大量積累，這種方法需進行菌體的離心收集第112頁，共205頁。(1) 一步發(fā)酵法生產(chǎn)PHAs 采用不同工藝對有機廢水進行厭氧酸化，可得到以乙酸、丙酸、乳酸或丁酸等為優(yōu)勢產(chǎn)物的酸化廢水R. eutrophus WSH1對不同酸的利用* 初始酸

48、濃度為10 g/L，分別在19h、25h、32h、43h、50h加入5 g/L的酸第113頁，共205頁。(2)兩步發(fā)酵法生產(chǎn)PHAs4種有機酸的初始濃度采用10 g/L，并分別在發(fā)酵的19 h、25.5 h、32.5 h和43 h補充加入2.5 g/L的酸。PHAs合成階段初始細胞干重為3.3 g/L，細胞中無PHAs積累第114頁，共205頁。(3) R. eutropha WSH1利用混合酸發(fā)酵PHAs初始酸濃度10 g/L(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各2.5 g/L)，發(fā)酵41 h和57 h分別加入8 g/L的混合酸(乙酸、丙酸、乳酸和丁酸各2 g/L)結(jié)論：在生長和合成PHAs階段對有機

49、酸的利用順序皆為 丁酸乳酸丙酸乙酸第115頁，共205頁。3. 有機廢水生產(chǎn)PHAs的機理研究 (1) 廢水中大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子有機酸 厭氧微生物己糖降解最重要的代謝途徑是EMP和HMP途徑，先生成丙酮酸，然后形成揮發(fā)性有機酸、乳酸等。控制不同酸化條件，可以使不同的有機酸成為主要酸化產(chǎn)物。 代謝方程分別為C6H12O6 + 4H2O2CH3COO- + 2HCO3- + 4H+ + 4H2C6H12O6 + 2H2 2CH3CH2COO- + 2H2O +2H+C6H12O6 + 2H2O CH3CH2CH2COO- + 2HCO3- +3H+ +2H2C6H12O6 2CH3CHOHCO

50、O- + 2H+第116頁，共205頁。(2) 有機酸合成PHAs的代謝途徑 R. eutropha 利用小分子有機酸合成的PHAs主要為聚羥基丁酸(PHB)、羥基丁酸和羥基戊酸的共聚物(PHBV)以乙酸、丙酸、乳酸和丁酸為碳源時PHAs的合成途徑:第117頁，共205頁。第118頁，共205頁。(3)不同有機酸對PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較不同有機酸對PHAs的產(chǎn)率與理論產(chǎn)率的比較在一步發(fā)酵法中，由于所消耗的有機酸有一部分用于合成細胞的合成，因而四種有機酸對PHAs的實際產(chǎn)率均小于兩步法，但它們對PHAs和細胞的產(chǎn)率之和卻大于兩步法的產(chǎn)率第119頁，共205頁。(4) 產(chǎn)酸相產(chǎn)物分布及其影

51、響因子的研究(a) HRT對酸化產(chǎn)物分布的影響HRT對酸化產(chǎn)物分布的影響第120頁，共205頁。 (b) 不同pH條件下UASB反應(yīng)器出水產(chǎn)物分布第121頁，共205頁。4. 不同初始酸濃度對PHAs發(fā)酵過程的影響當硫酸銨濃度為1.5g/L時，初始酸濃度在20g/L左右較佳第122頁，共205頁。丁酸消耗速率大大超過乙酸和丙酸的消耗速率, 當初始酸濃度為5 、10、15、20和25 g/L時，最終發(fā)酵液中殘留的丁酸濃度為0、0.01、0.16、0.58和3.81g/L第123頁，共205頁。 PHAs濃度的變化 殘留細胞量隨時間的變化初始酸濃度: 5 g/L; 10 g/L; 15 g/L;

52、20 g/L; 25g/L第124頁，共205頁。5. PHAs分批發(fā)酵動力學 (1)細胞生長動力學第125頁，共205頁。(2) PHAs形成模型第126頁，共205頁。6. 以有機廢水酸化產(chǎn)物為底物進行PHAs流加發(fā)酵（1）流加發(fā)酵過程曲線將UASB出水中的總有機酸濃度濃縮至150 g/L左右，進行PHAs生產(chǎn)的流加發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果見圖第127頁，共205頁。(2)酸化廢水發(fā)酵過程中丁酸對PHAs的產(chǎn)率的變化第128頁，共205頁。四. 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)生物反應(yīng)與分離(或分配)相組合的技術(shù)： 選擇性地從培養(yǎng)液中連續(xù)分離有抑制性、有毒性或不穩(wěn)定性產(chǎn)物，或者將底物以一種可控的方式添加

53、到培養(yǎng)液中，對生物反應(yīng)過程都能產(chǎn)生極大的促進作用 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)也稱為原位(in situ)產(chǎn)物分離過程或提取生物轉(zhuǎn)化，即在生物反應(yīng)發(fā)生的同時，選擇一種合適的分離方法及時將對生物反應(yīng)有抑制或毒害作用的產(chǎn)物或副產(chǎn)物選擇性地從生產(chǎn)性細胞或生物催化劑周圍移走第129頁，共205頁。生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離的組合系統(tǒng)具有如下三個特征：(1)耦合過程是一種集成式單元操作，其生物反應(yīng)器具有特殊的結(jié)構(gòu)(2)實現(xiàn)產(chǎn)物及時分離的方法有很多，但必須考慮產(chǎn)物的特性及具體的生物反應(yīng)體系來合理選擇和設(shè)計(3)耦合過程作為一種新的反應(yīng)工程技術(shù)，可適用于各種生物反應(yīng)過程第130頁，共205頁。分離技術(shù)的選擇主要基于

54、四個方面的因素：(1)分離技術(shù)應(yīng)當具備生物相容性，適宜的分離技術(shù)應(yīng)當對生物反應(yīng)不造成負面影響，不會造成生物催化劑或細胞的失活、變性和死亡，也不會改變生物反應(yīng)的代謝和調(diào)節(jié)機制；(2)應(yīng)當考慮產(chǎn)物或副產(chǎn)物的物理化學特性和生物學特性；(3)考慮系統(tǒng)的流體特性，因為流體力學性質(zhì)決定并影響分離過程的傳質(zhì)，從而影響分離的容量和速度，如高粘度的非牛頓型流體就不能用膜分離技術(shù)；(4)考慮工程及經(jīng)濟因素，理想的分離技術(shù)應(yīng)當是操作費用低、性能穩(wěn)定、工程上易于實現(xiàn)的技術(shù)第131頁，共205頁。1. 隨程溶劑萃取包括內(nèi)部隨程萃取和外部隨程萃取兩種方式 (1) 內(nèi)部隨程萃取是指萃取劑在反應(yīng)器中與培養(yǎng)基直接接觸，以便將產(chǎn)

55、物萃取到溶劑中去(例如，在利用帚狀地霉發(fā)酵生產(chǎn)酯類風味物質(zhì)的研究中，內(nèi)部溶劑萃取技術(shù)得到了很好的應(yīng)用)內(nèi)部溶劑萃取的特點是溶劑和液相混合均勻，因而有利于傳質(zhì)的進行；但溶劑也可能在培養(yǎng)液中形成穩(wěn)定的乳化作用，這對溶劑與產(chǎn)物的分離不利第132頁，共205頁。(2) 外部隨程萃取是指萃取劑和培養(yǎng)液在反應(yīng)器外的萃取裝置中逆流接觸，從而萃取產(chǎn)物的過程用這種方法可以減輕內(nèi)部溶劑萃取中的乳化問題假如用己烷進行內(nèi)部溶劑萃取時，因為在發(fā)酵系統(tǒng)中加入揮發(fā)性溶劑，會導致傳氧困難，即便細胞處于產(chǎn)物合成的旺盛期也會減少產(chǎn)物的生成，即所謂的“相毒性”(phase toxocity)。外部隨程萃取則不存在這一問題，在外循環(huán)

56、中多余的溶劑可用氣體抽提去除，若細胞對溶劑敏感，還可在微量溶劑回流反應(yīng)器前進行脫氣處理第133頁，共205頁。2. 滲透萃取滲透萃取是一種基于膜技術(shù)的萃取系統(tǒng)膜技術(shù)在萃取中具有能夠增加傳質(zhì)面積和降低乳化程度及減輕溶劑對微生物的毒害作用的優(yōu)點Solichien采用氧化三辛基膦(TOPO)與煤油的復合體系作為溶劑，由于萃取劑和培養(yǎng)液被膜隔開，萃取劑對細胞的毒性有所降低例如，在丙酸、乙酸和 乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，利用滲透萃取技術(shù)可降低產(chǎn)物對微生物的毒害作用，從而大大提高發(fā)酵水平第134頁，共205頁。3. 滲透蒸發(fā)滲透蒸發(fā)技術(shù)具有分離因子高、操作費用低、對膜結(jié)構(gòu)的無限制性及操作時具有較高的機械強度等優(yōu)點

57、例如，在乙醇生產(chǎn)中，滲透蒸發(fā)是將乙醇從發(fā)酵液中連續(xù)分離的最有效手段，由于降低了產(chǎn)物抑制和分離操作費用，生產(chǎn)率得以顯著提高Susumu等人采用聚二甲基硅氧烷中空纖維膜(PDMSHF)結(jié)合氮氣作為載氣，可從水相中連續(xù)分離乙醇和異丙醇第135頁，共205頁。4. 其它生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離技術(shù)(1) 氣體抽提(2) 吸附(3) 結(jié)晶(4) 層析技術(shù)(5) 電滲析(6) 動電技術(shù)(7) 受控底物分配(8) 在酶學上的應(yīng)用第136頁，共205頁。5. 生物反應(yīng)與產(chǎn)物分離組合系統(tǒng)的發(fā)展趨勢(1) 目前的研究更加深入和細化，包括:(a)有抑制或毒害作用副產(chǎn)物的選擇性分離；(b)選擇性地供給營養(yǎng)底物；(c)不可發(fā)

58、酵底物或老齡化細胞的分離(2) 新的分離技術(shù)不斷出現(xiàn)，主要體現(xiàn)在:(a)新的選擇性更強、生物相容性更好的生化分離方法的開發(fā)和應(yīng)用(如基于分子識別的分離方法)；(b)將傳統(tǒng)分離技術(shù)組合使耦合系統(tǒng)的選擇性更好、效果更理想，如前面介紹的膜技術(shù)第137頁，共205頁。代謝工程一、代謝工程概述 代謝工程的基本理論及應(yīng)用策略的形成：1.微生物細胞在代謝繁殖過程中，經(jīng)濟、合理地利用和合成自身所需的各種物質(zhì)和能量，使細胞處于平衡生長狀態(tài)。2.對于發(fā)酵工業(yè)和人類的經(jīng)濟活動來說，活細胞這種自身固有的代謝網(wǎng)絡(luò)的遺傳特性并不是最佳的。為了大量積累某種代謝產(chǎn)物，就必須打破微生物原有的平衡狀態(tài)，這就需要對細胞的代謝途徑進

59、行修飾。 第138頁，共205頁。3.現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)通過以代謝控制發(fā)酵理論為指導，應(yīng)用基因突變來改造微生物原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。由于該工程在很大程度上依賴于傳統(tǒng)的化學誘變技術(shù)及設(shè)計精巧的選擇程序，因此手段單一，結(jié)果不盡人意。4.隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，利用基因克隆改變代謝流，擴展和構(gòu)建新的代謝途徑，盡可能最大限度地提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率，已取得令人矚目的成果。 第139頁，共205頁。代謝工程的第一個應(yīng)用實例： 1974年，Chakrabarty在假單胞菌屬的惡臭假單胞菌（P. putide）和銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）中分別引入幾個穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，增加了兩者對樟腦和萘的降解催化活

60、性。這標志著代謝工程作為一門學科的誕生。第140頁，共205頁。代謝工程的一般定義：通過某些特定生化反應(yīng)的修飾來定向改善細胞的特性或運用重組DNA 技術(shù)來創(chuàng)造新的化合物 第141頁，共205頁。具體定義：代謝工程是應(yīng)用重組DNA技術(shù)和應(yīng)用分析生物學相關(guān)的遺傳學手段進行有精確目標的基因操作，以改變微生物原有的調(diào)節(jié)系統(tǒng)（酶的功能和輸送體系的功能、甚至產(chǎn)能系統(tǒng)的功能），通過有目的地對細胞代謝進行修飾（功利性修飾）以改變細胞某些方面的代謝活性的整套工作（包括代謝分析、代謝設(shè)計、遺傳操作、目的代謝獲悉功能的實現(xiàn)），從而達到實現(xiàn)目的代謝活性的提高這一預(yù)期目標的一個嶄新的領(lǐng)域。 第142頁，共205頁。 研