1、)溶液于燒杯中，均CTAB 硅珠法提取 DNA 實驗流程前言 :實驗是要求非常嚴(yán)謹?shù)倪^程 , 每個一步驟都可能對后面的操作產(chǎn)生很大影響果 . 一步錯 , 步步錯 , 每一個操作的失誤都可能導(dǎo)致整個實驗的失敗 事實求是與踏踏實實的作風(fēng)是每個做實驗的人必備的基本品質(zhì). 永遠記住, 乃至影響后面的結(jié), 任何弄虛作假的行為都是可恥的 .在這個充滿學(xué)術(shù)腐敗的科學(xué)界,保持自己的純真 .謹記1. 材料的采集采取植物的嫩葉 ,可以用硅膠干燥保存 , 也可以用冰袋 , 主要是防止葉片組織的降解及葉片的褐化 .用泡沫塑料箱子帶回 , 置于 -70 冰箱保存 .2.CTAB 硅珠法提取 DNA 實驗流程各加入液體的

2、配制：1 、 CTAB 提取液：2% （ W/V g/mol ） CTAB ；5% （ W/V g/mol ） PVP ；1.4mol/lNaCl ；20mmol/L EDTA PH=8.0 ；l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0 ；2%(V/V) 巰基乙醇 ( 臨時加入 )配制量： 500ml配制方法：(1) 計算所需組分量 CTABPVPNaClEDTA.Na2.2H2OTris10g 需熱磁力攪拌25g40.908g3.7224g 調(diào) PH=86.057g(2) 稱取 CTAB 10 g ， NaCl 40.908g ， PVP 25g(3) 加入約 300dd H2O(

3、雙蒸水 ) 充分磁力攪拌溶解冷卻為常溫時 ( 母液 )置于 500ml 燒杯中( 注意： EDTA 和 PVP 較難溶，加熱溶解的同時用熱磁力攪拌直至完全的透明為止(4) 量取 20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 ) ， 50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8) 勻混合(5) 將燒杯溶液定容至 500ml 后，高溫高壓滅菌(6) 室溫保存。0.5mol/LEDTA 配制組分濃度： 0.5mol/l EDTA ， PH=8配制量： 500ml配制方法 (1) 稱取 93.06 克 EDTA.Na2.2H2O ，置于 500 ml 燒杯中(2) 加入約 400ml dd H

4、2O. 用熱磁力攪拌器充分攪拌(3) 用 NaOH 調(diào)節(jié) PH 值到 8 ，約用 10 克固體 NaOH(4) 在溶液冷卻后，再用 NaOH 調(diào)節(jié)至 PH=8(5) 加 dd H2O 將溶液定容到(6) 高溫高壓滅菌后，室溫保存NaOH 溶液的配制組分濃度： 5 mol/l NaOH配制量： 100 ml配制方法 (1) 稱取固體 NaOH20 (2) 加入 dd H2O 定容到 100 ml100 mmol/l Tris-HCl 的配制500 ml克于容器中組分濃度： mmol/l Tris-HCl ， PH=6.4配制量： 250 ml配制方法 (1) 稱取 3.025 克 Tris 于

5、250 ml 燒杯中 .(2) 加入約 200ml dd H2O(3) 用濃鹽酸調(diào)節(jié) PH 值到(4) 將溶液定容至 250ml充分攪拌溶解 .6.4. 所用濃鹽酸約 3 ml(5) 用棕色瓶分裝于 4 度冰箱中(6) 如使用，用水浴加熱溶解 .2 、氯仿 - 異戊醇的配制：配制方法 (1) 簡單的體積混合，既要求比例為 24： 1 即可(2) 儲存于棕色玻璃瓶子中(3) 置于 4 度冰箱以便日后使用3 總的實驗流程3.1 總的 DNA 的提取：1. 在 10ml 離心管（ eppendorf 管）中加入 4mlCTAB 提取液及 80ul 巰基乙醇，在 65 水浴鍋中預(yù)熱2. 取材料 1-2

6、g 于研缽中，加入適量液氮迅速多次研磨成細粉狀，轉(zhuǎn)至預(yù)熱的中，用封口膜將離心管封密以防止巰基乙醇揮發(fā) . 放回水浴中保溫 30次，保持搖勻 .CTAB 提取液分鐘，保溫過程中輕晃幾3. 取出 Eppenedorf 管 . 置于冰上迅速冷卻到室溫， 輕微混合均勻且充分，使其徹底地混合成乳狀液，然后加入等體積的 4ml 氯仿 - 異戊醇（ 24： 1 ），4 下離心 12000rpm 10min ，輕輕將上清液吸取 1ml 于 1.5ml 離心管，放于 -20 冰箱中備用 .各加入液的用途：（1 ）去污劑：CTAB ：可將細胞膜裂解，使 DNA 釋放到提取液中，同時也使組織勻漿中的蛋白質(zhì)變性 .E

7、DTA ：能與 DNase 的輔助因子 Mg2+ 結(jié)合，使 DNase 失去活性，不能降解從細胞中釋放的DNA.（2 ）還原劑巰基乙醇：它抑制從細胞中釋放的多酚氧仿 . 防止植物組織發(fā)黃變褐 .（3 ）氯仿 異戊醇：它可把組織勻漿中變性的蛋白質(zhì)除去，將 DNA 與細胞中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等分開除去 .（4 ） RNase ：它可去除核酸中的 RNA ，只留下 DNA.3.2 總 DNA 的純化 操作步驟：1. 取出 1.5ml 離心管，內(nèi)含所取 DNA ，加入 100ul 硅珠懸浮液（此液要求先行渦旋再使用） ，使用渦旋振蕩器大約 15s ，使之充分混勻， 于室溫靜置 10 分鐘，再振蕩15

8、s 4 度，去除上清液得到硅珠 核酸復(fù)合物 .2. 將復(fù)合物用鑷子一次打兩個，打成液狀，使之完全分散，加入漂洗液勻，后離心 8000rpm 15s 棄掉上清液 .3. 重復(fù)上一步一次 .5 秒，后離心： 8000rpm1ml ，再渦旋充分混4.用 70% 的 1ml 乙醇將硅珠 核酸復(fù)合物漂洗兩次 . 每次渦旋充分混勻后，離心8000rpm 15s ，棄上清液， 打散，最后用 1ml 無水乙醇再漂洗一次， 用渦旋混勻離心15s ，然后將離心管管口打開倒置在吸水紙上，再將沉淀置于真空冷凍干燥機中風(fēng)干復(fù)合物 分鐘 .8000rpm105. 加入 100ulTE 緩沖液充分混勻后，于 5min. 取

9、上清液即為所需的 DNA.6. 將余下的復(fù)合物再次完全打散（即渦旋）56 度水浴中保溫 10 分鐘，然后離心 12000rpm，加入 100ulTE 緩沖液進行第二次重旋，并于56 度水浴中保溫 10min ， 12000rpm 5min ，取上清液于步驟 5 管中共存 .7. 將兩次二合一的上清液離心混勻 14000rpm 10min ，取上清液存于 -20 冰箱中 . 儀器的使用真空干燥器：在使用前要求先預(yù)熱 30 分鐘，只打開打開蓋子平衡放入離心管，然后順次開啟 分鐘 .1 號閥門 .2 號 3 號 4 號 5 號門 . 進行干燥處理 5關(guān)閉各閥門 . 順序為 5 號 4 號 3 號 2

10、 號 1 號閥門 .各加入液的配制1 、硅珠懸浮液的配制（1 ） 稱取 1.2g 硅珠粉，溶解于 10ml 無菌水中 .（2 ） 放入 4 冰箱備用 .（3 ） 使用時先渦旋使其混合均勻 .2 、漂洗液的配制稱 取GuSCN （ 可 能 產(chǎn) 生 有 毒 氣 體 ， 要 求 在 通 風(fēng) 櫥 中 進 行 ） 120 克 溶 解 于100mlTris-HCl(100mM PH6.4) 中 . 要求在 60 水浴中溶解 .3 、 TE 緩沖液的配制10 TE， 500ml 配制如下：將 100mM Tris-Hcl （ PH=8.0 ） 6.057g 與 10mM EDTA （ PH=8.0中，調(diào) P

11、H=8.0 ，定容到 500ml 。3.3.DNA 取 4ul DNAD280nm估測其純度樣品濃度、純度測定水溶液用雙蒸水稀釋到 400ul ，用紫外分光光度計測定其值 . 根據(jù) D260nm 值估測濃度。根據(jù) D260nm/D23Onm.） 1.8612g 溶于 400ddH2OD23Onm 、 D260nm 、 D260nm/D280nm 值（1 ）濃度計算公式：對于雙鏈 DNADNA 樣品的濃度（ ug/ml（2 ） 純度估測標(biāo)準(zhǔn)： 純的 DNA2.0而言 D260nm 為 50ug/ml） = D260nm 稀釋倍數(shù) 50/1000溶液其 D260nm/D280nm=1.8 ； D2

12、60nm/D23Onm DNA 濃度的精確測定：去除一定量的 DNA ，稀釋成 200ug/ul 標(biāo)準(zhǔn) DNA 和樣品各 1ul ，進行 0.8% 并對 DNA 樣品進行定量、調(diào)整樣品的，配制少量 400 的瓊脂糖凝膠電泳、 200 、 100 和 50 ng 的 DNA. 取. 紫外燈下比較樣品 DNA 條帶的亮度，DNA 的量與 100ug DNA 的亮度相一致 .總的 DNA 跑出來條帶在紫外光下看應(yīng)該是明亮的一條分降解或提純的不徹底 , 含有的 RNA 較多 . 雖然 SSR帶 , 還須實驗證明 , 或重新提取 .2.PCR 擴增SSR-PCR 擴增反應(yīng)體系,沒有拖尾的現(xiàn)象 ,若有的話

13、可能 DNA 部對模板的要求不是太嚴(yán)格 , 具體能否擴出條1 、 10ul 反應(yīng)體系：調(diào)溫高壓滅菌水 H2O 5.45ul 5.45ul a 5.45ul a b10 Buffer 1ul 1ul a 1ul a b2mM-dNTP 1ul 1ul a 1ul a b25mu-MgCl2 1ul 1ul a 1ul a br-T aq 0.05ul 0.05u a l 0.05ula bPrimer+ 0.25ul 0.25ul a 0.25ul abPrimer-DNA 模板0.25ul1ul0.25ul a0.25ul ab說明： a 個反應(yīng)量 = 不同模板 n+2 ， b 為引物數(shù) +2

14、2 、作程序及其注意事項：1) 分裝各型槍頭 .2) 分裝各型離心管 .3) 順次用碳筆標(biāo)明引物號，小 master 順序號及總4) 收取冰塊半盤，將取出各液放于冰上 .5) 配總 master ，先計算好 a b6) d-NTP 和 MgCl2 要求加樣前先輕微渦旋混勻，7) 配 master 的順序： H2O BufferdNTP8) 輕渦旋總 Master9) 分裝 C 個引物個小 Master10) 向 C 個小 Master 加入 C 個引物11) 將含引物的 C 個 Master 渦旋混勻master 順序號 .、Taq 酶要求在冰箱口取用 .MgCl2T aq12) 將 N 個模

15、版點加到 N C 個小離心管中，各含 1ulDNA13) 將各小 Master ，每 9ul 加入到含 1ulDNA 的離心管中14) 時刻注意更換槍頭，防止交叉感染，盡量不要將槍頭放在液面下 .15) 將擴增好的 DNA 進行溴酚藍點樣，每離心管 8ul3 、各加入液的配制（1 ） 引物的稀釋1) 每管引物先 1000rpm 3min 進行離心，將附在管壁上的粉末或膜狀物離心到底部，小心打開 蓋子 .2) 加入經(jīng)高溫高壓的滅菌水 . 針對不同的引物加入不同的量3) 使最終濃度都為 10um/L （2 ） 溴酚藍的配制1) 將 0.125 克溴酚藍， 20 克蔗糖溶解為 50ml 的 ddH2

16、O2) 再進行過濾3) 放于 4 冰箱中儲存 （3 ） Buffer 的配制1 ） 1 TE Buffer組成濃度： 10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0配制量： 500ml配制方法：量取下列溶液于 500ml 燒杯中1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH=8.0 1ml向燒杯中加入約 400mldd H2O 均勻混合；將溶液定容到 500ml 后，高溫高壓滅菌；室溫保存 .2 ） 10 TE Buffer組成濃度： 100mM Tris-HCl 10mM EDTA PH=8.0配制量： 1000ml配制方法：量取下列溶液于 1

17、 升燒杯中：1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 100ml ；0.5M EDTA PH=8.0 20ml向燒杯中加入約 800mldd H2O 均勻混合；將溶液定容到 1 升后，高溫高壓滅菌；室溫保存 .1MTris-HCl 的配制：組分濃度： 1M PH=7.4 7.6 8.0配制量： 500ml配制方法： 稱取 6.057 克 Tris按下表量加入濃鹽酸調(diào)節(jié)所需置于 500ml 燒杯中； 加入約 400ml 的 dd H2O 充分攪拌溶解；PH 值PH 值 濃鹽酸量7.4 35ml7.6 30ml8.0 21ml將溶液定容到 500ml ；高溫高壓滅菌后，室溫保存 .PCR

18、 反應(yīng)體系1 、本實驗樣品所采用的反應(yīng)程序：2 、 PCR 擴增儀的操作：1 ）先通過觀察哪個指示燈是空的擴增儀2 ）右旋打開蓋子，按順序擺放并用手柄輪壓實3 ）做旋蓋好蓋子至刻度處4 ）打開操作程序，選好人名反應(yīng)體系并逐一確定5 ）掌握擴增儀時間 2:30 降溫需 30 分鐘聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGEPAGE 操作流程及注意事項：1 、涂膠1 ） 將有耳玻片（耳朝下）泡于反硅化劑中，新液 25 分鐘，舊液 30 分鐘 .2 ） 涂無耳正面玻片硅化劑 .均勻點四滴，輕而勻的沿一個方向涂三次，靜 10 分鐘 .3 ） 到時間取出 . 打開通風(fēng)櫥風(fēng)干 30 分鐘 .2 、封膠1 ）2 ）3 ）4

19、 ）將兩玻片對貼于橡膠框中，放平，用力擰死，夾住橡膠管 .溶廢瓊脂膠，分兩次：第一次 50 秒，第二次 10-20 秒，防止沸出 .用小細長槍頭通透加膠槍頭，便于加樣通暢，少起氣泡 .吸 2500-3000ul 液膠加速沿玻片邊緣快速順下滴，將兩面玻片充分封死，防止漏膠. 以水平底線面水平高于底為佳，靜止凝膠 15 分鐘 . （有時可先在封口加一點 TBE 以潤滑玻片，利于膠流下）3 、灌膠1) 用長細槍頭透開加膠槍頭2) 從中間加入，每次不要全部打完，留一點在槍頭內(nèi) . 防止斷流而導(dǎo)致膠中含有氣泡 .3) 插梳子時兩端平整，梳子緊貼玻板，梳齒頭部不可有氣泡 .4) 拔梳子時先加一倍 TBE

20、液將梳子泡透，然后平行用力拔出 .5) 在插梳子 15 分鐘內(nèi)跟蹤觀察，適當(dāng)下按，保證孔的深度 .6) 等待 2 小時，以便膠充分凝固 .4 、吹孔1 ） 向中間槽加入 1 倍粗制 TBE ，要淹沒過內(nèi)玻片約 1 厘米 .2 ） 拔梳子，小心平穩(wěn)，均勻平衡 .3 ） 調(diào) 1000p 槍到 300-600ul ，進行吹孔，將小孔內(nèi)沉淀物吹打干凈，加樣中再視時吹孔 .5 、加樣1 ） 用細長專用槍加入 DNA 0.5ul.2 ） 一手托另一臂的肘，以保證加樣手不抖 .3 ） 一定垂直加到孔中去，不脫尾，不吸水，不靠壁，干凈利落 .4 ） 加完一次 . 在放于桌旁的吸紙上，將細槍頭上余液吸干 .5

21、） 首、中、尾各留 1 到 2 個孔，兩面膠孔的 Marker 不完全一樣，以便區(qū)分 .6 ） 加 Marker 0.15ul 一般取 0.3ul 每孔注如一半，可用兩個孔 .6 、跑膠1) 向兩側(cè)槽中加入粗制 TBE ，至 U 管線處 .2) 打開電源，穩(wěn)壓到 120V3) 電泳 2h 左右4) 當(dāng)樣品跑到底部 2cm 處，關(guān)閉電源 . 7 、撬玻片1 ） 刀片不伸入過深 .刀片平行于玻片，稍用力 .2 ） 將沒有硅化劑的無耳玻片放于水盤中，還有梳子 .3 ） 清理瓊脂膠，放于燒杯中 .4 ） 膠玻片放于盤中，銀染 .各加入液的配制1 、反硅化劑的配制1 ） 量取 500ml ddH2O.2 ） 用冰乙酸把 ddH2O PH 調(diào)至 3.5.3 ） 再加 Bind-silica 2ml.4 ） 用熱磁力攪拌器攪拌均勻 .2 、 TBE 電泳母液（ 10 ）的配制1 ） 分別稱取 54 克 Tris 堿， 27.5 克硼酸， 20ml 0.5mol/EDTA （ PH=8.0 ）2 ） 將各組分別加入 1 升燒杯中，用 ddH2O 定容到 1 升 .3 ） 在電泳時使用 1 倍工作液，按 1： 4 與水混合 .4 ） 1 倍液是為了增加電泳工作液的電流的電流量 .5 ） 盛于玻璃瓶，在室溫保存 .3 、聚丙烯酰胺的配制（ 8% ）組分濃度： 80%配制量： 500ml配制方法：量