1、虎杖指紋圖譜定性與有效成分定量研究中南林業(yè)科技大學(xué) 向榮1，孫琴1，喬志斌2，周鈺珂2（1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 2012級生物技術(shù)專業(yè)，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 2013級生物技術(shù)專業(yè)，湖南 長沙 410004）王元清 講師，余蓉 講師 摘要：目的 構(gòu)建虎杖指紋圖譜與定量分析虎杖中6種活性成分，為其質(zhì)量控制提供方法。方法 采用HPLC法建立11批虎杖飲片的化學(xué)指紋圖譜；采用總量統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算指紋圖譜的總量零階矩（AUCT）、總量響應(yīng)率(AUCPWT)、總量一階矩(MCRTT)、總量二階矩(VCRTT)等參數(shù)及相似度評價(jià)。結(jié)果 對11

2、批虎杖飲片進(jìn)行測定，共標(biāo)定了13個(gè)共有峰，指認(rèn)了6個(gè)色譜峰；總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)AUCT、AUCPWT、MCRTT、VCRTT的平均值分別為：1.52106 AUmin、2.31103 AUminmLmg-1、2.20101 min、1.10102 min2；各批次樣品的相似度在0.90以上。虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素苷、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為12.99 mg/g、4.21 mg/g、15.96 mg/g、0.12 mg/g、9.52 mg/g、1.99 mg/g。結(jié)論 化學(xué)指紋圖譜結(jié)合總量統(tǒng)計(jì)矩分析與多成分定量可控制虎杖飲片質(zhì)量。 關(guān)鍵詞：虎杖；指紋圖譜；總量統(tǒng)計(jì)矩；成分分析虎杖

3、為蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc)的干燥塊莖和根1，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰功效1?；⒄戎兄饕祯惡投揭蚁ㄜ危╊惓煞郑渲休祯惓煞种饕獮榇簏S素苷、大黃酸、大黃酚、大黃素和大黃素甲醚等蒽醌類衍生物，芪類成分主要為白藜蘆醇、虎杖苷等2，具有抗炎、抗氧化3、抗癌、抗腫瘤4等功效。為控制虎杖的質(zhì)量，本文構(gòu)建虎杖化學(xué)指紋圖譜后首次采用總量統(tǒng)計(jì)矩結(jié)合6種成分同時(shí)定量分析，從而為虎杖飲片質(zhì)量控制提供參考方法。一 材料與儀器1. 藥品與試劑虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚對照品(均購自南昌貝塔生物科技有限公司）、大黃酸、大黃素苷(均購自

4、南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；虎杖（經(jīng)鑒定為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc的干燥根，分別購于長沙11家藥房)，乙腈(色譜純，美國天地公司)；娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈有限公司 )；其他均為分析純。2. 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀（Agilent公司，美國）；粉碎機(jī)（浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠）；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP114型電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司，0.0001g)；HH-600型三用恒溫水箱（金壇市神科儀器廠）；SHZ-D（）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。二 方法與結(jié)果1.

5、色譜條件安捷倫色譜柱C18柱（250 mm4.6 mm，5m）；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脫；檢測波長為變波長；流速0.8 mL/min；柱溫30。色譜圖見圖1。圖1 虎杖對照品（A）與樣品（B）的HPLC圖1-虎杖苷； 2-白藜蘆醇；3-大黃素苷；4-大黃酸；5-大黃素；6-大黃素甲醚2. 供試品溶液的制備稱取虎杖粗粉約0.5 g，置于50 mL量瓶中，加入甲醇超聲30 min，冷卻，靜置，定容，搖勻，0.45 m微孔濾膜過濾即得供試品溶液。3. 對照品溶液的制備精密稱定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素苷、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚各對照品適量，分別置于棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀

6、釋，分別制備成虎杖苷（64 g/mL）、白藜蘆醇（71 g/mL）、大黃素苷（73 g/mL）、大黃酸（0.35g/mL）大黃素（74 g/mL）、大黃素甲醚（25g/mL）的對照品溶液。4. 方法學(xué)考察按照中國藥典2010年版方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)等，各RSD均小于3%，表明方法學(xué)考察合格。5. 指紋圖譜的建立（1） 指紋圖譜共有模式的建立 將11個(gè)不同批次虎杖HPLC色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A軟件，建立了不同批次虎杖的指紋圖譜共有模式，結(jié)果見圖2。由圖2可知，共獲得13個(gè)共有峰，經(jīng)化學(xué)對照品對照，1號、4號、6號、11號、12號、13號峰分別為虎杖苷、白

7、藜蘆醇、大黃素苷、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的峰，各批次樣品中12號峰（大黃素）的峰面積較大，分離度較好，為各批次樣品所共有，因此確定大黃素峰為參比峰。圖2 虎杖HPLC指紋圖譜色譜圖（2） 共有峰的相對峰面積以各批次的12號峰(大黃素)為參照峰，計(jì)算同一圖譜中各共有峰的相對峰面積，113號峰的平均相對峰面積分別為：1.304、0.1398、0.0729、0.7945、0.0432、1.3059、0.1952、0.1900、0.1591、0.0314、0.0043、1.0000、0.1877。（3） 總量統(tǒng)計(jì)矩分析采用指紋圖譜的一種定性定量研究新方法：總量統(tǒng)計(jì)矩分析法計(jì)算不同批次的虎杖樣品的總

8、量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)，如總量零階矩（AUCT）、總量響應(yīng)率(AUCPWT)、總量一階矩(MCRTT)、總量二階矩(VCRTT) 5等，計(jì)算結(jié)果見表1 。表1 各批次虎杖樣品的總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)樣品號參 數(shù)AUCT(AUmin)AUCPWT(AUminmLmg-1)MCRTT(min)VCRTT(min2)1號1.411062.331032.011011.191022號1.711062.581032.211011.161023號1.561062.121032.451011.081024號1.321061.911032.301011.261025號1.941062.871032.241011.001026號1

9、.771062.771032.131010.971027號1.461062.251032.151011.131028號1.291061.941032.211011.081029號1.381062.181032.101011.0010210號1.551062.461032.101011.0810211號1.341061.961032.281011.18102平均1.521062.311032.201011.10102由表1可知，總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)可以定量評價(jià)不同批次虎杖的指紋圖譜，各批次樣品存在較大的差異。（4） 相似度評價(jià) 分別采用總量統(tǒng)計(jì)矩法 6對11批虎杖樣品的HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，

10、結(jié)果見表2。結(jié)果表明各批次虎杖樣品具有較高的相似度。表2 總量統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算各批次虎杖樣品的相似度樣品1號2號3號4號5號6號7號8號9號10號11號平均相似度0.9500.9520.9480.9610.9590.9490.9510.9420.9040.9600.9276. 虎杖中6種成分的平均含量 采用外標(biāo)法對不同批次虎杖中6種成分進(jìn)行定量分析，其平均含量見表3。 表3 各批次虎杖樣品各成分平均含量成分虎杖苷白藜蘆醇大黃素苷大黃酸大黃素大黃素甲醚平均含量(mg/g)12.994.2115.960.129.521.99可見，6種成分平均含量高低依次為：大黃素苷虎杖苷大黃素白藜蘆醇大黃素甲醚大黃酸

11、。三 討論本文構(gòu)建了虎杖化學(xué)指紋圖譜并同時(shí)定量了虎杖中的6種活性成分，為虎杖的質(zhì)量控制提供了新方法。指紋圖譜的識別模式中首次采用定性定量方法之總量統(tǒng)計(jì)矩法，它具有抗干擾性、加合性與偶聯(lián)性等特點(diǎn)，能消除操作方法的干擾，能與多維向量偶聯(lián)構(gòu)成譜學(xué)的特點(diǎn)5，所以可以作為評價(jià)指紋譜圖的方法。研究中發(fā)現(xiàn)各批次樣品的總量統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)如AUCT、AUCPWT、MCRTT、VCRTT差異較大，表明各批次樣品在“量”上存在較大的差異。相似度研究中，首次采用總量統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算出了各批次樣品之間的相似度，表明各樣品在“形”上存在較高的相似性。參考文獻(xiàn)1 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典S. 一部. 北京: 中國醫(yī)藥科

12、技出版社, 2010：145-146.2 裴蓮花, 吳學(xué), 金光洙. 虎杖化學(xué)成分及藥理作用研究現(xiàn)狀J.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(2): 147-149.3 Lanzilli G, Cottarelli A, Nicotera G, et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol andpolydatinby in vitro IL-17 modulation J. Inflammation, 2012, 35(1): 240-8.4 Mitani T, Harada N, Tanimori S, etal. Resveratrol inhibits hypoxia-inducible factor-1-mediated androgen receptor signaling and represses tumor progression in castration-resistant prostate cancer J.