1、2018-5-1412測序技術概述高通量測序及臨床Illumina測序原理測序應用及文庫類型應用33技術支持：黃亮時間：2018/5/5臨床應用測序技術概述12測序技術概述Illumina測序原理測序應用及文庫類型臨床應用33測序技術概述高通量測序一代、二代及 三代測序技術參數(shù)對比測序原理 讀長 通量測序技術典型測序平臺準確率優(yōu)點缺點一次對幾十萬到幾百萬條 DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術 (next generation sequencing) 足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的 轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(de

2、epsequencing )。12018-5-14Illumina測序原理-概述測序最基本原理Illumina基于可逆終止的，熒光標記dNTP來做邊合成，邊測序的工作12測序技術概述Illumina測序原理測序應用及文庫類型33測序芯片F(xiàn)lowcellLane：八條相對獨立通道臨床應用兩端小孔：進液孔與出液孔Oligo：DNA小片段（2種DNA引物），通過化學鍵連接在Flowcell上，能與文庫兩端堿基互補配對Illumina測序原理-基本流程Illumina測序原理-Library PreparationDNA連接酶3端：Klenow 酶Illumina測序原理-Cluster Geneta

3、tionIllumina測序原理-Cluster Genetation變性雜交模板鏈結合P5變性：雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA，結合方式：堿基互補配對原則雜交在Flowcell上P722018-5-14Illumina測序原理-Cluster GenetationIllumina測序原理-Cluster GenetationIllumina測序原理-Cluster GenetationIllumina測序原理-Cluster Genetation合成復制鏈（dNTP+聚合酶）模板鏈洗脫（NaOH）P5P5P5Original template ：與Flowcell 氫鍵連接，不穩(wěn)定Newly sy

4、nthesized strand ：與Flowcell 磷酸二酯鍵連接，穩(wěn)定P7P7P7Illumina測序原理-Cluster Genetation成橋（中和液）橋式PCR（dNTP+聚合酶）Illumina測序原理-Cluster Genetation變性（NaOH）橋式PCR（中和液）32018-5-14Illumina測序原理-Cluster GenetationIllumina測序原理-Cluster GenetationIllumina測序原理-SequencingIllumina測序原理-Cluster Genetation橋式PCR（dNTP+聚合酶）線性化（NaOH）特定基團

5、特定基團特定基團Illumina測序原理-Cluster Genetation切割阻斷ddNTPs 阻斷阻止繼續(xù)擴增Illumina測序原理-SequencingRead1 測序引物雜交（中和液）邊合成邊測序Cycle 1:按順序加入反應試劑合成第一個堿基清除未反應的堿基和試劑 激發(fā)堿基熒光并收集熒光信號 去除阻斷基團和熒光基團Cycle 2-n: 重復前面的步驟42018-5-14Illumina測序原理-SequencingIllumina測序原理-Sequencing測序基于SBS技術PE雙端測序SBS（sequencing by synthesis ）：illumina平臺采用的是一種

6、基于邊合成邊測序技術的測序方法，通過可逆阻斷技術實現(xiàn)每次只合成一個堿基，并標記熒光基團，再利用相應的激光激發(fā)熒光基團，捕獲激發(fā)光，從而讀取堿基信息。熒光基團切割位點結合堿基，激發(fā)熒光檢測信號去阻斷基團和熒光基團阻斷基團熒光基團：不同堿基的識別信號阻斷基團：控制堿基合成節(jié)奏Illumina測序原理-Data AnalysisIllumina測序原理-Data Analysis圖像信號-原始序列數(shù)據(jù)處理讀取反向互補：模板堿基序列-1個循環(huán)后+化學試劑：熒光基團+疊氮基團-3 端OH暴露-加入新的dNTP+聚合酶-測序儀掃描-圖像分析（圖像文件 .tiff文件）Basecalling（光點文件BCL

7、文件）數(shù)據(jù)傳輸處理（ BCL2FASTQ）index 拆分出數(shù)據(jù)接頭序列比對 -數(shù)據(jù)質量分析 -結題報告-高通量測序技術路線12測序技術概述Illumina測序原理測序應用及文庫類型臨床應用樣品準備1DNA/RNA 提取和檢測核 酸 打 斷3323文庫制備和庫檢上機測序生物信息分析45652018-5-14illumina技術平臺型號測序策略laneNovaseq（S2） Novaseq（S4） HiSeqXHiSeq 2500SE50(H)240M12測序技術概述PE50/PE100/ PE150PE150-PE150PE250150M300M600M-SE50(R)150M300M600M

8、90%-1.2T120G960G1.9T80%3.5dIllumina測序原理測序應用及文庫類型flowcellrun3.3T1920M3840M90%2.4T6.6T33Q3080%80%周期（1個fc）32h（1.3d）41h（1.7d）3d2d1d臨床應用應用基因組、轉錄組、外顯子、 10X微生物、擴增子sRNA、DGE、Chip文庫類型介紹建庫類型小片段文庫（ 180500bp）真核普通轉錄組 /DGE文庫真核/原核鏈特異性文庫350bp微量小片段文庫低起始量普通轉錄組 /DGE/真核鏈特異性文庫原核轉錄組文庫人外顯子文庫180280bp250300bp人重測序文庫350bpDNA文庫

9、RNA文庫RAD文庫200400bp200400bp200500bp350600bp宏轉錄組文庫LncRNA文庫small RNA文庫circRNA文庫RIP文庫全基因組DNA甲基化文庫ChIP-seq文庫10X library1840bpDNA變異檢測分析RNA表達分析全基因組測序全外顯子測序目標區(qū)域測序u轉錄組測序lncRNA測序miRNA測序circRNA測序代謝質譜250300bpuuu蛋白質譜分析uMeta文庫350bpuuPCR產(chǎn)物500bp以上建議打斷建庫打斷建庫微生物研究動植物/微生物基因組u單菌測序（denovo/重測）PCR-free文庫V4：300bp；V34：470bp

10、；V45：450bp；u擴增子宏基因組擴增子（細菌 16SV4，V34，V45/古菌16SV4/真菌18SV4，V9/真菌ITS1，ITS2）uu轉錄組測序ITS1：310bp / ITS2 ：380bp遺傳病研究高通量測序醫(yī)學應用1、什么是遺傳??？重測序、轉錄組測序、甲基化及 Chip-seq廣泛應用于研究腫瘤學，臨床診斷標志物篩選，藥物靶點等 (致癌、抑癌基因， ctDNA)癌癥遺傳病是由于遺傳物質的改變，包括染色體畸變以及在染色體水平上看不見的 基因突變而導致的疾病。基于重測序的遺傳疾病遺傳基礎研究；基于多組學的致病機制及基因功能性研究；基于臨床檢測（如產(chǎn)前檢測）的重測序應用遺傳病基因突

11、變： 生殖細胞突變所有細胞都存在，可遺傳給下一代&體細胞突變基于重測序研究遺傳因素與藥物反應的關系，提高用藥安全性及有效性（藥物敏感性、毒副作用、耐藥基因）。不會傳給子代，可傳給由突變細胞分裂所形成的各代子細胞群，在局部形成突變細胞群體，即腫瘤藥物基因組產(chǎn)生原因： 遺傳因素環(huán)境因素菌群的組成、功能與疾?。?如腸道癌癥、糖尿病 、肥胖癥、高血壓、精神類疾病等等） 之間的關系如何闡述？ （腸道、胃、口腔）病原微生物其他疾病完全或部分由遺傳因素決定的疾病，常為先天性的，也可后天發(fā)病?；谵D錄組層面測序，挖掘 生物標志物 ，基因功能性研究，反向驗證遺傳背景、表觀修飾進一步研究疾病發(fā)病機制人體有2.5w

12、個蛋白編碼基因，分布在 23對不同的染色體上3562018-5-14家系散發(fā)樣本研究思路染色體病又稱染色體綜合征，是指遺傳物質的改變在染色體水平上可見的疾病，表現(xiàn)為 染色體數(shù)目的改變（如單體性、三體性），或 染色體結構的異常（如染色體片段的缺失、重復、重排等）家系樣本散發(fā)樣本01染色體病 常染色體病 eg：21三體綜合征（唐氏綜合征）性染色體病 eg：先天性睪丸發(fā)育不良、先天性性腺發(fā)育不良顯隱性遺傳02 單基因病單個基因的突變導致的 疾病，根據(jù)OMIM數(shù)據(jù)庫，目前有6,136表型的分子基礎是已知的，有3864個基因被報道與已知疾病 或表型相關。 按照孟德爾法則傳至后代，根據(jù)突變基因所在位點的和

13、性狀分為：a.常染色體顯性遺傳?。?b.常染色體隱性遺傳?。?c.性連鎖遺傳病Dominant/Recessiveinheritance常規(guī)研究思路Regular methods遺傳病分類 03 多基因病 由多個基因及環(huán)境因素（包括致病微生物）相互作用所致，且在家系中 不符合孟德爾遺傳定律新生突變De novo mutations的疾病。其特點：遺傳模式是尚不可知的，由于遺傳和環(huán)境交互作用，因此找不到一種固定的框架來解釋這種疾病的遺傳模式；遺傳異質性；表型異質性04 線粒體病 每個細胞含有上千個線粒體，每個線粒體又有 2-10個DNA。線粒體DNA只能通過母親傳給孩子，遺傳模式未知Regula

14、r methodsCase/Control 關聯(lián)分析即屬于母系遺傳。遺傳學特征：具有半自主性；母系遺傳；閾值效應；有絲分裂和減數(shù)分裂期要經(jīng)過復制分離05 罕見病指那些發(fā)病率極低的疾病。又稱孤兒病。目前全世界已確認的罕見病有 6930多種，約占人類疾病的10%，中國已確認的罕見病有 5781種。連鎖分析/純合子區(qū)域分析Linkage analysisROH analysisFamiliar samplesSporadic samples癌癥基因組學分析軟件比對軟件：變異類型點突變（Single nucleotide variants, SNV）插入/缺失（Insertion/Deletion,

15、InDel ）拷貝數(shù)變異（Copy number variants, CNV結構性變異（Structural variants, SV ）Germline變異檢測:GATKSomatic變異檢測點突變（Single nucleotide variants, SNV ）: MuTect插入/缺失（Insertion/Deletion, InDel）:Strelka拷貝數(shù)變異（Copy number variants, CNV ）：Control-FREEC結構性變異（Structural variants, SV ）： Crest變異注釋：Annovar圖. 一個腫瘤基因組 circos 圖展示

16、變異信息（Stratton et al., 2009 ）圖. 癌癥信息分析流程圖提供領先的基因組學解決方案提供領先的基因組學解決方案Providing advanced genomic solutions!Providing advanced genomic solutions!癌癥基因組學易感基因Susceptibility gene致病機理Pathogenetic mechanismGermline突變異質性Heterogeneity耐藥機制Resistance mechanism研究方向轉移復發(fā)機制Translocation and recurrence治療敏感及不敏感兩組患者分子分型同

17、一癌種不同亞型患者Molecular subtyping同一患者腫瘤組織及不同時間點 cfDNA同一患者腫瘤組織及多個 CTCSomatic突變每位患者取一例正常樣本液體活檢CTC/ctDNA研究Study of CTC/CtDNAPDX小鼠模型Patient derived xenograft圖. 癌癥基因組研究方案設計（ Mwenifumbo and Marra, 2013）提供領先的基因組學解決方案Providing advanced genomic solutions!提供領先的基因組學解決方案Providing advanced genomic solutions!72018-5-14癌癥