1、1 免疫細胞功能檢測技術(shù)2免疫細胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細胞。主要分為以下三類：1、淋巴細胞：T細胞、B細胞、NK細胞2、單個核吞噬細胞：包括血液中單核細胞和各種組織中的巨噬細胞, 樹突細胞3、其他細胞：包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、血小板等。3 白細胞紅細胞單個核細胞淋巴細胞粒細胞T淋巴細胞及其亞群B淋巴細胞及其亞群單核細胞血小板外周血計數(shù)、功能檢測計數(shù)、功能檢測 對淋巴細胞群，中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等功能測定可以有效評價機體特異性和非特異性免疫功能。 5一、T細胞功能的檢測（掌握）二、B細胞功能的檢測（掌握）三、NK細胞功能的檢測（熟悉）四、吞

2、噬細胞功能的檢測（熟悉、了解）6T細胞功能的檢測體外試驗T細胞增殖試驗T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗T細胞分泌功能測定體內(nèi)試驗7T淋巴細胞增殖試驗 原理：淋巴細胞DNA合成分化淋巴母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松8體外引起淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物分類：1、非抗原性刺激物（促有絲分裂原）刺激物 作用細胞群PHA 人T細胞 ConA 鼠T細胞PWM 人鼠T細胞92、抗原性刺激物 萄球菌毒素 純化蛋白衍生物（PPD） 腫瘤抗原 同種異型組織抗原 Anti-CD310（一）形態(tài)法（二）同位素計數(shù)法（3H-TdR摻入法）（三）MTT比色法（四）CFSE染色法11形態(tài)法將外周血液或分離的單個核細

3、胞與適量的PHA混合，置37C培養(yǎng)72h,取培養(yǎng)細胞作涂片染色鏡檢。轉(zhuǎn)化率= 轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù) X100% 轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)參考值：60-80%優(yōu)點：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實驗室應(yīng)用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。附圖12T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗(形態(tài)法)13同位素法SI=PHA刺激管cpm均值/對照管cpm均值優(yōu)點：敏感性高，客觀性強，重復(fù)性好，可自動操作。缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。14MTT（四甲基偶氮唑鹽）比色法優(yōu)點：簡單快速，無放射性污染PHA共同培養(yǎng)淋巴細胞終止

4、培養(yǎng)前數(shù)小時MTT混勻后培養(yǎng)加入DMSO后，測定細胞培養(yǎng)物的A570OD值CFSE染色法16T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗原理：靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏 CTL靶細胞 17形態(tài)學(xué)檢查法同位素法：51Cr釋放法測定靶細胞釋放51Cr放射性活性其它方法（自學(xué)了解）意義： 腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力18計數(shù)殘留的靶細胞數(shù)計算淋巴細胞對腫瘤細胞生長的抑制率1920T細胞分泌功能測定體外培養(yǎng)的T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學(xué)、細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。 21體內(nèi)試驗1、特異性抗原皮膚試驗：OT試驗24-

5、48h出現(xiàn)紅腫硬結(jié)，d0.5cm,”+”2、PHA皮膚試驗: 6-12h局部出現(xiàn)紅腫硬結(jié)，d15mm,”+”3、接觸性超敏反應(yīng)22B細胞功能檢測B細胞增生試驗溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗體內(nèi)試驗23（一）B細胞增殖能力的試驗抗IgM細菌脂多糖（lps）SAC的SPAB細胞增殖形態(tài)學(xué)3HTdR摻入法24經(jīng)典溶血空斑形成試驗被動溶血空斑試驗 反向溶血空斑試驗 B細胞介導(dǎo)紅細胞溶血定量分光光度法 B細胞產(chǎn)生抗體能力測定 （二）溶血空斑試驗25經(jīng)典溶血空斑形成試驗26B細胞溶血空斑形成試驗(被動)致敏SRBC受檢細胞+補體27反向空斑形成試驗致敏SRBC受檢細胞+補體SPA+抗人Ig(橋梁)一個空斑表

6、示一個Ig分泌形成細胞28（三）酶聯(lián)免疫斑點試驗底物顯色-測定抗體分泌量計數(shù)著色斑點細胞-檢測抗體分泌細胞 待檢細胞酶標(biāo)記二抗該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。30(四)體內(nèi)試驗檢測外周血中抗體的含量將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細胞的功能。31染色計數(shù)離心取上清測LDH或 AKP離心取沉淀測活細胞熒光 測發(fā)光強度 測CPM 值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法N

7、K細胞活性測定靶細胞溶解常用靶細胞: K562細胞株 YAC-1細胞株32 吞噬細胞功能檢測小吞噬細胞中性粒細胞大吞噬細胞-單核細胞、巨噬細胞吞噬細胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。 一、中性粒細胞功能檢測技術(shù) 二、巨噬細胞功能檢測技術(shù)33趨化34吞噬35利什曼原蟲（綠色）被哺乳動物的巨噬細胞（黃色）吞噬 巨噬細胞吞噬大腸桿菌 36一、中性粒細胞功能的檢測 細胞趨化功能的檢測 吞噬和殺菌功能的檢測37(一) 細胞運動功能趨化功能檢測1.原理：382. 方法學(xué)：瓊脂糖平板法 濾膜滲透法（Boyden 小室法）39(二)吞噬和殺菌功能測定 1顯微鏡檢查法

8、：402. 溶菌法413NBT還原試驗 424、化學(xué)發(fā)光法5、流式細胞儀檢測43二、巨噬細胞功能檢測炭粒廓清試驗吞噬功能檢測溶酶體酶測定細胞毒作用測定巨噬細胞促凝血活性測定比色法流式細胞儀檢測44(一)炭粒廓清試驗 正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。45(二)吞噬功能檢測 巨噬細胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強的吞噬功能，常用雞紅細胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細胞或從腹腔滲出液獲

9、得鼠巨噬細胞。 46(三)巨噬細胞溶酶體酶的測定1酸性磷酸酶的測定 硝酸鉛法 偶氮法2非特異性酯酶的測定 常用-萘醋酸法47(四) 細胞毒作用測定 用IFN-激活小鼠巨噬細胞，觀察其對125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細胞瘤P815的殺傷活性。48(五) 巨噬細胞促凝血活性測定 激活的巨噬細胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37預(yù)溫的正常兔血漿和CaCl2混合液，加入經(jīng)粘附有單層巨噬細胞的試管中，移置37，即時記錄血漿凝固時間。49小結(jié) T細胞功能檢測B細胞功能檢測NK細胞功能淋巴細胞功能吞噬細胞功能T細胞增生試驗T細胞分泌功能測定T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗體內(nèi)試驗B細胞增生試驗溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點試驗體內(nèi)試驗形態(tài)學(xué)酶釋放法放射性核素釋放法化學(xué)發(fā)光法流式細胞儀法免疫細胞功能檢測的臨床應(yīng)用反映