1、血清白蛋白的分離與純化、蛋白定量測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誅EAE纖維素層析法分離純化蛋白的方法掌握考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)的原理DEAE纖維素層析法分離純化白蛋白離子交換層析基本原理根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法以離子交換劑為固定相，特定的離子溶液為流動(dòng)相，依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同進(jìn)行分離純化的層析方式離子交換劑 離子交換劑由基質(zhì)、電荷基團(tuán)（或稱功能基團(tuán)）和反離子組成?；|(zhì)一般是不溶性聚合物，如纖維素，交聯(lián)葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖等；樹脂 O N+(CH3)2 OH-纖維素O CH2 COO- Na基質(zhì) 電荷基團(tuán) 反離子 陽離子交換劑陰離子交換劑離子交換純化原理 如果要分離純

2、化一種具有兼性離子特性的生物大分子，其離子化的程度取決于它所在溶液中的凈電荷。生物分子帶電荷與否，或帶什么樣的電荷，主要決定于溶液的pH值。溶液的pHpI，生物大分子帶負(fù)電荷，解離成負(fù)離子溶液的pHpI，生物大分子帶正電荷，解離成正離子+H+H+RCHCOOH|NH3+RCHCOO-|NH3+RCHCOO-|NH2-H+-H+pHpI人血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及分子量 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分子量白蛋白4.88690001-球蛋白5.062000002-球蛋白5.06300000-球蛋白5.12 9000-150000-球蛋白6.85-7.50156000-300000實(shí)驗(yàn)步驟裝柱：取一根1cm2cm的層析柱

3、垂直夾在鐵架上，注入1cm高的0.02mol/L pH6.5NH4Ac緩沖液。將已處理浸泡在0.02mol/L pH6.5NH4Ac緩沖液中的DEAE纖維素?cái)嚦蓱腋?沉淀的纖維素與NH4Ac溶液體積比為1:2)，加入層析柱內(nèi)，慢慢打開底部出口，同時(shí)不斷加入DEAE纖維素直至柱高10cm。平衡：纖維素柱床上留有3cm高的溶液，將層析柱兩頭旋緊，接上恒流泵，用0.02mol/L pH6.5NH4Ac緩沖液平衡20min(流速為1ml/min,層析柱兩頭要旋緊，防止柱床流干)洗脫：平衡完成后，旋下上塞，慢慢打開底口使纖維素床上的液面下降到與床面相齊，夾住底口。將樣品加到纖維素柱上，打開底口使樣品進(jìn)

4、入到床體，直到與床面相齊，吸1.0ml 0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，沿柱壁慢慢加入纖維素床面上(三次，操作同上)，洗凈沾在柱壁上的蛋白液。在纖維素床面上加3cm高的0.02mol/L pH6.5NH4Ac溶液，將層析柱兩頭柱塞旋緊，接上恒流泵，用0.060.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液進(jìn)行梯度洗脫(流速為1ml/min)。室加入0.06mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml，室加入0.5mol/L pH6.5NH4Ac溶液200ml?？捡R斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)步驟1、標(biāo)準(zhǔn)方法(1)具體測定按下表操作(待測樣品的加樣量見下表的第8、9、10管)加入物(ml)12*23*24*25*26*27*28*29*210*2標(biāo)準(zhǔn)蛋白00.010.020.040.060.080.10-待測蛋白-0.020.040.06蒸餾水0.10.090.080.060.040.0200.080.060.04考馬斯亮藍(lán)試劑5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0邊加邊混勻，2-3分鐘后，以1號管為空白對照，測定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595注意事項(xiàng)：最好在試劑加入后的5-20min內(nèi)測定吸光值，因?yàn)檫@段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定測