1、電子顯微鏡免疫細胞化學技術第一節(jié)電子顯微鏡免疫細胞化學技術概述免疫細胞化學技術為在細胞水平上研究免疫反應做出了貢獻，但由于光學分辨率的限 制，不可能從細胞超微結構水平觀察和研究免疫反應。因此， Singer于1959年首先提出用 電子密度較高的物質(zhì)鐵蛋白（ferritin ）標記抗體的方法，為在細胞超微結構水平研究抗原抗 體反應提供了可能。在此基礎上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術、鐵蛋白抗鐵蛋白復合物技術、 蛋白A-鐵蛋白標記技術、免疫酶技術及膠體金技術等。電子顯微鏡免疫細胞化學技術（以 下簡稱免疫電鏡技術技術）區(qū)別于免疫細胞化學和常規(guī)電鏡技術主要在以下幾方面：一、組織固定與取材在這方面的要求是即要

2、保存良好的細胞超微結構，又要注意保持組織的抗原性。因此， 選用固定劑不宜過強。常用的免疫電鏡固定劑有多聚甲醛一戊二醛混合液和過碘酸-賴氨酸一多聚甲醛液（Periodate Lysine - Paraformaldehyde 簡稱 PLP 液）。也有采用 Bouin 氏液、 Zamboni氏液或4%多聚甲醛液（其配制法見附錄）。國外不少文獻推薦應用 PLP液于免疫 電鏡技術，認為該固定液對含糖類豐富的組織固定效果特佳，因為組織抗原絕大多數(shù)由蛋白質(zhì)和糖兩部分組成，抗原決定簇位于蛋白部分，有選擇性地使糖類固定， 就可使抗原性穩(wěn)定。PLP液中過碘酸能氧化糖類， 使其產(chǎn)生醛基，再經(jīng)賴氨酸作用，使新形成的

3、醛基分子間和分 子內(nèi)相互連接，穩(wěn)定組織抗原。但賴氨酸價格較貴，不如多聚甲醛戊二醛固定液經(jīng)濟、簡便、效果佳。在取材方面，免疫電鏡技術較光鏡免疫化學技術要求更迅速、精細。二、免疫染色分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。.包埋前染色即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取出，修整成小塊，按常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鉞酸固定、脫水、包埋。如果特異性免疫反應的范圍太小， 為了準確定位，可作第二次包埋，即第一次包埋時將組織置于兩層thermanox塑料片之間，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式，進行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的組織，以中層較為理想。表層因受機械

4、修整，結構往往保存不好，深層因 抗體不能透入，免疫反應弱或無。在作超薄切片前應先切半薄切片，尋出免疫反應陽性部位。根據(jù)作者經(jīng)驗，半薄切片可在相差顯微鏡下不染色進行觀察（指 PAP染色法），免疫反應部 位呈黑點狀。在HE或甲苯胺藍染色的半薄切片上，免疫反應部位呈棕黃色。據(jù)此定位作超 薄切片，可大大提高陽性反應檢出率。為避免電鏡鉛、鈾染色反應與免疫反應之間的混淆， 可取相連續(xù)的起薄切片，分別以兩個銅網(wǎng)撈取， 其中之一進行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進行對照觀察。包埋前染色法的優(yōu)點是：切片染色前不經(jīng)過鉞酸后固定、 脫水及樹脂包埋等過程，抗 原未被破壞，易于獲得良好的免疫反應。 可在免疫反應陽性部

5、位定位作超薄切片， 提高電 鏡下的檢出率。特別適用于含抗原量較少的組織， 但由于經(jīng)過一系列的免疫染色步驟， 常出現(xiàn)一定的超微結構損傷。.包埋后染色組織標本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后，再進行免疫組化染色。由于是以貼在網(wǎng)上的超薄切片進行免疫染色，故又名之載網(wǎng)染色(on gridstaining)o必須指出的是：后固定中是否應用四氧化鉞存在不同意見，作者經(jīng)驗一般以不 用四氧化鉞為佳，或盡量縮短在四氧化鉞中停留的時間。有作者認為，從理論上講，四氧化鉞具有保存抗原的作用，但實踐證明應用四氧化鉞可使抗原活性明顯減低。在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學物質(zhì)產(chǎn)生反應，故需選用饃網(wǎng)或金網(wǎng)。在免疫組化處

6、理的全過程中， 應注意保持網(wǎng)面的濕潤，網(wǎng)面干燥會影響抗體活性。本法的優(yōu)點是超微結構保存較好，方法簡便，陽性結構有高度的可重復性，還能在同一張切片上進行多重免疫染色。但抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基， 在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應而改變抗原性質(zhì)；包埋在環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成份發(fā)生反應而改變抗原性質(zhì)；包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進行免疫反應等。因此，免疫組化工作者曾試圖以不同的方法如個&和苯溶液，無水酒精中NaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等以減少或去除包埋劑，取得不同程度的效果。 現(xiàn)普遍采用的是在進行免疫染色前，以H2O2液蝕刻數(shù)分鐘，

7、以去鉞和增強樹脂的穿透性。.超薄冰凍切片按口Tokuyasu建立的方法，將組織置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機上切片，切片厚度可略厚于常規(guī)樹脂切片。冰凍超薄切片由于不需經(jīng)固定、脫水、包埋等步驟，直接進行免疫染色，所以抗原性保存較好，兼有包埋前和 包埋后染色的優(yōu)點。三、包埋(一)樹脂包埋國內(nèi)現(xiàn)普遍采用的是環(huán)氧樹脂包埋法，可直接脫水后包埋，也可將小片組織或半薄切片貼在載片上，將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置于切片上聚合、硬化，進行原位包埋。(二)低溫包埋常規(guī)樹脂包埋由于需高溫聚合等處理程序，組織抗原性可能全部或部分丟失。因此，在免疫電鏡技術方面，國外不少實驗室已開始采用低溫技術

8、如低溫包埋和冰凍超薄切片等，后者需配備冰凍超薄切片機，且技術難度較大，不如低溫包埋法易推廣。低溫包埋劑的研究開始于60年代，80年代免疫細胞化學技術在電鏡水平上的廣泛的應用，為低溫包埋劑的實驗 研究開辟了廣闊的領域。國內(nèi)已有較多的應用報道，國內(nèi)一些實驗室已開始摸索。作為低溫包埋劑的多為乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯(Glycolmethacrylate,GMA ) ,Lowicryls, LRWhite和Lr Gold等，目前國外生產(chǎn)廠家有 Polysciences INC , Reichert Jung和LKB等系列 產(chǎn)品?，F(xiàn)將常用的幾種低溫包埋劑及其應用簡單介紹如下：Lowicryls是

9、丙烯酸鹽(acrylate) 和甲基丙烯酸鹽(methacrylate)化學物質(zhì)，包括 K4M、HM20、K11M、KM23等系列產(chǎn)品(Polysciences INC),其特點是能在低溫下保持低 粘度(K4M : -35 C; HM20 : -70 C; K11M、HM23 : -60 C1-80 C)和具有在光照射(紫 外光，波長360nm)下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無度。其中 K4M和K11M具有親水性，特別適合于免疫細胞化學的應用，因它能較好地保持組織結構和抗原性，減少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于掃描、透射電鏡和暗視野觀察 切片的制作。所有這些

10、種類的低溫包埋劑都適用于冰凍置換技術。K4M的應用和報道較多，現(xiàn)側重介紹如下：(1)包埋劑的配制：商品提供的 Lowicrys包埋劑由三個部分組成：單體( Monomer), 交聯(lián)劑(Crosslinker)和引發(fā)劑(Initator)。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量， 組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：K4M :單體17.30g TOC o 1-5 h z 交聯(lián)劑2.70g引發(fā)劑0.10gK11M :單體19.00g交聯(lián)劑1.00g引發(fā)劑0.10g作者的經(jīng)驗，可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒輕攪35min或用一小管通入液氮氣泡以攪拌之。勿過

11、分攪拌，以防氧的氣泡進入包埋劑中。(2)生物樣品處理程序(Lemanski等1985)動物麻醉取材，以多聚甲醛一賴氨酸一過碘酸鈉在9c固定2h。磷酸緩沖液含7%蔗糖，pH7.2，沖洗過夜，0c0.1mol/L磷酸緩沖液，pH7.2,沖洗，0c脫水：65%乙醇，1h,0C80% 乙醇，2h,-35 cLowicryl K4M : 80% 乙醇=1： 11h -35 cLowicryl K4M : 80% 乙醇=2: 11h -35 C100% Lowicryl K4M 1h -35 C100% Lowicryl K4M 過夜-35 C包埋：新鮮K4M置于膠囊內(nèi)，將組織移入，在-30 C-40 C

12、以紫外線燈波長 360nm 2 x 15W （Ladd Research Industries Burlington VT ）相距 3040cm 照射 24h 使之聚合。如為 100W燈泡，照射距離應大于 85cm。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續(xù)照射23天，可增加其硬度，便于切片。（3）免疫染色切片（厚5070nm）貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的饃網(wǎng)上。所有下列步驟在室溫、濕盒內(nèi) 進行。所有溶液需經(jīng)微孔濾紙（0.250.45（1 m）濾過。正常羊血清 30min。第一抗血清（PBS稀釋），37C2ho可用燒杯法（或塑料壺噴洗法），以鐐夾饃網(wǎng)在第一燒杯中洗蕩30min,然后在第二燒杯中洗蕩1h。正常羊

13、血清 30min。第二抗血清（膠金標記抗體）以正常羊血清稀釋為 1:1,以饃網(wǎng)置于血清滴上孵育 1ho沖洗如。覆于2%OSO4水溶液上，30min。沖洗如。干燥后在電鏡下觀察。（4） Lowicryl K4M 快速包埋染色法（Altman 等 1984）包埋劑的配制：單體13g交聯(lián)劑2g引發(fā)劑75mg生物樣品處理：除了聚合這一步驟外，下列所有步驟都在20 c進行。1）組織用3%戊二醛一3%多聚甲醛磷酸緩沖液， pH7.4,在20c固定12h。用磷酸緩 沖液清洗后進行脫水。2）脫水：在50%、75%和90%的雙甲基甲酰胺 （Dimethylformamde,DMF ）內(nèi)系列脫水,每步 10min

14、。3）浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2 10minLowicryl K4M:DMF=1:1 15min100% Lowicryl K4M20min100% Lowicryl K4M25min4）包埋與聚合：組織移入裝滿 K4M的膠囊中，以紫外線燈照射聚合（紫外線燈條件同 上），燈和組織距離10cm,4c照射45min,組織塊在室溫進行超薄切片（切片時水槽內(nèi)水面 應略低以防浸濕組織塊的切面）。5）以覆有碳膜的饃網(wǎng)撈取切片。6）免疫染色。整個包埋時間僅需 45h。Lowicryls應保存在暗處，-4C,該物質(zhì)有刺激性，在配制時應戴手套，以免觸及皮膚。在通風櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。

15、如觸及皮膚和眼睛，應立即以水沖洗局部，氧化重金屬如KmnO4能與包埋劑作用而影響染色效果，以不用為佳。LR White和Lr gold是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂，具有極低的粘度（8cps）和較強的嗜水性，因此有較強的穿透性，有利于抗體（或抗原）和免疫化學物質(zhì)穿過LR樹脂，達到組織結合部位。在免疫細胞化學的光鏡（半薄切片）和電鏡水平應用都具有良好效果。標本脫水至 70%乙醇即可，能較好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在國外提供廠家有Poly - sciences INC等，Lr gold是一種光引發(fā)低發(fā)低溫聚合的包埋劑，對于免疫細胞化 學特別適用，能最大限度地保持組織的抗原與

16、抗體活性，其最佳光聚合溫度在-25 C,在聚合后呈現(xiàn)金黃色，因而得名。 Lr white可在熱和冷兩種情況下聚合，熱聚合在 60C, 24h, 冷聚合在-25 C ,需加加速劑（accelerator）調(diào)整配制比例。生物樣品處理與免疫染色等同常 規(guī)樹脂切片。GMA 是乙二醇甲基丙烯酸酯 （Glycol Methacrylate 即 2hydroxyethyl methacrylate, HEMA ）的縮寫。遠在60年代，電鏡工作者就試圖將其作為生物包埋劑應用于光鏡和電鏡。 GMA作為電鏡包埋劑的優(yōu)點是電子密度大，影像反差好。但存在三個主要缺點：一是包埋 聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。二是

17、聚合過程中易造成組織損傷如人為的細胞器腫 脹。三是缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束的轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形。故后 來為環(huán)氧樹脂所取代。聚合后的環(huán)氧樹脂有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不夠滿意始終是個有待解決的問題。而GMA包埋切片的染色效果明顯優(yōu)于環(huán)氧樹脂。于是電鏡工作者如 Leduc和Bernhard （1986）嘗試以增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入適量的增塑劑如聚乙二醇400（PEG400）以改變其硬度，加入適量的聞聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate ）以增強其抗電子

18、束轟擊的穩(wěn)定性。為避免聚合時過快，產(chǎn)生高溫，損傷組織結構，選用低溫型引發(fā)劑一過氧化苯甲酰(Benzoyl Peroxide),溫度范圍-10C-30C。經(jīng)過不斷的配制改進，現(xiàn)GMA已廣泛應用于半薄切片(13m)的光鏡觀察，特別是組織化學方面的研究 和電鏡水平的免疫細胞化學技術?，F(xiàn)將GMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細胞化學染色方法簡介如下：GMA單體溶液在出廠時都加有氫醍類穩(wěn)定劑，用前須以每25ml單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩5min,過濾以除去氫酯，以免影響聚合。(2)包埋劑的配制：100% GMA66.5mlN 一甲基丙烯酸丁酯28.5ml TOC o 1-5 h z 5%乙烯二甲丙烯酸酯5.0ml%過氧體苯甲酰1.0g%PEG 4001.0mlb.A 液：GMA 單體液90mlPEG 4005 9.4ml過氧化苯甲酰0.20.69g攪拌溶解后置棕色瓶內(nèi)；4c保存。B液：PEG 40020ml二甲基苯胺1ml應用時A: B按10: 1比例充分混合(張承志等 1986)。(3)生物樣品處理：組織固定可用 PLP液或1%戊二醛溶液(磷酸緩沖液配制，pH7.4)。 經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的GMA單體溶液中浸24h。以上步驟可在室溫或 4c進行。(4)包埋聚合：組織移入盛潢包埋液的膠囊內(nèi)，先放在真空泵內(nèi)以去除包埋液中的氣 泡，然后在4C,以