1、關(guān)于酵母表達(dá)系統(tǒng)第一張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月三 酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)其它酵母表達(dá)系統(tǒng)第二張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（一） 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母分泌系統(tǒng)釀酒酵母系統(tǒng)啟動子釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)存在的問題釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第三張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、釀酒酵母啟動子UASURSTATA起始位點(diǎn)編碼序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)； 4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT； 5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;DAS第四張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022

2、年6月1）糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的強(qiáng)啟動子，受葡萄糖誘導(dǎo)： 甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脫氫酶基因ADH釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)常用啟動子第五張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2）半乳糖激酶啟動子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因連鎖在一起，獨(dú)立轉(zhuǎn)錄，共同調(diào)控B、GAL4產(chǎn)物與UAS結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄；GAL80產(chǎn)物抑制GAL4產(chǎn)物的活性，阻遏轉(zhuǎn)錄C、野生型GAL4表達(dá)水平低，產(chǎn)物活性可被GLAL80產(chǎn)物完全抑制，半乳糖誘導(dǎo)效果差半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制第六張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6

3、月2）半乳糖激酶啟動子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、 將GAL4的啟動子換成GAL10的誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子B、半乳糖誘導(dǎo)GAL4高表達(dá)，不受GAL80產(chǎn)物抑制，激活GAL1等高效轉(zhuǎn)錄半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制PromoterGAL10第七張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3）pho4TS-PHO5啟動子A、PHO5啟動子在培養(yǎng)基缺磷酸鹽時啟動轉(zhuǎn)錄B、PHO4基因編碼產(chǎn)物是PHO5啟動子的正調(diào)控因子C、pho4TS 溫度敏感，35時失活，PHO5關(guān)閉D、pho4TS-PHO5啟動子通過降溫（23）誘導(dǎo)表達(dá)低溫誘導(dǎo)、磷酸鹽抑制第八張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于20

4、22年6月釀酒酵母系統(tǒng)常用分泌信號肽來源： 性結(jié)合因子：MF- 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 殺手毒素因子：KIL2、釀酒酵母分泌系統(tǒng)第九張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月*保守性低，大多異源宿主系統(tǒng)的信號肽不能互用*信號肽結(jié)構(gòu)： 釀酒酵母信號肽特點(diǎn)正電荷區(qū)疏水區(qū)極性區(qū)Met目的蛋白信號肽剪切位點(diǎn)第十張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月*分泌效率高*在酵母系統(tǒng)具有通用性*88個殘基組成 MF-信號肽Met目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13編碼的二肽酶第十一張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月糖基化位點(diǎn)

5、：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天門冬酰氨酸殘基上的酰胺氮進(jìn)行糖 基化，對蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性及活性較重要。 O-型糖基化：蘇氨酸/絲氨酸上的羥基氧進(jìn)行糖基化 3、釀酒酵母糖基化系統(tǒng)第十二張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月* 過糖基化（超糖基化修飾）： N型或O型糖基的外鏈進(jìn)一步形成龐大的、由甘露糖組成的、復(fù)雜分支結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。增加了免疫原性、對活性與藥代穩(wěn)定性均有影響。*糖鏈組成 O型糖鏈僅由甘露糖組成、而哺乳細(xì)胞的還含唾液酸基團(tuán)釀酒酵母糖基化特點(diǎn)第十三張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1）表達(dá)水平普遍不高 A、表達(dá)載體傳代不穩(wěn)定（YEp、YRp

6、） B、所采用的強(qiáng)啟動子調(diào)控不嚴(yán)謹(jǐn) C、不能利用簡單的無機(jī)培養(yǎng)基進(jìn)行高密度發(fā)酵2）分泌表達(dá)產(chǎn)物過糖基化4、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺陷第十四張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月（二） 甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)操作原理甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素與對策甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)第十五張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作單一碳源的一類酵母。 畢赤酵母（Pichia pastoris) 漢森酵母（Hansenula ploymorpha) 假絲

7、酵母（Candia boidinii) 第十六張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇氧化酶A、甲醇代謝關(guān)鍵酶，占可溶蛋白的30%以上 B、名稱和拷貝數(shù)不同畢赤酵母/假絲酵母 漢森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOXAOX1、AOX2 MOX 第十七張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子AOX1與AOX2*畢赤酵母和假絲酵母基因組存在二個AOX基因 AOX1、AOX2*AOX1與AOX2基因97%同源*AOX1 占主導(dǎo)地位，負(fù)責(zé)AOX 99%以上活性第十八

8、張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動子甲醇氧化酶啟動子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強(qiáng)的真核啟動子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動子 AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) 第十九張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)A、表達(dá)水平高（最高水平的系統(tǒng)）B、產(chǎn)物可翻譯后修飾：糖基化、磷酸化、酰脂化C、過糖基化程度比釀酒酵母少（8-15個vs100-150 個甘露糖）D、產(chǎn)物可正確折疊和高效分泌（最高分泌表達(dá)系統(tǒng)）E、可利用簡單無機(jī)鹽培養(yǎng)基高密度發(fā)酵，生物量大。F、實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)操作簡單G、不能滿足結(jié)構(gòu)要求嚴(yán)格的糖基化

9、 第二十張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)操作原理宿主株與標(biāo)記基因甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件胞內(nèi)表達(dá)與分泌表達(dá)第二十一張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)宿主二大宿主系統(tǒng)主要特點(diǎn)項(xiàng)目 畢赤酵母 漢森酵母最適溫度 30 37最適pH值 4.5 4.5甘油阻遏 是 否糖基化 部分過度 較正常高密度發(fā)酵 100g/L 100g/L 第二十二張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)宿主二大宿主系統(tǒng)主要選擇標(biāo)記宿主 選擇標(biāo)記畢赤酵母 his4、G418、 Zeocin、Cu+漢森酵母 leu2、 his3 、ura3、 G418第二十三張，PPT共

10、四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)宿主畢赤酵母系統(tǒng)主要宿主株宿主株 特點(diǎn) Y11430 野生型、Mut+GS115 his4- 、Mut+KM71 his4-、 aox1:ARG4 (AOX1-)、Muts SMD1168 his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003 his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生長第二十四張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件YRp型載體：漢森系統(tǒng) 傳代不穩(wěn)定，傳代過程同源或非同源重組，高選擇壓力迫使高拷貝數(shù)整合，可達(dá)100拷貝。YIp型載體：A、在靶序列處線性化載體DNA，誘導(dǎo)同源重組B、有“插入”和“取代”二類整合模式

11、C、主要為單拷貝整合，1-10%為多拷貝整合 第二十五張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月畢赤酵母系統(tǒng)模式表達(dá)載體第二十六張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1）AOX1位點(diǎn)插入宿主株:GS115、KM71可插入位點(diǎn)： 5AOX1 3AOX1 TT轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts第二十七張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2）His4位點(diǎn)插入轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts宿主株:GS115、KM71可插入位點(diǎn)： 5His4 3His4第二十八張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3） 多基因插入事件（串聯(lián)整合）

12、宿主株:GS115、KM71可插入位點(diǎn)： 5AOX1 3AOX1 TT轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts第二十九張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4） 基因取代（GS115，AOX1+）轉(zhuǎn)化子：His4+Muts第三十張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月漢森酵母系統(tǒng)的高拷貝整合型表達(dá)載體高拷貝整合元件：A、高度重復(fù)序列：rDNA 提供多個整合位點(diǎn)B、缺陷型標(biāo)記基因：Leu2d 提高選擇壓力C、抗性標(biāo)記；neo 提高選擇壓力 第三十一張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體表達(dá)載體類型需要帶入ATG單位點(diǎn)第三十二張，PPT共四十

13、三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體表達(dá)載體類型需要帶入ATG多位點(diǎn)第三十三張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體信號肽：PHO1第三十四張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體信號肽：MF第三十五張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體信號肽：MF標(biāo)記：Kan第三十六張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月4、甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響因素與對策載體穩(wěn)定性基因劑量整合位點(diǎn)甲醇利用表型mRNA5端AT含量分泌信號表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性第三十七張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月1）載體穩(wěn)定性同拷貝數(shù)時，

14、整合型的比自主復(fù)制型的表達(dá)水平高YRp型載體的穩(wěn)定化： 選擇非選擇培養(yǎng)交替數(shù)十代可得穩(wěn)定的整合子，但費(fèi)時，整合位點(diǎn)不確定。采用YIp型載體: 更易實(shí)現(xiàn)整合、整合位點(diǎn)清楚第三十八張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月2）基因劑量外源基因表達(dá)存在基因劑量效應(yīng)篩選多拷貝整合子 載體引入G418/Zeocin抗性標(biāo)記，整合子拷貝數(shù)與抗性成正相關(guān)，采用高G418/Zeocin抗性轉(zhuǎn)化子。體外串聯(lián)多個表達(dá)盒，直接獲多拷貝整合子采用YRp型載體穩(wěn)定化技術(shù)獲高拷貝整合子構(gòu)建高拷貝整合型表達(dá)載體第三十九張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月3）整合位點(diǎn)外源基因表達(dá)盒整合于AOX/MOX或標(biāo)記基因處，均可高效表達(dá)畢赤酵母中個別情況整合于His4位點(diǎn)的比AOX1位點(diǎn)的低4）甲醇利用表型 在分泌表達(dá)情況下，甲醇慢生長型更利于表達(dá)第四十張，PPT共四十三頁，創(chuàng)作于2022年6月5）mRNA5端mRNA5端非翻譯區(qū)（