1、生脈注射液對百草枯中毒大鼠肺組織核因子-B以及誘導(dǎo)型一氧化氮【摘要】目的觀察百草枯PQ急性中毒大鼠所致肺損傷(ALI)時核因子-B和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNS)的變化，討論生脈對急性百草枯中毒所致肺損傷的保護(hù)作用。方法將50只SD大鼠隨機(jī)分成5組，空白組、陰性對照組、陽性對照組、生脈低劑量組和生脈高劑量組。觀察大體標(biāo)本組織病理，同時測定肺組織核因子-B和iNS活性。結(jié)果與陰性對照組相比，生脈低劑量組肺組織病理顯示肺淤血、肺水腫明顯減輕；核因子-B和iNS也降低(P0.05或P0.01。結(jié)論核因子-B及iNS在百草枯所致大鼠肺損傷中起重要作用，生脈注射液能降低核因子-B及iNS程度，減輕百草枯中

2、毒大鼠肺組織損傷?！娟P(guān)鍵詞】生脈注射液百草枯肺損傷核因子-B一氧化氮一氧化氮合酶Abstrat:bjetiveTinvesigatetheprtetiveeffetfpulse-ativatinginjetinagainstratautelunginjury.ethds50Sprague-Daley(SD)ratsererandlydividedintfiveexperientalgrups:blankgrup,negativentrlgrup,psitiventrlgrup,Pulse-ativatinginjetinldsegrup(LDG),Pulse-ativatinginjetinh

3、ighdsegrup(HDG).arspiandhistpathlgialexainatinsereperfred,andtheativitiesflungtissuehgenateNK-BandiNSereeasured.Resultsparedithnegativentrlgrup,andbilgialindexesflunginjuryandthententsfNK-BandiNSeresignifiantlydereasedinpulse-ativatinginjetingrups(P0.05,P0.01).nlusinNK-BandiNSplayiprtantrlesinlungin

4、juryfpisnedrats.Pulse-ativatinginjetinanaeliratethelunginjuryanddereasethelevelsfNK-BandiNS.Keyrds:Pulse-ativatinginjetin;Paraquat;Lunginjury;NF-B;Nitrixide(N);Induiblenitrixidesynthase(iNS)百草枯paraquat,PQ以其良好的除草效果而在世界范圍被廣泛使用，但隨之帶來的誤服或自殺性口服的極高死亡率又給醫(yī)療工作者提出了宏大的挑戰(zhàn)。百草枯中毒致死量小，肺組織中藥物濃度最高，因此肺損傷最為嚴(yán)重，患者多死于呼吸窘

5、迫綜合征。人們嘗試用各種方法治療百草枯中毒，但迄今尚無特效解毒劑。研究說明，百草枯導(dǎo)致肺損傷的原因之一是核因子-B和iNS活性的增高1，而生脈能明顯降低急性肺損傷大鼠一氧化氮程度和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶iNS活性，因此生脈注射液用于慢性阻塞性肺疾病PD、慢性支氣管炎、肺結(jié)核和中毒性休克等的治療2,3，但用于百草枯中毒的治療尚未見報道。因此本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制百草枯急性中毒大鼠模型，討論生脈注射液對百草枯中毒所致急性肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床搶救百草枯中毒提供新的挽救藥物。1材料與方法1.1材料20%PQ濃縮液英國捷利康農(nóng)藥部；生脈注射液吉林省集安益盛藥業(yè)股份，批號：080115；地塞米松磷酸鈉注射液

6、鄭州卓峰制藥廠。鼠抗人單克隆NF-Bp65抗體S-8008、SP免疫組化染色試劑盒SP-9002及濃縮型DAB試劑盒ZLI-9032均購自北京中山生物技術(shù)；一氧化氮試劑盒，一氧化氮合酶測定試劑盒，考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。SHA-BA型雙功能水浴恒溫振蕩器金壇市杰瑞爾電器；X-80A型渦旋混勻器上海滬西分析儀器廠；UNIVERSAL-16R型臺式低溫離心機(jī)德國HettihENTRIFVGENTD；StatFax-2100型酶標(biāo)儀AARENESSTEHN-LGYING；KX41倒置生物顯微鏡日本LY-PUS。1.2動物及分組SD大鼠稱重后，空白對照組腹腔注射生理鹽水

7、30g/kg，其他組腹腔注射20%百草枯溶液30g/kg復(fù)制百草枯急性中毒模型。動物分組如下：空白對照組(NS)：腹腔注射生理鹽水4g/kg；陰性對照組(PQ)：腹腔注射生理鹽水4g/kg；陽性對照組(D)：腹腔注射地塞米松0.5g/kg；生脈低劑量組(LDG)：腹腔注射生脈注射液0.2l/kg；生脈高劑量組(HDG)：腹腔注射生脈注射液0.4l/kg。以上5組動物均給藥2次/d，連續(xù)給藥3d。1.3標(biāo)本的搜集與處理用水合氯醛麻醉大鼠后開胸暴露出氣管和雙肺，腹主動脈取血處死，留取血清；并立即取出肺組織備用。1.4N測定精細(xì)稱取一定量的肺組織，在持續(xù)95%(體積分?jǐn)?shù))2-5%(體積分?jǐn)?shù))2，37

8、恒溫條件下振蕩孵育2h，取孵育液100l，按試劑盒說明嚴(yán)格操作。1.5肺組織iNS活性的測定速取肺組織適量，按15(/V)參加預(yù)冷的提取液，冰浴中勻漿，4，3000r/in離心10in，搜集上清液，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒進(jìn)展蛋白定量，iNS試劑盒測定提取液iNS活性。1.6肺組織NF-Bp65的測定采用免疫組化鏈霉親和素-生物素標(biāo)記LSAB法進(jìn)展染色，觀察NF-Bp65在大鼠肺組織中的表達(dá)和分布情況。一抗選用兔抗鼠NF-Bp65多克隆抗體，稀釋度為1100，用SP試劑盒，按說明書依次進(jìn)展操作。鏡下隨機(jī)選取5個高倍視野，計算5個高倍視野中陽性細(xì)胞以胞膜/胞漿/胞核出現(xiàn)棕黃色著色顆粒為陽性標(biāo)記占細(xì)胞總

9、數(shù)的百分比。1.7組織學(xué)檢查取少許肺組織，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色后用顯微鏡觀察肺組織損傷情況。1.8統(tǒng)計學(xué)處理實(shí)驗(yàn)資料以s表示。兩組以上資料采用ne-ayANVA分析、組間Nean-Student-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)展統(tǒng)計學(xué)處理；兩組資料采用Studentsttest處理。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1肺組織N和iNS的變化研究結(jié)果說明,PQ組肺組織N濃度和iNS活性明顯高于NS組(P0.01，說明百草枯可引起肺組織產(chǎn)生大量N，并使肺組織iNS活性增高。應(yīng)用生脈、地塞米松進(jìn)展干預(yù)治療后，其肺組織N濃度和iNS活性較PQ組明顯降低(P0.01，P0.05，因此生脈可

10、抑制肺組織產(chǎn)生N并抑制iNS活性，而且低劑量生脈效果更佳。結(jié)果見表1及圖12。表1肺組織中N，iNS含量的變化略轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2肺組織中NF-Bp65表達(dá)的變化研究結(jié)果說明，NS組大鼠肺組織中NF-Bp65不表達(dá)或有很弱的表達(dá)，而PQ組大鼠NF-Bp65有過強(qiáng)表達(dá)，二者比擬有顯著性差異P0.01，說明百草枯中毒可導(dǎo)致肺組織中NF-Bp65的過表達(dá)；與PQ組相比，D組和HDG組大鼠NF-Bp65表達(dá)稍有降低，但是無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05；而LDG組大鼠NF-Bp65表達(dá)明顯降低，二者比擬有顯著性差異P0.01。結(jié)果見表2及圖3。表2肺組織中核因子-Bp65表達(dá)的變化略與PQ組比擬，*P

11、0.01；n=102.3組織病理學(xué)改變正常大鼠肺呈粉紅色，色澤光亮，質(zhì)地柔軟，中毒大鼠肺組織體積腫脹增大，呈暗紅色，質(zhì)地中等，可見邊界明晰的大片淤血，生脈低劑量組肺色澤明顯變淺，水腫減輕，肺呈小片狀淤血。生脈高劑量組稍有改善。肺組織病理學(xué)檢查可見：空白對照組大鼠肺泡構(gòu)造明晰，肺泡壁薄，肺泡隔無增寬及充血，無炎性細(xì)胞浸潤及出血現(xiàn)象。陰性對照組肺間質(zhì)彌漫性出血，肺泡腔內(nèi)可見大量紅細(xì)胞滲出和巨噬細(xì)胞浸潤，并伴有肺泡上皮細(xì)胞增生；陽性對照組肺充血稍減輕；而生脈低劑量組肺充血明顯減輕；生脈高劑量組肺損傷稍有改善。此病理檢測結(jié)果與“2.1“2.2項下生物指標(biāo)檢測結(jié)果一致。3討論核因子-BNF-B的激活與肺

12、損傷和肺間質(zhì)纖維化有親密關(guān)系4,5。一方面，NF-B活化后可使宿主細(xì)胞細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄增加，并激活其它細(xì)胞合成IL-6、IL-8等因子，形成一個NF-B與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的正反響圈，放大炎癥反響，使肺損傷進(jìn)一步加重;另一方面，NF-B基因調(diào)控范圍非常廣范，除上述的前炎癥因子外，還參與了一氧化氮合成酶iNS的基因轉(zhuǎn)錄，對誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNS的基因轉(zhuǎn)錄均有調(diào)控作用，使肺內(nèi)N含量增加，后者作為自由基成分加重肺損傷6。而這些因素也均參與PQ中毒肺損傷的發(fā)生。因此，抑制自由基產(chǎn)生及NF-B活化的措施可能是治療百草枯中毒的一個較好途徑。N是生物體內(nèi)一種重要的信號分子，少量內(nèi)源性N能促進(jìn)血管舒張，改善

13、組織微循環(huán)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫對肺有保護(hù)作用。但N也是一種致炎因子，過量的N能促進(jìn)巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，從而誘導(dǎo)多形核白細(xì)胞聚集，進(jìn)一步導(dǎo)致呼吸爆發(fā)，生成氧自由基。且N含有未配對電子和超氧陰離子(2-)有很高的親和力，兩者結(jié)合產(chǎn)生過氧化硝基(N)，N質(zhì)子化形成HN，其本身為強(qiáng)氧化劑，可損傷細(xì)胞，破壞生物膜，引起或加重組織損傷7。另外，N作為第二信使主要由一氧化氮合酶(NS)生成，NS有3種，原生型(nNS)、內(nèi)皮型(enNS)、誘導(dǎo)型(iNS)。前二者主要在氣道上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞；第3種由內(nèi)毒素及多種炎癥細(xì)胞因子刺激合成，常存在于肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及

14、氣道上皮細(xì)胞。iNS激活后產(chǎn)生的過量N使炎性細(xì)胞在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞上粘附并互相作用，引起血管滲漏和肺水腫8。因此N含量增加和iNS活性的進(jìn)步是引起急性肺損傷的重要機(jī)制之一。呼吸衰竭患者肺腎氣陰極虧,心脈瘀滯表現(xiàn)為呼吸困難、發(fā)紺、自汗、納差、煩躁或嗜睡,舌質(zhì)干紅無苔,脈微等危癥9。生脈方有人參、麥冬、五味子3味中藥組成。?方論?吳儀洛?成方切用?卷7：“肺主氣，肺氣旺那么四肢皆旺；虛，故脈絕氣短也。人參甘溫，大補(bǔ)肺氣而瀉熱，為君；麥冬甘寒，補(bǔ)水源而清燥金，為臣；五味酸溫，斂肺生津，收耗散之氣，為佐。蓋心主脈，而百脈皆朝于肺，補(bǔ)肺清心，那么氣充而脈復(fù)，故日生脈。生脈具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴、斂陰止汗之

15、功,使氣復(fù)津回，汗止而陰存。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，百草枯中毒大鼠給予低劑量生脈注射液治療后使肺組織核因子-B和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)降低，因此可能對百草枯中毒有一定治療作用。假如配合其他方法對百草枯中毒患者進(jìn)展全方位治療，爭取延長患者生命，為進(jìn)一步降低死亡率創(chuàng)造必要的條件?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1佟飛,田英平,石漢文，等.急性百草枯中毒大鼠肺組織核因子-B及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)變化的研究J.中國急救醫(yī)學(xué),2022,26(7):520.2何新華,李春盛,桂培春.生脈飲對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠一氧化氮及其合酶的影響J.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2022,133：175.3雷水賢,商振球,陳小龍，等.生脈飲對肺結(jié)

16、核患者細(xì)胞免疫功能的影響J.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2022,17(8):467.4ASerran-llar,Dlsa.Invivantixidanttreatentprtetsagainstbleyin-induedlungdaageinratsJ.BritishJurnalfPharalgy,2022,138:1037.5AbrahaE.NeutrphilsandautelunginjuryJ.ritareed,2022,31(4Suppl):S195.6Ying-HuaLi，Zhng-QunYan.Ativatinfarphagenulearfatr-BandindutinfinduiblenitrixidesynthasebyLPSJ.RespirRes,2002,3(1):23.7angD,EiJ,HsuK,etal.Effetfnitrixid