1、熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)要求熒光定量PCR引物的具體設(shè)計(jì)要求：引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5端的 300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment軟件看看結(jié)果。產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61KJ/mol）。引物長(zhǎng)度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。G+C含量在40%60%之間，45-55%最佳。堿基要隨機(jī)分布，盡量均勻。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物5端可以修飾。93端不可修飾，而且要避開(kāi)AT,GC rich的區(qū)域，避開(kāi)T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3 個(gè)）。引物3端要避開(kāi)密碼子的第3

2、位。引物整體設(shè)計(jì)自由能分布5端大于3端，且3端自由能最好小于 9KJ/mol。可用oligo 6軟件進(jìn)行比對(duì)看結(jié)果的情況。做熒光定量產(chǎn)物長(zhǎng)度80-150bp最好，最長(zhǎng)是300bp.引物設(shè)計(jì)避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區(qū)。引物與非特異性擴(kuò)增序列的同源性最好小于70%或者有8個(gè)互補(bǔ)堿基同 源。查看有無(wú)假基因的存在。假基因就是無(wú)功能的DNA序列，與需要擴(kuò)增的 目的片段長(zhǎng)度相似。TM值在58-62度之間。引物設(shè)計(jì)的軟件Primer 5.0有專門針對(duì)熒光的。ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGAC

3、ACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTC

4、AAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 35 GACCACAAAGTCAGCCCCAG 3ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGC

5、ATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAAC

6、TGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGPrimer:3T GACGGTGAGTTTTCIGACAAC 55 r CTCTTATGACCI(GCACGCTATGGCIGCCACTCA2GACI(mBGATG(CCATCTGGGACIGGAGAGGTGGAAG 3RatingLengthGC%I AG kcal 501 olActivity 呻BDegeneracyTa

7、Opt 地Sense100-413Direct Select:Results前噩prTT1 450450prTT1 4704B0prTT1 Primer:3T GACGGTGAGTTTTCIGACAAC 55 r CTCTTATGACCI(GCACGCTATGGCIGCCACTCA2GACI(mBGATG(CCATCTGGGACIGGAGAGGTGGAAG 3RatingLengthGC%I AG kcal 501 olActivity 呻BDegeneracyTa Opt 地Sense100-413Direct Select:Results前噩prTT1 450450prTT1 4704B0

8、prTT1 430500prTT1 51060.4Anti-senseHairpinDimerFalse PrimingCrossDimerProductNo Cross Dimers FoundSenseAnti-senseNoneNoneNoneNone478NoneNoneNone5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 35 GCACAGTTGTCATAAGACCCTCAAC 33T CAACTCCCAGAATACTGTTGACACG 5E. r3T CAACTCCCAGAATACTGTTGACACG 5E. r CAGGTTTCTTGTTGAGGCTCrTATGACAACTG

9、CACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGrTGATGGTCCATCAATG 31 4301 4401 4501 4SO1 4701 4801 4901500RFGIVE GLMTTV HAMAATQ KTVDGPSMHairpinDimerHairpinDimerFalse PrimingCrossDimerSense| None | NoneNoneFoundAnti-sense|Found |Eond |NoneRatingSe q N oLengthTim性GC%AG kcal5/mDl|Activity 郵DDegeneracyTa Opt rcSense1003372

10、260.4S4.5-41.330.111Anti-sense874632562.048.0-43.531J11Product跖12785忐47-253.0Most Stable Hairpin:;AG = -13 kcals/niDl (3B Hairpin)5 GAGAAGGAATACACACCCGAGC 35 GACCCTCAACAATGCCAAACC 35 CAACGAGAAGGAATACACACC 35 ACCCTCAACAATGCCAAAC 3TKGAPDH內(nèi)參qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)如下:1.119bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCA

11、CTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGACTTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGT GTCAACGAG

12、AAGGAATACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGApDH-qF5, GTCAACGAGAAGGAATACACACC 3TKGApDH-qR5， AGACCCTCAACAATGCCAAAC 3，2. 156bpATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCC

13、GTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAAGTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTTCGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGGCTGGGGCTGAC TTTGTGGTCGAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGGTGCA AAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATG

14、GGTGTCAAC GAGAAGGAA TACACACCCGAGCTTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGCCAAG GTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTAT GGCTGCCACTCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAGTKGAPDH-QF 5 gagaaggaatacacacccgagc 3TKGAPDH-QR 5 aacagtcttttgagtggcagcc 3圍Resultsr . EditEgP ri

15、mersE圍Resultsr . EditEgP rimersE3 CCGACGGTGAGTTTTCTGACAA 5I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Ii i i i I i i i iI i i i i I i i i iI i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i i I i i i iI i i i i I i i i iI i i i i I i i i iI i i1 4501 46。1 4701 4801 490150015101 520LMTTV HAMAATQ KTVD GPSMKDWaGGRatingSeq NoLengthTm 性GC%AG kcal5/mDl|Activity 皿啊DegeneracyTa Opt rcSense1003372260.454.5-41330.11Anti-sense&8