1、高通量測(cè)序（NGS）在臨床精準(zhǔn)診斷中的應(yīng)用高通量測(cè)序（NGS）在臨床精準(zhǔn)診斷中的應(yīng)用高通量測(cè)序成本迅速下降第一次人類基因組測(cè)序耗時(shí)13年，成本30億美元，到2008年11月，基因組測(cè)序僅需一兩周，花費(fèi)10萬(wàn)美元。新一代儀器可將全基因組序列測(cè)序成本降到1000美元以下，成本不足第一代的百萬(wàn)分之一。而且隨著技術(shù)進(jìn)步，仍在不斷下降。成本快速下降，測(cè)序領(lǐng)域的超摩爾定律助推臨床應(yīng)用高通量測(cè)序成本迅速下降第一次人類基因組測(cè)序耗時(shí)13年，成本3測(cè)序設(shè)備發(fā)展現(xiàn)狀第一代（穩(wěn)定需求）ABi3130 xL(FDA CFDA)3730 xL3500 xL（FDA CFDA）第三代Life Technologies (

2、ABi)Ion Torrent PGMHelicos BiosciencesHelicos Genetic Analysis System Pacific BiosciencesRSSystem 第二代（高速發(fā)展）RocheGenome Sequencer FLX System GS Junior System IlluminaGenome Analyzer IIxMiSeqHiSeq 1000HiSeq 2000HiSeq 2500Life Technologies (ABi)5500 SOLiD System5500 xL SOLiD SystemDanaherMotionPolonato

3、r G.007Complete Genomics無(wú)錫艾吉因生物信息技術(shù)有限公司AG-100深圳華因康基因科技有限公司（CFDA）Pstar-1中科院北京基因組所/半導(dǎo)體所BIGIS-1BIGIS-43測(cè)序設(shè)備發(fā)展現(xiàn)狀第一代（穩(wěn)定需求）第三代第二代（高速發(fā)展）3各類高通量測(cè)序技術(shù)原理各類高通量測(cè)序技術(shù)原理高通量測(cè)序技術(shù)在臨床中的主要應(yīng)用范圍出生缺陷相關(guān)分子診斷中的應(yīng)用無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（NIPT）染色體畸變檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（CNV-seq）胚胎植入前遺傳學(xué)篩查領(lǐng)域中的應(yīng)用（PGS）腫瘤相關(guān)分子診斷中的應(yīng)用遺傳性腫瘤突變檢測(cè)（Germ line）腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（Somatic）液態(tài)活

4、檢（Liquid Biopsy）高通量測(cè)序技術(shù)在臨床中的主要應(yīng)用范圍出生缺陷相關(guān)分子診斷中的出生缺陷防治，任重而道遠(yuǎn)?！?據(jù)估計(jì)，目前我國(guó)出生缺陷發(fā)生率在5.6%左右,每年新增出生缺陷數(shù)約90萬(wàn)例。出生缺陷不僅影響兒童的生命健康和生活質(zhì)量，而且影響整個(gè)國(guó)家人口素質(zhì)和人力資源的健康存量，影響經(jīng)濟(jì)社會(huì)的健康可持續(xù)發(fā)展?！?中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告（2012）出生缺陷防治，任重而道遠(yuǎn)?！?據(jù)估計(jì)，目前我國(guó)出生缺陷新生兒2000萬(wàn)出生缺陷嬰兒100萬(wàn)6染色體疾病10單基因疾病 3040多基因疾病11智力障礙2030各種畸形出生缺陷分為染色體疾病、單基因和多基因疾病新生兒2000萬(wàn)出生缺陷嬰兒100萬(wàn)610

5、30401NGS在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（NIPT）NGS在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（NIPT）NIPT的科學(xué)基礎(chǔ) 血漿游離胎盤DNA胎兒游離DNA：cell-free fetal DNA（cffDNA）Lancet.1997胎盤來(lái)源母體外周血含有的cffDNA，幾乎全部來(lái)源于胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。檢出時(shí)限懷孕4周可檢出，8周后含量上升并穩(wěn)定存在。12NIPT的科學(xué)基礎(chǔ) 血漿游離胎盤DNA胎兒游離DNA：c無(wú)創(chuàng)取樣 - 抽血孕周范圍廣 12周到26周質(zhì)控容易 不依賴孕婦年齡孕周等因素、容易建立標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)規(guī)范不受上一胎影響NIPT相較臨床常見(jiàn)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)無(wú)創(chuàng)取樣 - 抽血NIPT相較臨床常見(jiàn)產(chǎn)前

6、檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)多國(guó)出臺(tái)NIPT指南國(guó)際專業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)表NIPT指導(dǎo)意見(jiàn)美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（ ACOG）和美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)會(huì)（SMFM）美國(guó)遺傳學(xué)咨詢協(xié)會(huì)（NSGC）國(guó)際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)（ISUOG）國(guó)際產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)（ISPD）加拿大婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)（SOGC）美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及基因組學(xué)學(xué)院（ACMG）意大利母胎醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì) 美國(guó)都是CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments）認(rèn)證機(jī)制，無(wú)FDA批準(zhǔn)公司 ACAOG 20150626多國(guó)出臺(tái)NIPT指南國(guó)際專業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)表NIPT指導(dǎo)意見(jiàn)2015.1.15 衛(wèi)計(jì)委婦幼司我國(guó)NIPT臨床應(yīng)用政策法規(guī)目的：完善技術(shù)規(guī)范明確

7、在孕產(chǎn)婦人群中的適用范圍界定其在整體產(chǎn)前篩查與診斷服務(wù)體系中的合理定位規(guī)范服務(wù)流程提高服務(wù)質(zhì)量和管理水平高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范（試行）2015.1.15 衛(wèi)計(jì)委婦幼司我國(guó)NIPT臨床應(yīng)用政策法規(guī)NIPT的臨床質(zhì)量控制21三體綜合征99%18三體綜合征97%13三體綜合征90%檢出率復(fù)合假陽(yáng)性率不高于0.5%假陽(yáng)性率復(fù)合陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不低于50%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值復(fù)合假陰性率約為0.3%假陰性率胎盤/胎兒染色體結(jié)構(gòu)差異（也叫局限性胎盤嵌合，cpm）現(xiàn)象是由于發(fā)育造成的，機(jī)制主要是受精卵發(fā)育早期的染色體糾正，在正常孕婦群體里發(fā)生率約千分之1-5，是nipt假陽(yáng)性發(fā)生的主要原因。這種現(xiàn)象在生殖領(lǐng)域

8、（pgs）也存在，具體指囊胚活檢樣本與其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)染色體結(jié)構(gòu)不一致，發(fā)生比例要比孕期cpm高，大概1-10%，因?yàn)檠芯侩y度較大，具體數(shù)字還沒(méi)有共識(shí)。NIPT的臨床質(zhì)量控制21三體綜合征99%檢出率復(fù)合假陽(yáng)性NIPT的未來(lái)發(fā)展空間大測(cè)序深度染色體非整倍體 唐氏綜合征、愛(ài)德華氏綜合征、等染色體微缺失微重復(fù)綜合征 Digeorge綜合征、貓叫綜合征、等單基因病 耳聾、地中海貧血、苯丙酮尿癥、等AAGCTTGCGACTTCAGTTAGCGCTAAGCCAGTGCATGNIPT的未來(lái)發(fā)展空間大測(cè)染色體非整倍體 染色體微缺失微重復(fù)NGS在染色體畸變檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用（CNV-seq）NGS在染色體畸變檢測(cè)領(lǐng)域

9、中的應(yīng)用（CNV-seq）CNV-Seq應(yīng)用領(lǐng)域流產(chǎn)原因查找產(chǎn)前（羊水、臍血）檢測(cè) 不孕不育原因查找染色體疾病先證者的染色體異常檢測(cè)CNV-Seq應(yīng)用領(lǐng)域流產(chǎn)原因查找CNV-Seq技術(shù)操作流程CNV-Seq技術(shù)操作流程CNV-Seq針對(duì)的人群產(chǎn)前診斷：具有染色體疾病家族病史的夫婦死胎、反復(fù)性流產(chǎn)，需要查明原因的夫婦曾經(jīng)生育有出生缺陷患兒的孕婦染色體核型分析結(jié)果為正常，但超聲顯示結(jié)構(gòu)異常的胎兒及其父母胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩先證者遺傳病診斷：染色體核型分析正常，但臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力低下、自閉、各種畸形、生育障礙等的患者及其父母其他醫(yī)學(xué)檢測(cè)為染色體疾病，需要確診的患者CNV-Seq針對(duì)的人群產(chǎn)前診斷

10、：NGS在胚胎植入前遺傳學(xué)篩查中的應(yīng)用（PGS)NGS在胚胎植入前遺傳學(xué)篩查中的應(yīng)用（PGS)PGS臨床流程PGS臨床流程檢測(cè)內(nèi)容：全部染色體非整倍體大于4Mb的新發(fā)的染色體微缺失/微重復(fù)大于1Mb的遺傳自父母的染色體微缺失/微重復(fù)使用范圍:高齡患者（35歲）有反復(fù)流產(chǎn)史的患者（自然流產(chǎn)3次）反復(fù)胚胎種植失敗的患者（失敗3次）生育過(guò)染色體異?；純旱姆驄D自身染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的夫婦嚴(yán)重的男性不育（SMF），少弱精子癥、畸精癥自愿接受胚胎染色體異常排查的夫婦PGS檢測(cè)內(nèi)容及適用范圍檢測(cè)內(nèi)容：PGS檢測(cè)內(nèi)容及適用范圍對(duì)NGS在PGS應(yīng)用的思考高靈敏NGS技術(shù)的測(cè)序環(huán)境防污染系統(tǒng)的建立 單細(xì)胞測(cè)序

11、操作者脫落細(xì)胞的污染？樣本與植入物的一致性問(wèn)題 胎盤/胎兒染色體結(jié)構(gòu)差異（也叫局限性胎盤嵌合，cpm）現(xiàn)象在生殖領(lǐng)域（PGS）也存在，具體指囊胚活檢樣本與其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)染色體結(jié)構(gòu)不一致，發(fā)生比例大概1-10%，因?yàn)檠芯侩y度較大，具體數(shù)字還沒(méi)有共識(shí)。注冊(cè)審批的難度 1)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制 2)臨床試驗(yàn)的難點(diǎn)?對(duì)NGS在PGS應(yīng)用的思考高靈敏NGS技術(shù)的測(cè)序環(huán)境防污染系NGS在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用*每10萬(wàn)人發(fā)病人數(shù) *每10萬(wàn)人死亡人數(shù)數(shù)據(jù)來(lái)源：全國(guó)腫瘤登記中心的2012中國(guó)腫瘤登記年報(bào)前十大腫瘤發(fā)病占腫瘤整體發(fā)病比例76.39%前十大腫瘤死亡占腫瘤整體發(fā)病比例84.27%發(fā)病率*每年新發(fā)3,120,

12、000人死亡率*每年死亡2,700,000人肺癌，54人胃癌，36人結(jié)直腸癌，29人肝癌，29人食管癌，22人乳腺癌，21人胰腺癌，7人淋巴癌，7人膀胱癌，7人甲狀腺癌，7人肺癌，46人肝癌，26人胃癌，26人食管癌，17人結(jié)直腸癌，14人胰腺癌，7人乳腺癌，5人白血病，4人腦癌，4人淋巴癌，4人NGS在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用*每10萬(wàn)人發(fā)病人數(shù) 多種臨床腫瘤分子診斷需求全面的基因檢測(cè)多種樣本類型可進(jìn)行療效監(jiān)測(cè)靶向用藥相關(guān)基因化療用藥相關(guān)基因腫瘤易感性相關(guān)基因檢測(cè)腫瘤發(fā)生相關(guān)基因檢測(cè)血液樣本小標(biāo)本組織樣本大標(biāo)本組織樣本準(zhǔn)確定量多種臨床腫瘤分子診斷需求全面的基因檢測(cè)多種樣本類型可進(jìn)行療效遺傳性腫瘤

13、突變檢測(cè)（Germ line）臨床應(yīng)用：檢測(cè)多種腫瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)；檢測(cè)腫瘤基因型，判定家系成員患病風(fēng)險(xiǎn)；指導(dǎo)腫瘤個(gè)性化治療?？蒲袘?yīng)用快速、低成本的探索腫瘤相關(guān)基因的突變；若采用毛細(xì)管測(cè)序的技術(shù)，一次只能檢測(cè)一條DNA片段，需要大量人力，成本高，且需要大量DNA樣本。、茱莉 BRCA1陽(yáng)性針對(duì)腫瘤基因外顯子或SNP多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行NGS檢測(cè)。遺傳性腫瘤突變檢測(cè)（Germ line）臨床應(yīng)用：科研應(yīng)用針腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（Somatic）Industry GuidelinesEmerging and Clinical Trials 指導(dǎo)腫瘤的個(gè)體化治療腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測(cè)（Somatic）Ind

14、ustry E很多腫瘤患者無(wú)法進(jìn)行活檢或手術(shù)；穿刺受檢者嚴(yán)重不適感；穿刺自身的臨床風(fēng)險(xiǎn)；取材時(shí)間點(diǎn)受限，很難進(jìn)行多次取樣；腫瘤異質(zhì)性?；诮M織的腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)的局限性很多腫瘤患者無(wú)法進(jìn)行活檢或手術(shù)；基于組織的腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)液態(tài)活檢(Liquid Biopsy)Speicher M R, Pantel K. Tumor signatures in the bloodJ. Nature biotechnology, 2014, 32(5): 441-443.循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (Circulating tumor cells, CTCs)游離腫瘤DNA (Circulating tumor DN

15、A, ctDNA)目前看，ctDNA更適合做液態(tài)活檢液態(tài)活檢(Liquid Biopsy)Speicher M 作為無(wú)法獲取組織標(biāo)本的補(bǔ)充，無(wú)創(chuàng)取樣后的檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，預(yù)測(cè)耐藥及復(fù)發(fā) 提高全程管理水平指導(dǎo)用藥實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)循環(huán)而勻質(zhì)的血液標(biāo)本，在一定程度有效克服異質(zhì)性勻質(zhì)標(biāo)本未來(lái)可用ctDNA血液檢測(cè)進(jìn)行突變狀態(tài)的動(dòng)態(tài)耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)作為無(wú)法獲取組織標(biāo)本的補(bǔ)充，無(wú)創(chuàng)取樣后的檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥腫瘤類型繁多，分子突變特點(diǎn)不一；高靈敏度定性、定量檢測(cè)，技術(shù)分辨率要求高；ctDNA來(lái)源復(fù)雜，不同腫瘤患者個(gè)體差異較大，數(shù)據(jù)解讀與注釋需謹(jǐn)慎；目前仍局限于晚期腫瘤的臨床應(yīng)用；需要大規(guī)模、多中心臨床驗(yàn)證數(shù)據(jù)。ctDNA檢測(cè)技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)腫瘤類型繁多，分子突變特點(diǎn)不一；ctDNA檢測(cè)技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)對(duì)NGS在腫瘤應(yīng)用的思考腫瘤風(fēng)險(xiǎn)易感基因檢測(cè)對(duì)診斷的價(jià)值？ 數(shù)據(jù)庫(kù)的積累？預(yù)測(cè)的精準(zhǔn)性？ 23and me？2013年11月26日，F(xiàn)DA叫停 健康基因檢測(cè)服務(wù)。 2015年3月：批準(zhǔn)其布盧姆綜合癥基因攜帶者檢測(cè)服務(wù)(一種隱性遺傳病)。 BRCA1、BRCA2-乳腺癌易感基因，藥物靶點(diǎn)（奧拉帕尼）2. 腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)的診斷價(jià)值？ 1）小panel基因突變累積-大panel基因突變累積都在用，那個(gè)合適？小panel 2）ARMSPCR