1、乳與乳制品常規(guī)理化指標(biāo)檢驗(yàn)硝酸鹽亞硝酸鹽的檢測YLNB 2.111.范圍本方法規(guī)定了采用鎘還原和光度分析法測定硝酸鹽和 亞硝酸鹽的方法。本方法適用于乳粉、液體奶、乳清粉及嬰兒配方粉中硝 酸鹽和亞硝酸鹽的測定。本方法的檢出極限分別為：硝酸鹽1.5mg/kg；亞硝酸鹽 0.2mg/kgo.原理將樣品溶解于水中，沉淀脂肪和蛋白后，進(jìn)行過濾。用 鍍銅鎘粒使部分濾液中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。在未還原 的濾液和已還原的濾液中，加入磺胺和N-1萘基-乙二胺二 鹽酸鹽，使其顯粉紅色，然后用分光光度計(jì)在538nm波長下 測其吸光度。將測得的吸光度與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度進(jìn) 行比較，就可計(jì)算出樣品中的亞硝酸

2、鹽含量和硝酸鹽還原后 的亞硝酸鹽總量，從兩者之間的差值可以計(jì)算出硝酸鹽的含 量。.試劑測定用水應(yīng)是不含硝酸鹽和亞硝酸鹽的蒸餾水或去離 子水。注：為避免鍍銅鎘粒(4.10)中混入小氣泡，柱制備51)、 柱還原能力的檢查(5.2)和柱的再生(5.3)時(shí)所用的蒸餾 水或去離子水，最好是剛煮沸過并冷卻至室溫的。鍍銅鎘粒：直徑0.3-0.8mm。也可下述方法制備。將適量的鋅棒放入燒杯中，用40g/L的硫酸鎘(CdSO48HO)溶液浸沒鋅棒。在24h之內(nèi)，不斷將鋅棒的海綿狀鎘 2刮下來。取出鋅棒，潷出燒杯中多余的溶液，剩下的溶液能 浸沒鎘即可。用蒸餾水沖洗海綿狀鎘2-3次，然后把鎘移入 小型攪拌器中，同時(shí)

3、加入400ml 0.1mol/L的鹽酸攪拌幾秒 鐘，以得到所需粒度的顆粒。將攪拌器中的鎘粒連同溶液一 起倒回?zé)?，靜置幾小時(shí)，這期間要攪拌幾次以除掉氣泡。 傾出大部分溶液，立即按5.1.1至5.1.8中敘述的方法鍍銅。硫酸銅溶液：溶解20g五水硫酸銅(CuSO4 5H20)于水 中，稀釋至1000ml。鹽酸-氨水緩沖溶液：pH9.60-9.70。用600ml水稀釋75ml 濃鹽酸p 201.19g/mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為38%?；靹蚝?。再加入 135ml濃氨水p 200.91g/mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)等于25%的新鮮的氨 水。用水稀釋至1000ml，混勻。用精密的pH計(jì)調(diào)PH值為 9.60-9.700鹽

4、酸溶液：c (H+)約為2mol/L。用水將160ml的濃鹽 酸(p 2398g/mL)稀釋到 1000ml。鹽酸溶液：c (H+)約為 0.1mol/L。將 50ml 的 2mol/L 鹽酸溶液用水稀釋到1000m1。沉淀蛋白和脂肪的溶液：硫酸鋅溶液：將53.5g的七水硫酸鋅(ZnS04 7H) 溶于水中，并稀釋至100ml。亞鐵氰化鉀溶液：將17.2g的三水亞鐵氰化鉀KFe 2(CN)6 3H20溶于水中，并稀釋至100ml。EDTA溶液：用水將33.5g的二水乙二胺四乙酸二鈉 (Na2c10Hl4N203 2H2O)溶解，稀釋至 1000ml。顯色液1：體積比450： 550鹽酸溶液。將

5、450ml濃鹽酸 加入到550ml水中，冷卻后裝入試劑瓶中。顯色液2： 5g/L的磺胺溶液。在75ml的水中加入5ml 濃鹽酸，然后在水浴上加熱，用其溶解0.5g磺胺(NH2c6H4sO2NH2)。冷卻到室溫后用水稀釋到100ml。必要時(shí) 進(jìn)行過濾。顯色液3： 1g/L的萘胺鹽酸鹽溶液。溶解0.1g的N-1- 萘基-乙二胺二鹽酸鹽于水中，用水稀釋到100ml。如有必要 過濾。注：此溶液應(yīng)少量配制，裝于密閉的棕色瓶中，冰箱中 25 保存。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：相當(dāng)于亞硝酸鹽的濃度為 0.001g/L。將亞硝酸鈉(NaNOj在110-120的范圍內(nèi)干燥至恒重。冷卻后稱取0.150g,溶于1000ml的

6、容量瓶中，用水定 容。在使用的當(dāng)天配制該溶液。于1000ml的容量瓶中，吸取10ml上述溶液和20ml緩 沖溶液（3.3）,用水定容。1毫升此標(biāo)準(zhǔn)溶液含1.00場的NO-o2硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，相當(dāng)于硝酸鹽的濃度為0.0045 g/Lo 將硝酸鉀（KNOJ在110-120的范圍內(nèi)干燥至恒重。 冷卻后稱取1.4680g，溶于1000ml的容量瓶中，用水定容。在使用當(dāng)天，與1000mL的容量瓶中，取5ml上述溶液 和20ml緩沖溶液（3.3）,用水定容。1mL的該標(biāo)準(zhǔn)溶液含有4.50場的NO -。3.儀器及器材所有玻璃儀要用蒸餾水沖洗，以保證不帶有硝酸鹽和亞 硝酸鹽。分析天平。燒杯：100ml。錐形瓶

7、：250ml, 500ml o容量瓶：體積為 100ml, 500ml, 1000ml。移液管：2ml, 5ml, 10ml, 20ml。吸量管：2ml, 5ml, 10ml, 25ml。量筒：根據(jù)需要選取。玻璃漏斗：直徑約為9cm,短頸。定性濾紙：直徑約18cm。還原反應(yīng)柱：簡稱鎘柱。分光光度計(jì)：測定波長為538nm,使用 1-2cm光程的比 色皿。pH計(jì)，精度為0.01，使用前用pH7和pH9的標(biāo)準(zhǔn)溶 液進(jìn)行校準(zhǔn)。.方法制備鍍銅鎘柱置鎘粒（3.1）于錐形燒瓶（4.3）中（所用鎘粒的量 以達(dá)到要求的鎘柱高度為準(zhǔn)）。加足量的鹽酸（3.4）以浸沒鎘粒，搖晃幾分鐘。潷出溶液，在錐形燒瓶中用水反復(fù)沖

8、洗，直到把氯化 物全部沖洗掉。在鎘粒上鍍銅。向鎘粒中加入硫酸銅溶液（3.2）（每 克鎘粒約需2.5ml），搖晃1min。潷出溶液，立即用水沖洗鍍銅鎘粒，注意鎘粒要始終 用水浸沒。當(dāng)沖洗水中不再有銅沉淀時(shí)即可停止沖洗。在用于盛裝鍍銅鎘粒的玻璃柱的底部裝上幾厘米高 的玻璃纖維。在玻璃柱中裝入水，排凈氣泡。將鍍銅鎘粒盡快地裝入玻璃柱，使其暴露于空氣的時(shí) 間盡量短。鍍銅鎘粒的高度應(yīng)在15-20cm的范圍內(nèi)。注：1避免在顆粒之間遺留空氣。2注意不能讓液面低于鍍銅鎘粒的頂部。新制備柱的處理。以不大于6ml/min的流量將由750ml 水、225ml硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.12）、20ml緩沖溶液（3.3） 和

9、20mlEDTA溶液（3.7）組成的混合溶液通過剛裝好鎘粒的 玻璃柱，接著用50ml水以同樣的流速?zèng)_洗該柱。檢查柱的還原能力這種檢查每天至少要進(jìn)行兩次，一般在開始時(shí)和一系列 測定之后。用移液管將20ml的硝酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.12）移入還 原柱頂部的貯液杯中，再立即向該貯液杯中添加5ml緩沖溶 液（3.3）。用一個(gè)100ml的容量瓶收集洗提液。洗提液的流 量不應(yīng)超過6ml/min。在貯液杯將要排空時(shí)，用約15mL水沖洗杯壁。沖洗 水流完后，再用15ml水重復(fù)沖洗。當(dāng)?shù)诙螞_洗水也流完 后，將貯液杯灌滿水，并使水以最大流量流過柱子。當(dāng)容量瓶中的洗提液接近100ml時(shí)，從柱子下取出容 量瓶，用水定容

10、至刻度，混合均勻。移取10ml洗提液于100ml容量瓶中，加水至60ml左 右。然后按 5.8.2、5.8.3、5.8.4 操作。根據(jù)測得的吸光度，通過回歸方程（5.8.5）計(jì)算出稀 釋洗提液（5.2.4 ）中的亞硝酸鹽含量g/mL ）。據(jù)此可計(jì) 算出以百分率表示的柱還原能力（NO -的含量為0.067Ag/mL 2時(shí)還原能力為100%）。如果還原能力小于95%或大于105%, 柱子就需要再生。柱子再生柱子使用后，及鎘柱的還原能力低于95%或高于105% 時(shí)，按如下步驟進(jìn)行再生。在100ml水中加入約5mlEDTA溶液（3.7）和2ml鹽 酸溶液（3.5）。以10ml/min左右的速度過柱。當(dāng)

11、貯液杯中混合液排空后，按順序用25ml水、25ml 鹽酸（3.5）和25ml水沖洗柱子。檢查柱子的還原能力，如低于95%或高于105%,要 重復(fù)再生。樣品的稱取和溶解液體乳樣品：量取90ml樣品于500ml錐形瓶中，用 22ml50-55 的水分?jǐn)?shù)次沖洗樣品量筒，沖洗液傾入錐形瓶 中，混勻。乳粉樣品：在100ml燒杯中稱取10g樣品，準(zhǔn)確至 0.001g。用112ml50-55的水將樣品洗入500ml錐形瓶中， 混勻。乳清粉及乳清粉為原料生產(chǎn)的嬰兒配方粉樣品：在 100ml燒杯中稱取10g樣品，準(zhǔn)確至0.001g。用112ml50-55 的水將樣品洗入500ml錐形瓶中，混勻。用鋁箔紙蓋好錐形

12、瓶瓶口，將溶好的樣品在沸水中煮15min然后冷卻至約50。脂肪和蛋白的去除按順序加入24ml硫酸鋅溶液（3.6.1）、24ml亞鐵氰 化鉀溶液（3.6.2）和40ml緩沖溶液（5.3），加入時(shí)要邊加 邊搖，每加完一種溶液都要充分搖勻。靜置15min-1h。然后用濾紙（4.9）過濾，濾液用250ml 錐形瓶收集。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽移取20ml濾液于100ml小燒杯中，加入5ml緩沖溶 液（3.3）混勻，倒入鎘柱頂部的貯液杯中，以小于6ml/min 的流速過柱。洗提液（過柱后的液體）接入100ml容量瓶中。當(dāng)貯液杯快要排空時(shí)，用15ml水沖洗小燒杯，再倒 入貯液杯中。沖洗水流完后，再用15ml水

13、重復(fù)一次。當(dāng)?shù)?二次沖洗水快流完時(shí)，將貯液杯裝滿水，以最大流速過柱。當(dāng)容量瓶中的洗提液接近100ml時(shí)，取出容量瓶，用 水定容，混勻。測定分別移取20ml洗提液（5.6.3）和20ml濾液（5.5.2） 于100ml容量瓶中，加水至約60ml。在每個(gè)容量瓶中先加入6ml顯色液1（3.8），邊加邊 搖；再加入5ml顯色液2（3.9）小心混合溶液，使其在室溫 下靜置5min,避免陽光直射。加入2ml顯色液3 （3.10）,小心混合，使其在室溫下 靜置5min,避免陽光直射。用水定容至刻度，混勻。在15min內(nèi)用538nm波長，以空白試驗(yàn)溶液為對照測 定上述樣品溶液的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別移?。?/p>

14、或用滴定管放出）0，2，4，6，8，10， 12, 16, 20ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.11）于九個(gè)100ml容量 瓶中。在每個(gè)容量瓶中加水，使其體積約為60ml。在每個(gè)容量瓶中先加入6ml顯色液1（3.8），邊加邊 混；再加入5ml顯色液2（3.9）。小心混合溶液，使其在室 溫下靜置5min,避免陽光直射。加入2ml顯色液3（3.10），小心混合，使其在室溫下 靜置5min,避免陽光直射。用水定容至刻度，混勻。在15min內(nèi)，用538nm波長，以第一個(gè)溶液（不含亞 硝酸鈉）為對照測定另外八個(gè)溶液的吸光度。將測得的吸光度和亞硝酸根質(zhì)量濃度兩組數(shù)據(jù)分別輸 入excel表，通過excel表計(jì)算出

15、回歸方程。亞硝酸根的質(zhì) 量濃度可根據(jù)加入的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量計(jì)算出。亞硝酸 根的質(zhì)量濃度以場/ml表示。（亞硝酸根的質(zhì)量濃度為橫坐 標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)。）.結(jié)果計(jì)算亞硝酸鹽的含量樣品中亞硝酸根含量（mg/kg）=20000/G m x V 1式中：:根據(jù)濾液（5.5.2）的吸光度（5.7.4）,通過回歸方程計(jì)算出的NO-的濃度，場/ml； 2m一樣品的質(zhì)量，g；V 一所取濾液（5.5.2）的體積（5.7.1）。 1樣品中以亞硝酸鈉表示的亞硝酸鹽含量W （ NaNO2 ） =1.5 X W （ NO2 -）（2）式中：W （NO-）一樣品中亞硝酸根的含量，mg/kg； 2W （NaNO2）一樣

16、品中以亞硝酸鈉表示的亞硝酸鹽的含量，mg/kg。報(bào)告測定結(jié)果準(zhǔn)確至0.1mg/kg。硝酸鹽含量樣品中硝酸根含量 （mg/kg ）= TOC o 1-5 h z -100000 x C）1.35 x 2 WWO ）m x V2L2式中：c2根據(jù)洗提液（5.6.3）的吸光度（5.7.4）,通過回歸方程計(jì)算出的亞硝酸根離子的濃度，ag/ml；m一樣品的質(zhì)量，g；V 一所取洗提液（5.5.2）的體積（5.7.1）。 2W （NO-）根據(jù)式（1）計(jì)算出的亞硝酸根含量。 2若考慮柱的還原能力，樣品中硝酸根含量 （mg/kg ）=1.35 x 100000 x J _ w（NO ） 100 TOC o 1-

17、5 h z m x V2 x L2r r式中：r 一測定一系列樣品后的還原能力樣品中以硝酸鈉表示的硝酸鹽含量W（NaNO3）=1.371 x W NO3 -）式中：W （NO-）一樣品中硝酸根的含量，mg/kg； 3W （NaNO3）一樣品中以硝酸鈉計(jì)的硝酸鹽的含量， mg/kg。報(bào)告測定結(jié)果準(zhǔn)確至0.1mg/kg。.允許差重復(fù)性由同一分析人員在短時(shí)間間隔內(nèi)測定的兩個(gè)亞硝酸鹽 結(jié)果之間的差值，不應(yīng)超過1mg/kg。由同一分析人員在短時(shí)間間隔內(nèi)測定的兩個(gè)硝酸鹽 結(jié)果之間的差值，在硝酸鹽含量小于30mg/kg時(shí)，不應(yīng)超過 3mg/kg；在硝酸鹽含量大于30mg/kg時(shí)，不應(yīng)超過結(jié)果平均 值的10%。重現(xiàn)性由不同實(shí)驗(yàn)室的兩個(gè)分析人員對同一樣品測得的兩個(gè) 硝酸鹽結(jié)果之差，在硝酸鹽含量小于30mg/kg時(shí)，差值不應(yīng) 超過8mg/kg；在硝酸鹽含量大于或等于30mg/kg時(shí)，該差值 不應(yīng)超過結(jié)果平均值的25%。.注意事項(xiàng)鎘是有害元素，在處理鎘粒時(shí)，不要用手直接接觸，同 時(shí)注意不要弄到皮膚上，一旦接觸立即用水沖洗。實(shí)驗(yàn)用水必須不含有亞硝酸根和硝酸根。氨緩沖液除控制溶液的pH外，還可緩解鎘對亞硝酸根 的還原。對于顏色較深的樣品，在處理時(shí)，應(yīng)加脫色劑進(jìn)行脫色 處理，以防止