1、分支桿菌菌種鑒定研究進展摘 要：由于全球范圍內肺結核及非結核分支桿菌病的發(fā)病呈逐年上升趨勢, 準確 而快速的菌種鑒定技術對結核病的診斷和鑒別診斷及有效化療都有極其重要的 意義。目前國內外采用傳統(tǒng)的分支桿菌菌種鑒定方法需依據(jù)細菌生長速度、色素 產(chǎn)生及多種生化試驗等結果綜合分析才能獲得結果; 而 BACTECTB460、TB960 培 養(yǎng)基系統(tǒng)雖快(2-6d),但只能初步鑒定結核分支桿菌復合群和非結核分支桿菌， 不能將細菌鑒定至種。近年來建立的色譜方法雖能達到部分菌種鑒定的目的, 但 需特殊儀器, 臨床尚未普遍采用。目前國內外研究者都致力于使分支桿菌菌種鑒 定從細胞表型水平進入分子基因水平。現(xiàn)對分

2、支桿菌分子菌種鑒定方法的研究進 展綜述。關鍵詞：分支桿菌，DNA，基因芯片技術，PCRPCR-DNA測序技術 此方法是檢測結核分支桿菌特異性核苷酸序列最直接可靠的方法, 而不對稱PCR技術可直接測出ssDNA序列。Soini等報道用該方法通過PCR擴增分支桿 菌屬的基因片段,能鑒別鳥、胞內分支桿菌,堪薩斯、戈登和馬爾摩分支桿菌均顯 示特異的核苷酸序列。此方法雖準確可靠, 但操作繁雜, 需測序儀器, 實驗費用昂 貴, 限制了其在臨床上的應用?；蛐酒夹g基因芯片技術是近年來發(fā)展的一種大規(guī)模評價基因多樣性的新技術,該方法 是在小型玻璃介質精確位點上進行分子雜交, 已成功地用于基因表達監(jiān)測、突變 基

3、因的篩選以及幾種人基因和病毒基因的多態(tài)性研究。1998年Gingeras等基 于 rpoB 基因序列在檢測結核分支桿菌耐利福平菌株的同時鑒定了 10 種不同菌 種的臨床分離株。1999年Troesch等基于16SrRNA和rpoB基因序列，利用基 因芯片技術鑒定出70株27 種不同菌種的分支桿菌臨床分離株,其中偶然分支桿 菌、猿猴分支桿菌、恥垢分支桿菌、結核分支桿菌、蟾蜍分支桿菌、鳥分支桿菌 復合群等19種菌株得以準確鑒定,但4株傳統(tǒng)表型方法鑒定為鳥分支桿菌分離株 中有 1 株用基因芯片技術鑒定為胞內分支桿菌, 另 4 株胞內分支桿菌分離株中有 1株用基因芯片技術鑒定為鳥/副結核分支桿菌。由此

4、可見,基因芯片技術可以快 速準確鑒定大量的 DNA 序列,解決了傳統(tǒng)菌種鑒定耗時煩瑣的問題,但兩種鑒定 結果存在一些分歧, 需進一步研究, 并且?guī)讉€菌種顯示大量 16SrRNA 或 rpoB 等 位基因。所以,應用單一分離株不能提供充分的數(shù)據(jù)信息來鑒定菌種。聚合酶鏈反應( PCR) 技術PCR又稱DNA體外擴增技術。于80年代末期用于分支桿菌菌種鑒定,但鑒定 的菌種主要有結核分支桿菌、結核分支桿菌復合群、副結核分支桿菌與麻風分支 桿菌。只有Portillo等報道的引物僅擴增結核分支桿菌(MTB),是目前已知的 結核分支桿菌最特異的片段。 Patel 等5設計的引物可區(qū)別牛分支桿菌和結核分 支桿

5、菌復合群的其他分支桿菌。 Wit 等6設計的引物可區(qū)別結核分支桿菌和卡介 苗。Roth等設計的引物因鳥、胞內分支桿菌16-23S rDNA間隔序列相差25個 堿基差異可以將二者區(qū)分開。PCR檢測分支桿菌有突出的優(yōu)越性，因而在此基礎 上延伸的用于分支桿菌菌種鑒定的各項技術應運而生。四限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)分析1.16SrRNA 基因序列 PCR- RFLP 分析技術:1993 年 Vaneechoutte 等8用 Cfo、Mbo、Rsa 3種限制性內切酶消化16SrRNA擴增產(chǎn)物，對99株18種不同菌 種的分支桿菌進行鑒定。1996 年 Avaniss、Aghajan 等9用該方法

6、和引物熒光標 記法相結合準確地鑒定了 13種分支桿菌。用 16S rRNA 擴增的 DNA 必須用純培養(yǎng) 物提取，整個酶切過程僅需8h。由于用單一酶切得到的圖譜信息量少，故至少需2 種限制性內切酶消化后才能達到菌種鑒定的目的。2.16SrDNA 和 23SrDNA 間隔序列區(qū) RFLP 分析技術:近年人們發(fā)現(xiàn)， 不同菌種 16S23SrDNA間隔序列本身所含的tRNA的數(shù)目和類型不同，具有長度和序列上 的多態(tài)性，比 16SrDNA 具有更強的高變性，因而可以作為菌種鑒定的一種方法。 1996 年 Lappayawichita 等10用引物 PL1 和 PL2 擴增 113 株 18 種不同菌種

7、的分 支桿菌， 無需酶切即可鑒別快速生長分支桿菌和緩慢生長分支桿菌。用 Hae、Msp、 Bst 消化擴增產(chǎn)物能鑒別結核分支桿菌復合群、鳥分支桿菌、胞內分支桿菌、戈 登分支桿菌、瘰疬分支桿菌、堪薩斯分支桿菌、蟾蜍分支桿菌等緩慢生長分支桿 菌， 并能鑒別杜氏分支桿菌、母牛分支桿菌、恥垢分支桿菌、龜分支桿菌、草分 支桿菌等快速生長分支桿菌。 1998 年 Sansila 等11用特異性更強的引物 16SC 和23SG擴增380bp片段，經(jīng)Hae酶切后，結核分支桿菌復合群和鳥分支桿菌、胞 內分支桿菌均產(chǎn)生特征性譜型， 經(jīng) Msp 消化后能鑒別胞內分支桿菌和瘰疬分支桿 菌。hsp65基因序列PCR -

8、 RFLP分析技術：1992年Plikaytis等衛(wèi)報道對存在于所有分支桿菌的65kD熱休克蛋白（hsp65）進行擴增，139株19種不同菌種 的分支桿菌均擴增出 1380bp 片段，而19種非分支桿菌未產(chǎn)生此擴增條帶。 126 株6種常見的分支桿菌菌種（結核分支桿菌、牛分支桿菌、鳥分支桿菌、胞內 分支桿菌、堪薩斯分支桿菌和戈登分支桿菌） 擴增產(chǎn)物經(jīng) BstN 和 Xho 兩種內切 酶消化后除結核分支桿菌、牛分支桿菌外均產(chǎn)生可鑒別的譜型。1997 年Devallosis等報道用PCR擴增分支桿菌65kD熱休克蛋白基因的441bp片段， 后經(jīng)BstE和Hae酶切,34種分支桿菌顯示不同的譜型，有

9、些菌種如堪薩斯分支桿 菌、龜分支桿菌、膿腫分支桿菌、蟾蜍分支桿菌、不產(chǎn)色分支桿菌、微黃分支桿 菌可以鑒定至亞群水平。染色體基因組DNA- RFLP分析技術:該方法對染色體基因組DNA用限制 性內切酶消化， 電泳分析譜型， 可將分支桿菌分成幾個大群， 難以將分支桿菌鑒定 到種的水平，而且不同內切酶、不同來源的菌株及不同的染色方法形成的譜型均 不完全相同。其缺點在于， 由于基因組 DNA 限制性內切酶位點眾多， 電泳后形成 的條帶多， 因而， 結果難以判定， 不適于臨床應用。danj基因序列PCR - RFLP分析技術:Take waki等報道danj基因的 PCR 擴增產(chǎn)物內有特異性酶切位點，

10、通過 PCR- RFLP 能快速有效地鑒別結核分支 桿菌復合群與非結核分支桿菌。用 Sma、 Nae、 Hinf、 Fok4 種限制性內切酶能將 19 種非結核分支桿菌分成 10 組， 并能區(qū)別鳥分支桿菌與胞內分支桿菌。 danj 基 因同16SrRNA、hsp65和16S- 23SrRNA間隔區(qū)序列均不能鑒定結核分支桿菌復合 群內的細菌。利用PCR- RFLP二步法鑒定分支桿菌，能檢測DNA核苷酸序列的 微小差異。分支桿菌 DNA 酶切片段有特征性譜型，不僅可用于菌種鑒定，甚至可 以鑒定不同的菌株，在臨床診斷及流行病學方面均有重要意義，具有廣闊的應用 前景，關鍵在于引物的設計和限制性內切酶的

11、選擇。五、PCR-單鏈構象多態(tài)性（PCR- SSCP）分析技術PCR- SSCP分析技術現(xiàn)已成為廣泛應用的一種根據(jù)ssDNA構象差別快速靈敏 地檢測基因變異的方法。吳雪瓊等15建立的 PCR- SSCP 分支桿菌菌種初步鑒定 方法，利用16SrRNA123- 257位核苷酸（按大腸肝菌16SrRNA的編碼位置）是原核 生物高變區(qū)，通過PCR- SSCP方法分析了 70株結核分支桿菌復合群臨床分離株、 31 種分支桿菌標準株和 8 種非分支桿菌標準株, 除結核分支桿菌、牛分支桿菌和 BCG 之間及堪薩斯和胃分支桿菌之間電泳圖譜相似外， 其余各種分支桿菌之間電 泳圖均有顯著差異。該技術操作簡便、迅

12、速、經(jīng)濟， 避免同位素的危害， 有可能成 為一種快速有效的分支桿菌菌種初步鑒定方法。DNA-探針雜交技術人工合成寡核苷酸探針:主要用于 PCR 擴增產(chǎn)物的檢測。雜交方法常用斑 點雜交法、反向斑點或印跡( dot / blot) 雜交法及微板雜交法等。1993 年 Take waki 等16用斑點雜交法根據(jù)分支桿菌特異的 dnaj 基因序列制備了結核、鳥、胞 內、堪薩斯分支桿菌4種32P同位素標記的種特異性寡核苷酸探針，并同16種 分支桿菌 dnaj 基因 PCR 擴增產(chǎn)物進行雜交，能區(qū)別結核和非結核桿菌，將重要 的致病性非結核分支桿菌菌種， 鳥、胞內和堪薩斯分支桿菌鑒定至種的水平。1995 年

13、 Kox 等17根據(jù) 16SrRNA 高變區(qū)序列設計出一系列種特異性探針， 通過反向印跡 雜交試驗能將臨床標本中分支桿菌鑒定至種。1997 年 Patel 等18建立了 PCR- ELISA(PCR- enzyme-linked immunosorbent assay)微孔板雜交技術，將分支桿菌 16S rDNA 擴增產(chǎn)物在微孔板內與分支桿菌 16SrDNA 種特異性寡核苷酸捕捉探針 雜交， 對分支桿菌進行菌種鑒定， 35 株分支桿菌臨床分離株中， 34 株得到正確 鑒定。該方法操作簡便， 顯色反應類似于 ELISA， 適于臨床實驗室常規(guī)應用。全染色體 DNA 探針:結核分支桿菌全染色體 DN

14、A 具較高的靈敏度 (0. IngDNA)和特異性，與絕大多數(shù)分支桿菌不雜交，但與少數(shù)DNA同源性高的分支桿 菌如BCG(同源性100%)、牛分支桿菌同源性(100%)、堪薩斯分支桿菌(33%)、胞 內分支桿菌(50%)有較強的交叉雜交， 與鳥分支桿菌( 2%)、胃分支桿菌和龜分支 桿菌也有微弱雜交。此外， 全染色體 DNA 探針與分支桿菌限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)分析技術相結合可用于菌株鑒別。Shoemarker等曲利用該方法成功地鑒 定了 15株用限制性內切酶Mbol消化的結核分支桿菌臨床分離株DNA。吳雪瓊等 20報道結核分支桿菌全染色體DNA探針完全可以鑒別MT和NMT,也可以

15、鑒別結核 分支桿菌和絕大多數(shù)結核分支桿菌同源性低的其他分支桿菌， 但對同源性高的少 數(shù)分支桿菌無法鑒別。用全染色體 DNA 探針不能直接檢測未培養(yǎng)的臨床標本 ， 需篩選特異性DNA片段合成寡核苷酸探針，經(jīng)PCR擴增后方可檢出。反轉錄DNA探針(cDNA探針)：cDNA探針具有種特異性，敏感性高達99%, 特異性為99.2%。目前主要用于液相雜交,鑒定過程只需2h即可完成。cDNA探針 能鑒定的菌種有限，只能檢測培養(yǎng)基中的細菌，不能檢測臨床標本中的細菌，因此 限制了該探針的應用。參考文獻:.SoiniH, BotterE C, ViljanenM K. Identification of Myc

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