1、基因工程學(xué)原理 Genetic Engineering山東大學(xué)免疫學(xué)研究所 馬春紅三大重中之重高技術(shù)生物工程技術(shù)（BT)信息技術(shù)（IT）新材料技術(shù)（納米技術(shù)，NT）基因工程技術(shù)是生物工程技術(shù)的重要組成基因工程學(xué) 概論 Introduction主 要 內(nèi) 容第一部分 基因工程概述 基本概念 發(fā)展歷史 相關(guān)理論的復(fù)習(xí)第二部分 基因工程工具酶第三部分 基因工程的基本過程與策略第四部分 基因工程的發(fā)展與應(yīng)用 第一部分 基因工程概述 基本概念 發(fā)展歷史 相關(guān)理論的復(fù)習(xí)一、基本概念介紹什么是基因工程基因工程的基本原件載體和復(fù)制子基因工程的核心技術(shù)DNA重組 基因工程（genetic engineering

2、)：在基因水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法獲取特定基因（目的基因），在體外重組于載體DNA分子上，然后將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖（稱為“克隆” ），進(jìn)而行使正常功能（稱為“表達(dá) ” ），從而制備人類需要的基因、基因產(chǎn)物或創(chuàng)造出新的生物類型的分子生物學(xué)技術(shù)。 即：對攜帶遺傳信息的分子（DNA）進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造的分子工程，包括基因重組、克隆、表達(dá)；其核心是構(gòu)建重組體DNA的技術(shù)。 基因工程(genetic engineering)常和以下名稱混用:基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因操作(gene manipulation);重組DN

3、A技術(shù)(recombination DNA technique)基因工程是現(xiàn)代生物工程體系中的重要組成基因工程蛋白質(zhì)工程細(xì)胞（組織）工程酶工程發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程的概念 在利用基因工程技術(shù)了解編碼蛋白質(zhì)的基因的基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析;進(jìn)而通過對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列的改造和翻譯后的修飾等手段，改變甚至創(chuàng)造出新的和更有效的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程主要內(nèi)容主要目標(biāo) 蛋白質(zhì)氨基酸序列的分析 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)功能預(yù)測和分析 蛋白質(zhì)組分析細(xì)胞（組織）工程概念 利用工程學(xué)原理進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ),研究和制造使用活細(xì)胞的產(chǎn)品，包括組織工程和生物加工工程。組織工程：利用移植的細(xì)胞

4、、骨架、DNA、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段替代或修復(fù)已受傷或損壞的組織和器官生物加工工程： 利用活細(xì)胞生產(chǎn)生物醫(yī)藥產(chǎn)品。組織工程人造器官 干細(xì)胞：1999年4月， 美國的科研人員首次成功地從成年人骨髓的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)分化出軟骨、脂肪和骨骼細(xì)胞。標(biāo)志著干細(xì)胞的研究取得了重大進(jìn)展。以這項(xiàng)技術(shù)為代表的組織工程的突破具有廣闊的應(yīng)用前景，在不遠(yuǎn)的將來為實(shí)現(xiàn)人造“器官”成為可能。iPS細(xì)胞又稱誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞: 2007年11月日美科學(xué)家：利用人體皮膚細(xì)胞（OCT3/4, Sox2, c-Myc, Klf)-類胚胎干細(xì)胞2008年4月，美國加利福尼亞大學(xué)科學(xué)家：實(shí)驗(yàn)鼠皮膚細(xì)胞-iPS細(xì)胞-分化成心肌細(xì)胞、血管平

5、滑肌細(xì)胞及造血細(xì)胞。2009年3月，英國和加拿大科學(xué)家：不借助病毒、安全將普通皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞的方法2009年4月，美國科學(xué)家首次對遺傳疾病Fanconi 貧血癥患者皮膚細(xì)胞中的基因缺陷進(jìn)行了修補(bǔ)，進(jìn)而將這些組織轉(zhuǎn)化成了能扭轉(zhuǎn)疾患病情的干細(xì)胞，從而在基因重組過程中，制造出了無遺傳缺陷、功能強(qiáng)大的誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞），并再次定向誘導(dǎo)分化出糾正患者遺傳性貧血所需的健康血液細(xì)胞。2009年7月，中國上海和北京兩個科學(xué)團(tuán)隊(duì)分別利用iPS細(xì)胞克隆出活體實(shí)驗(yàn)鼠，首次證明iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞一樣具有全能性。酶工程的概念是酶學(xué)與工程學(xué)的相互滲透和結(jié)合所發(fā)展起來，以酶為研究對象，改造并應(yīng)用酶

6、的特異催化功能。目標(biāo)就是通過工程化技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化相應(yīng)原料成為有用物質(zhì)的技術(shù)。 酶工程的主要內(nèi)容酶的分離純化酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)及反應(yīng)器酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)酶分子化學(xué)修飾、遺傳突變及結(jié)構(gòu)改造酶抑制劑與激活劑開發(fā)與研究人工設(shè)計(jì)與合成模擬酶及酶分子發(fā)酵工程 發(fā)酵工程屬于生物技術(shù)的下游技術(shù)，是工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞、生產(chǎn)生物制品的一種技術(shù)。 傳統(tǒng)的發(fā)酵工程主要用于微生物?，F(xiàn)代生物技術(shù)還包括動物、植物細(xì)胞和工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。 現(xiàn)代生物工程技術(shù)蛋白質(zhì)工程細(xì)胞組織工程酶工程 發(fā)酵工程 基因工程根據(jù)目的及產(chǎn)物的不同，基因工程分為：基因克?。涸诨蛩缴?，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體

7、DNA分子上，并將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖?；虮磉_(dá)：在基因水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體DNA分子上，并將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞表達(dá)目的蛋白并行使正常功能?；蚬こ痰幕驹?目的基因、載體、受體細(xì)胞載體（Vector）： 能容忍外源DNA片段插入，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移并在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。 基因工程的核心技術(shù) DNA重組（recombination)： 不同來源的DNA片段共價連接、通過重新組合構(gòu)成了具有兩個DNA分子遺傳信息的新重組體DNA分子的過程。二、基因工程發(fā)展歷史基因工程三大理論基礎(chǔ)遺傳物質(zhì)的本質(zhì)、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)、基因傳遞原則

8、基因工程三大技術(shù)發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶等工具酶的發(fā)現(xiàn)、基因重組技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1、基因工程理論基礎(chǔ)三大理論發(fā)現(xiàn)（1）20世紀(jì)40年代：證明了遺傳物質(zhì)是DNA 1865年 的豌豆雜交試驗(yàn)20世紀(jì)20-30年代 確認(rèn)自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成 1944年 肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1952年和-se 用DNA35S和32P分別標(biāo)記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌（一） 基因工程的誕生 肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)有莢膜（S型）無莢膜（R型）非致病 基因工程理論基礎(chǔ)-2（2） 1953年Watson和Crick ：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（3） 19581971年：先后確立中心法則,破譯64種密碼

9、子，揭示了遺傳信息的流向和表達(dá)確定了遺傳信息的傳遞方式2、三大技術(shù)發(fā)現(xiàn)基因工程工具酶的發(fā)現(xiàn) 1967-1970年和等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶 連接酶的發(fā)現(xiàn) 基因工程載體與重組技術(shù) 1972年 Berg 首次實(shí)現(xiàn)基因重組(將SV40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功)-第一個重組DNA分子，1980年諾貝爾化學(xué)獎 基因工程核心技術(shù)：DNA的重組技術(shù)1970年 逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1973年，Cohen等獲得了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落TcrNer -標(biāo)志著基因工程的誕生。NerNerNer第一個轉(zhuǎn)化成功的重組DNA（二）基因工程的發(fā)展1976年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子s

10、omatostatin 14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中表達(dá)1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。 1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達(dá)成功1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因（HGH）重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素；1980年，美國/瑞士人，a干擾素基因；1984年，日本人，白細(xì)胞介素2（IL-2）；（三） 基因工程的騰飛1980年：顯微注射培育出第一個轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因小鼠， 1982年，美國Palmiter ，大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠-巨鼠1983年，美國，

11、農(nóng)桿菌介導(dǎo)培育出第一例轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因煙草1990年，美國，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SDID）1991年，美國倡導(dǎo)，人類基因組計(jì)劃109bp，15年時間30億USD；1997年，美國人，威爾英特克隆多利綿羊 三、相關(guān)理論復(fù)習(xí)DNA結(jié)構(gòu)與復(fù)制基因的相關(guān)概念基因組DNA分子組成： 堿 基 腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、 胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T) 脫氧核糖 磷 酸（一） DNA的結(jié)構(gòu)(A)腺嘌呤(G)鳥嘌呤(C)胞嘧啶(U) 尿嘧啶(T) 胸腺嘧啶DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替，彼此通過3/,5/-磷酸二酯鍵連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；4種堿基排列在內(nèi)側(cè)。DNA的結(jié)構(gòu)

12、.兩條脫氧核苷酸鏈成反向平行排列，.一條呈5 3方向.另一條呈3 5方向。.以堿基配對形成氫鍵而形成雙螺旋結(jié)構(gòu).遵循互補(bǔ)配對原則即： AT GC雙螺旋結(jié)構(gòu)(T) 胸腺嘧啶DNA的三種構(gòu)型： -超螺旋：共價閉環(huán)（CCC） -開環(huán)：單鏈缺口（OC） -線型：雙鏈斷裂（L）LC cccoc DNA的性能吸收光譜高峰為260nm 溴化乙啶（EB）嵌入DNA雙鏈配對堿基之間，紫外線照射，可顯示DNA位置在電場中的遷移率與分子量大小、構(gòu)象有關(guān)DNA變性：在物理或化學(xué)因素作用下，氫鍵斷裂成單鏈的過程DNA復(fù)性：變性因素去除后在適當(dāng)條件下恢復(fù) 成雙鏈的過程。 DNA變性(DNA Denature ) 指DNA

13、分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為單鏈線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，均可引起核酸分子變性。 解鏈溫度: Tm0.41(%G+C) （使一半螺旋結(jié)構(gòu)解體時的溫度） DNA復(fù)性 ( DNA Renature )是DNA變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性后的DNA一般 經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱之為退火(annealing)。最佳復(fù)性條件一般認(rèn)為是比Tm低25左右的溫度 復(fù)性時溫度下降必須緩慢 ，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4以下)，復(fù)性幾乎是不可能的，核酸實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。 復(fù)性RNADNADN

14、A的復(fù)制半保留復(fù)制 （semi-conservative replication） （二） 基因的概念 遺傳學(xué)概念： 基因: 是DNA分子中攜帶特定遺傳信息的最小功能單位，控制遺傳性狀 轉(zhuǎn)錄剪切翻譯分子生物學(xué)定義：編碼功能性蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列，負(fù)載特定的遺傳信息并在一定條件下調(diào)節(jié)、表達(dá)遺傳信息，指令蛋白質(zhì)合成。 翻譯復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)中心法則基因的功能分類結(jié)構(gòu)基因（structure gene)： 決定蛋白質(zhì)/多肽鏈或酶分子結(jié)構(gòu)的基因調(diào)控基因 (regulatory gene)： 調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)功能基因的一般特性半保留自我復(fù)制決定生物表型或性狀基因

15、突變 新的生物性狀（三）基因組（genome) p17概念：細(xì)胞或生物體的全套遺傳物質(zhì)常見基因組特點(diǎn)：病毒基因組原核生物基因組真核生物基因組人類基因組1. 病毒基因組基因組小，基因數(shù)少帶有重疊基因大部分為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因HBV基因組 2 原核生物基因與表達(dá)特點(diǎn) 細(xì)菌基因表達(dá)1） 基因組較小2） 基因是連續(xù)的3） 沒有轉(zhuǎn)錄后加工過程和翻譯后加工過程。4） 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)，可同時進(jìn)行。 2. 原核生物基因組細(xì)菌染色質(zhì)質(zhì)粒（plasmid）： 細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀閉合的雙鏈DNA?？勺灾鲝?fù)制編碼生物學(xué)形狀基因工程常用載體細(xì)菌質(zhì)粒示意真核生物基因組基因組龐大3109bp、染色質(zhì)、染色體

16、.基因不連續(xù)性 斷裂基因、內(nèi)含子、外顯子（大部分基因含有內(nèi)含子）含有大量重復(fù)序列 非編碼區(qū)域多于編碼區(qū)域 非編碼區(qū)較多 ； 多于編碼序列(9:1）轉(zhuǎn)錄和翻譯不偶聯(lián)人類基因組細(xì)胞核基因組（nucleolus genome)線粒體基因組(mitochondrial genome) 細(xì)胞核基因組 人類單倍體基因組 9 bp ，編碼1.5X 106 種蛋白結(jié)構(gòu)基因僅約3萬個，占總基因組的2-3%.多為單基因序列(60-65% ，如編碼蛋白或酶的基因)， 其他為基因間的間隔序列、插入序列、重復(fù)序列。基因家族：來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的基因，如 HLA system A-C-B-D-DR-DQ-DP基因側(cè)翼的短序列：啟動子、增強(qiáng)