1、食品微生物實(shí)驗(yàn)室 常用儀器及用途潔凈工作臺(tái)（超凈工作臺(tái)、無(wú)菌臺(tái)）是一種供人操作的通用型局部?jī)艋O(shè)備，通過風(fēng)機(jī)將空氣吸入，經(jīng)由靜壓箱通過高效過濾器過濾，將過濾后的潔凈空氣以垂直或水平氣流的狀態(tài)送出，使操作區(qū)域持續(xù)在潔凈空氣的控制下達(dá)到百級(jí)潔凈度它可造就局部高清潔度空氣環(huán)境。生物安全柜 是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，用來(lái)保護(hù)操作者本人、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計(jì)的。高壓滅菌鍋烘箱水浴鍋顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡顯微鏡被用來(lái)放大微小物體的圖像。一般應(yīng)用于對(duì)生物、醫(yī)藥、微觀粒子等觀測(cè)。pH計(jì)離心機(jī)PCR儀原理：

2、采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食品中是否有致病菌；靈敏度：對(duì)目標(biāo)菌檢測(cè)靈敏度為1個(gè)/g效率：檢測(cè)過程用時(shí)2-4H主要耗材：各菌種試劑盒食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)主要內(nèi)容1.微生物檢測(cè)作業(yè)規(guī)范2.微生物檢驗(yàn)流程3.常見衛(wèi)生指標(biāo)及致病菌4.測(cè)定微生物的大小5.測(cè)定微生物的數(shù)量6.菌落總數(shù)的測(cè)定7.大腸菌群的測(cè)定8.生產(chǎn)環(huán)境檢測(cè)一、在執(zhí)行無(wú)菌操作時(shí)，必須明確物品的無(wú)菌區(qū)和非無(wú)菌區(qū)。 二、執(zhí)行無(wú)菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。 三、夾取無(wú)菌物品，必須使用無(wú)菌持物鉗。 四、進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無(wú)菌物品或超過無(wú)菌區(qū)取物。 五、在操作前2030分鐘要先啟動(dòng)超

3、凈臺(tái)和紫外燈，并認(rèn)真洗手和消毒。在操作時(shí)，嚴(yán)禁喧嘩，嚴(yán)禁用手直接拿無(wú)菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等。傾倒平板應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時(shí)需反復(fù)用酒精燈燒。對(duì)于吸管應(yīng)先用手拿后1/3處，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。無(wú)菌操作原則1、液體樣品采樣方法 充分混勻后，無(wú)菌操作打開包裝，用100mL無(wú)菌注射器抽取,注入無(wú)菌盛樣容器.2、半固體樣品采樣方法無(wú)菌操作打開包裝，用無(wú)菌勺子從幾個(gè)部位挖取樣品，放入無(wú)菌容器。 3、固體樣品采樣方法大塊整體食品用無(wú)菌刀具和鑷子從不同的部位割取，并注意其代表性；小塊大包裝食品應(yīng)從不同部位的小塊上切取樣品，放入無(wú)菌容器。若為檢驗(yàn)食品的污染情況，可取

4、表層樣品；若為檢驗(yàn)食品品質(zhì)的情況，應(yīng)從深部取樣。 常見衛(wèi)生指標(biāo)及致病菌細(xì)菌總數(shù)大腸菌群霉菌和酵母菌大腸桿菌（肉制品）沙門氏菌（禽、畜肉）副溶血性弧菌（水產(chǎn)品）金黃色葡萄球菌（剩飯）單增李斯特氏菌（乳制品、冷藏食品）肉毒梭菌（發(fā)酵制品、肉制品）菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序25g(ml)樣品+225ml生理鹽水（0.85%）(1:10的稀釋液)作幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液(例如1:100，1:1000)選擇23個(gè)適宜稀釋度各取1ml分別加入滅菌培養(yǎng)皿中平皿中加1520ml 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（46），于361培養(yǎng)48h 菌落記數(shù)/報(bào)告GB 4789.2-2010（1）以無(wú)菌操作，將樣品25g（或25mL）剪碎以后，放于含有

5、225mL滅菌生理鹽水三角瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖做成1：10的均勻稀釋液。固體樣品在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000r/min-100000r/min的速度處理1min，做成1：10的均勻稀釋液。 （2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。（3）另取1mL的滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。 樣品稀釋及培養(yǎng)1樣品稀釋程序流程圖菌落計(jì)算方法可用肉眼觀查，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落

6、數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（CFU)表示。報(bào) 告平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間,無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板作為菌落總數(shù)。300的記錄多不可計(jì)；每個(gè)稀釋度應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)； 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)； 平皿內(nèi)如有菌落之間無(wú)明顯界線，可視為一個(gè)菌落數(shù)；報(bào)告菌落總數(shù)計(jì)算方法 若只有一個(gè)稀釋度菌落在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算平均值*稀釋倍數(shù)作為結(jié)果；若兩個(gè)連續(xù)稀釋度的菌落都在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)按公式計(jì)算： 報(bào)告 若所有稀釋度平均菌落

7、數(shù)均300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均300或30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。報(bào)告菌落數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)100內(nèi)時(shí)，按四舍五入修約，以整數(shù)報(bào)告，100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，第三位數(shù)以四舍五入方法修約；取前兩位數(shù)字，后面用0代替，也可用10的指數(shù)表示； 若平板上為蔓延菌落無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延； 若空白上長(zhǎng)菌，則實(shí)驗(yàn)失?。?稱重以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/ml為單位報(bào)告。報(bào)告2食品中大腸菌群的測(cè)定大腸菌群的定義:大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語(yǔ)，它不代表某一個(gè)

8、或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在3724 h能分解乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。 國(guó)標(biāo)法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。361培養(yǎng)242h，觀察是否產(chǎn)氣。 分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，361培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。 證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革

9、蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管361培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。 報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。 三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1、采樣及稀釋以無(wú)菌操作將檢樣25g（或25ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無(wú)菌均質(zhì)器，以8000r/min10000r/min的速度處理1min，做成1：10的稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，

10、換用1支1ml滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。2. 乳糖初發(fā)酵試驗(yàn) 即通常所說(shuō)的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無(wú)發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管，置（361）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)（242）h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行3.分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上，置（361）0C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h 24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。4.乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 即通常所說(shuō)的證實(shí)試驗(yàn)，其目的在于證明從乳糖初酵管試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。 在上述的選擇性培養(yǎng)基上，挑取可疑大腸菌群1 2