中東呼吸綜合征冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測王文玲中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所應(yīng)急技術(shù)中心2015年6月9日參考標(biāo)準(zhǔn)中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)指南WHO:Laboratory

TestingforMiddleEastRespiratorySyndrome

Coronavirus：interim

recommendations(revised)

.(September

2014

）USCDC：InterimGuidelinesforCollecting,Handling,andTestingClinicalSpecimensfromPatientsUnderInvestigation(PUIs)forMiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus(MERS-CoV)-Version2MERS-CoV感染標(biāo)本采集對象中東呼吸綜合征冠狀病毒感染疑似病例、臨床診斷病例及需要進(jìn)一步研究的確診病例；其它需要進(jìn)行MERS-CoV感染診斷或鑒別診斷者。標(biāo)本采集要求從事MERS-CoV檢測標(biāo)本采集的技術(shù)人員應(yīng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，培訓(xùn)合格且具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能。在標(biāo)本采集過程中，采樣人員進(jìn)行安全防護(hù)。住院病例的標(biāo)本由所在醫(yī)院醫(yī)護(hù)人員在當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)專業(yè)人員指導(dǎo)下采集。密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)丶部貦C(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)采集。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測工作的需要，結(jié)合病程再次采樣。標(biāo)本的保存樣品采集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程需合理。若呼吸道樣品72小時以上才能到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，強(qiáng)烈推薦將樣品儲存在-80℃并使用干冰進(jìn)行運(yùn)輸，應(yīng)避免樣品反復(fù)凍融。從全血分離的血清應(yīng)4℃儲存并運(yùn)輸，或用干冰、液氮冷凍并運(yùn)輸。由于無霜冰柜溫度波動較大，應(yīng)避免使用無霜冰柜儲存呼吸道和血清樣品。院內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)時，標(biāo)本應(yīng)該放置在耐用、防滲透的二級容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。為減少任何標(biāo)本破、漏的風(fēng)險(xiǎn)，不要使用任何氣動傳輸系統(tǒng)來轉(zhuǎn)運(yùn)任何可能疑似患者標(biāo)本。轉(zhuǎn)運(yùn)至CDC的MERS-CoV標(biāo)本應(yīng)該充分包裹，轉(zhuǎn)運(yùn)時不能開蓋或分裝標(biāo)本。標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)應(yīng)該符合三重包裝系統(tǒng)要求：內(nèi)層是主要的容器（一個可密封的標(biāo)本袋纏繞以可吸收材料），第二層是防水、防滲漏的容器，外層是用于轉(zhuǎn)運(yùn)的包裝。MERS-CoV感染標(biāo)本包裝和運(yùn)輸MERS-CoV的實(shí)驗(yàn)室檢測靶標(biāo)目前病毒核酸的檢測方法主要有：檢測E蛋白上游基因（upE）、ORF1b、ORF1a

、N2基因四種。這些方法均高度敏感，推薦upE檢測用于初篩;檢測ORF1b基因的方法不如針對ORF1a的方法敏感，但比其更加特異;N2基因檢測具有較高的靈敏性。另外，已確定了中東呼吸綜合征冠狀病毒基因組中位于RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）和衣殼蛋白（N）基因的幾個適合測序驗(yàn)證的靶序列。巢式PCR普通PCRPCR產(chǎn)物電泳或測序逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA核酸提取標(biāo)本采集PCR檢測熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方案繼續(xù)采樣，如有必要應(yīng)送樣至有MERS-CoV檢測經(jīng)驗(yàn)的參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測入選病例rRT-PCRupE基因進(jìn)行篩查實(shí)驗(yàn)陽性陰性rRT-PCRORF1a、ORF1b或N基因區(qū)進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)陰性，但如果臨床和流行病學(xué)證據(jù)充分，繼續(xù)采樣重復(fù)檢測陰性陽性RdRp或N區(qū)測序?qū)嶒?yàn)陰性顯示為其他序列顯示MERS-CoV確診病例確診病例upEupE-Fwd5'-GCAACGCGCGATTCAGTT-3'upE-Rev5'-GCCTCTACACGGGACCCATA-3'upE-Prb5'FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA3'ORF1bORF1b-Fwd5'-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3'ORF1b-Rev

5'-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3'ORF1b-Prb5'FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA3'ORF1aORF1a-Fwd 5'-CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3'ORF1a-Rev 5'-CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3'ORF1a-Prb5'FAM-TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA3'N2N2-Fwd 5'-GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3'N2-Rev

5'-TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3'N2-Prb5'FAM-ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3'分子檢測引物與探針熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果判斷陰性:無Ct值或Ct為40。陽性：Ct值<37,可報(bào)告為陽性。Ct值在37-40之間的樣本建議重做,若重做結(jié)果Ct值<37，該樣本判斷為陽性,否則為陰性。MERS-CoV核酸檢測結(jié)果報(bào)告在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個樣本為陽性，需要滿足以下兩個條件的其中一個：至少兩種MERS-CoV特異性PCR結(jié)果陽性；一種PCR結(jié)果為陽性，另外一種PCR產(chǎn)物序列測序，與MERS-CoV序列相符。當(dāng)針對MERS-CoV的兩種不同的檢測方法結(jié)果不一致的時候，應(yīng)當(dāng)采用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序以確認(rèn)檢測結(jié)果。檢測結(jié)果判讀陰性結(jié)果也不能排除臨床病人的感染，一些因素可能產(chǎn)生假陰性，包括：樣本質(zhì)量差，比如口咽等部位的呼吸道樣本；樣本收集的過早或過晚；沒有正確的保存、運(yùn)輸和處理樣本；技術(shù)本身存在的原因，如病毒變異，PCR抑制等。當(dāng)PCR檢測結(jié)果為陰性，但臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特點(diǎn)提示是MERS-CoV感染時，可采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測。雙份血清標(biāo)本能夠滿足血清學(xué)檢測的要求。我國首例輸入性中東呼吸綜合征病例的

實(shí)驗(yàn)室快速確診2015年5月27日晚10時世界衛(wèi)生組織向中國衛(wèi)生計(jì)生委通報(bào)，韓國1例確診中東呼吸綜合征（MERS）病例的密切接觸者經(jīng)香港入境廣東省惠州市。5月28日下午，經(jīng)廣東省疾控中心對病例標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，初篩結(jié)果為陽性。樣本接收時間：2015.5.29日凌晨1點(diǎn)40分（中國疾控中心病毒病所）實(shí)驗(yàn)室確診結(jié)果上報(bào)：2015.5.29日凌晨5點(diǎn)40分疑似MERS-CoV感染的實(shí)驗(yàn)室快速確診樣本來源：KIMMYEONGSHIK(韓國）廣東省惠州市樣本類型：鼻咽拭子(3份）血清(1份）采樣日期：2015.5.28實(shí)驗(yàn)室復(fù)核檢測流程：BSL-3實(shí)驗(yàn)室：分裝滅活BSL-2實(shí)驗(yàn)室：核酸提取熒光定量RT-PCR(三個靶標(biāo)UpE、ORF1b和N2)

結(jié)果判定與報(bào)告

廣東省CDC疑似MERS-CoV感染的復(fù)核檢測UpE檢測擴(kuò)增曲線ORF1b檢測擴(kuò)增曲線N2檢測擴(kuò)增曲線結(jié)論采用upE/ORF1b/N2三個靶標(biāo)，進(jìn)行三種熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，在對照成立的基礎(chǔ)上，三管咽拭子樣本檢測結(jié)果皆為陽性?；贜2靶標(biāo)的熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，血清標(biāo)本呈弱陽性。結(jié)論：廣東疑似MERS-CoV病人實(shí)驗(yàn)室檢測確定為MERS-CoV感染陽性。上海輝瑞合作研發(fā)試劑盒（單管雙靶標(biāo)）應(yīng)用驗(yàn)證MERS-CoVRNA雙色檢測試劑盒ORF1b/upE（FAM/VIC）1342樣品編號CT值1陽性對照22.582咽拭子樣本36.35樣品編號CT值3陽性對照22.544咽拭子樣本33.17RT-PCR擴(kuò)增RdRp或N基因后測序檢測MERS-CoVRdRpSeqassay:EMC-SeqRdRP-Rev:GCATWGCNCWGTCACACTTAGGEMC-SeqRdRP-Fwd:TGCTATWAGTGCTAAGAATAGRGCEMC-SeqRdRP-Rnest:CACTTAGGRTARTCCCAWCCCAW=A/T,N=A/C/T/G,R=A/GFragmentsize:firstround:242bp(includingprimers),secondround228bp(includingprimers)Nseqassay:EMC-SeqN-Fwd:CCTTCGGTACAGTGGAGCCAEMC-SeqN-Rev:GATGGGGTTGCCAAACACAAACEMC-SeqN-Fnest:TGACCCAAAGAATCCCAACTACFragmentsize:firstround:306-312bp(includingprimers),secondround279-285bp(includingprimers)Reference:Corman/Mülleretal.;Eurosurveillance,Volume17,Issue49,06December2012通用引物檢測冠狀病毒冠狀病毒通用引物RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳One-stepRT-PCRassays(OneStepRT-PCRkit；QIAGEN)

反應(yīng)條件：1.反轉(zhuǎn)錄:50℃for30min2.PCR擴(kuò)增:95℃

for15min(激活)，50cycles(30secat94℃；30secat48℃；1minat72℃

)，最后延伸72℃

for10min。引物對序列：Cor-FW(5'-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3')

Cor-RV(5'-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3‘)IFA抗原片檢測MERS-CoV特異抗體中和抗體檢測利用MERS-CoV假病毒體系進(jìn)行中和抗體檢測，實(shí)驗(yàn)操作簡單而不受BSL-3實(shí)驗(yàn)室的限制（VirologyJournal.2013;10(1):266)。中國CDC目前實(shí)驗(yàn)室檢測

相關(guān)技術(shù)儲備與培訓(xùn)已引進(jìn)MERS-CoV病毒