染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)1目錄簡介技術(shù)原理技術(shù)流程應用優(yōu)缺點目錄簡介技術(shù)原理技術(shù)流程應用優(yōu)缺點2一、簡介DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNaseⅠ足紋法電泳遷移率變動分析生物信息學方法酵母單雜交系統(tǒng)ChIP一、簡介DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNaseⅠ足紋法電泳遷3一、簡介ChIP

是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達關(guān)系。一、簡介ChIP4二、原理在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)—DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合物，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。二、原理在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)—DNA復合物，5三、技術(shù)流程

具體操作流程DNA分析三、技術(shù)流程具體操作流程DNA分析61、甲醛交聯(lián)細胞具體步驟10ml1×PBS孵育8min棄上清4-5ml預冷1×PBS預冷1×PBS洗滌兩次轉(zhuǎn)移4000rpm離心5min棄上清1ml預冷1×PBS懸浮新離心管4000rpm離心5min1ml1.25mol/L甘氨酸室溫10-20min1、甲醛交聯(lián)細胞具10ml1×PBS孵育8min棄上清4-72、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min.每1min顛倒搖動一次離心管。2.把DNA粉碎為長度200-1000bp，置于冰上。不同樣本都進行超聲條件優(yōu)化實驗。3.14000rpm離心10min（4℃），轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管。2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10m83.免疫沉淀蛋白和DNA復合物超聲染色質(zhì)液體2ml超聲稀釋液4℃搖床搖動一小時1000rmp離心2min（4℃）轉(zhuǎn)移上清液至新離心管ChIP稀釋液稀釋10倍加入20μl蛋白A/G瓊脂糖珠1-4μl免疫沉淀抗體取50μl上清液作為對照？？3.免疫沉淀蛋白和DNA復合物超聲染色質(zhì)液體2ml超聲稀釋液94、收獲免疫復合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）樣品搖動1-2h，4℃40μlProteinA/GAgaroseBeads1×PBS洗3次離心1000rpm,1min.棄上清，用4μl1×PBS懸浮1000rpm,離心5min,4℃a低鹽洗脫溶液1ml洗一次b高鹽洗脫溶液1ml洗一次c氯化鋰洗脫溶液1ml洗一次dTE溶液(pH8.0)1ml洗兩次每次洗時，在搖床上搖10min,4℃，4000rpm離心5min棄上清4、收獲免疫復合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）樣品搖動1-2h，105、洗脫免疫復合物Beads200μlChIP洗脫溶液洗脫搖床上搖動10min12000rpm離心1min取上清Beads取上清200μl,ChIP洗脫溶液(3次)600μl洗脫液5、洗脫免疫復合物Beads200μlChIP洗脫溶液洗脫搖116、去除甲醛交聯(lián)①加5mlNaCl使用NaCl終濃度為0.2mol/l②陰性對照+350μlChIP洗脫溶液+16μl

5mol/lNaCl。③65℃,過夜,去交聯(lián)。6、去除甲醛交聯(lián)①加5mlNaCl使用NaCl終濃度為0.2127、DNA純化①酚/氯仿抽提實驗樣本(600μl)50μl陰性對照10μlRNase√√50μl蛋白酶K√√等量酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）√√12000rmp離心5min上清液上清液1/10體積3mol/l乙酸鈉√√2倍體積冰凍無水乙醇√√-80℃冰箱1h.12000rmp離心20min，棄上清加入70%乙醇，懸浮沉淀，12000rpm離心10min，去上清，DNA干燥后，40μlTE溶解②硅膠柱純化7、DNA純化①酚/氯仿抽提實驗樣本(600μl)50μl陰138、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的鑒定(1)如果目的蛋白靶序列已知，或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列，則可選用定量或者半定量PCR方法。(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，則可采用ChIP克隆測序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。8、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的14四、應用組蛋白修飾研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析藥物開發(fā)研究有絲分裂研究DNA損傷與凋亡分析四、應用組蛋白修飾研究15五、優(yōu)缺點優(yōu)點：充分反映生理條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實情況，可以找出生理條件下某個DNA結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合位點，從而反映體內(nèi)基因表達調(diào)控的真實情況。缺點：需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體，有時難以獲得；為了獲得高等豐度的結(jié)合片段，必須實驗演示胞內(nèi)條件下靶標蛋白質(zhì)的表達情況；調(diào)控蛋白質(zhì)的基因獲取可能需要限制在組織來源。五、優(yōu)缺點優(yōu)點：充分反映生理條件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真16謝謝大家！謝謝大家！17謝謝觀看！2020

謝謝觀看！18染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)19目錄簡介技術(shù)原理技術(shù)流程應用優(yōu)缺點目錄簡介技術(shù)原理技術(shù)流程應用優(yōu)缺點20一、簡介DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNaseⅠ足紋法電泳遷移率變動分析生物信息學方法酵母單雜交系統(tǒng)ChIP一、簡介DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNaseⅠ足紋法電泳遷21一、簡介ChIP

是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達關(guān)系。一、簡介ChIP22二、原理在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)—DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合物，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。二、原理在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)—DNA復合物，23三、技術(shù)流程

具體操作流程DNA分析三、技術(shù)流程具體操作流程DNA分析241、甲醛交聯(lián)細胞具體步驟10ml1×PBS孵育8min棄上清4-5ml預冷1×PBS預冷1×PBS洗滌兩次轉(zhuǎn)移4000rpm離心5min棄上清1ml預冷1×PBS懸浮新離心管4000rpm離心5min1ml1.25mol/L甘氨酸室溫10-20min1、甲醛交聯(lián)細胞具10ml1×PBS孵育8min棄上清4-252、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min.每1min顛倒搖動一次離心管。2.把DNA粉碎為長度200-1000bp，置于冰上。不同樣本都進行超聲條件優(yōu)化實驗。3.14000rpm離心10min（4℃），轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管。2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10m263.免疫沉淀蛋白和DNA復合物超聲染色質(zhì)液體2ml超聲稀釋液4℃搖床搖動一小時1000rmp離心2min（4℃）轉(zhuǎn)移上清液至新離心管ChIP稀釋液稀釋10倍加入20μl蛋白A/G瓊脂糖珠1-4μl免疫沉淀抗體取50μl上清液作為對照？？3.免疫沉淀蛋白和DNA復合物超聲染色質(zhì)液體2ml超聲稀釋液274、收獲免疫復合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）樣品搖動1-2h，4℃40μlProteinA/GAgaroseBeads1×PBS洗3次離心1000rpm,1min.棄上清，用4μl1×PBS懸浮1000rpm,離心5min,4℃a低鹽洗脫溶液1ml洗一次b高鹽洗脫溶液1ml洗一次c氯化鋰洗脫溶液1ml洗一次dTE溶液(pH8.0)1ml洗兩次每次洗時，在搖床上搖10min,4℃，4000rpm離心5min棄上清4、收獲免疫復合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）樣品搖動1-2h，285、洗脫免疫復合物Beads200μlChIP洗脫溶液洗脫搖床上搖動10min12000rpm離心1min取上清Beads取上清200μl,ChIP洗脫溶液(3次)600μl洗脫液5、洗脫免疫復合物Beads200μlChIP洗脫溶液洗脫搖296、去除甲醛交聯(lián)①加5mlNaCl使用NaCl終濃度為0.2mol/l②陰性對照+350μlChIP洗脫溶液+16μl

5mol/lNaCl。③65℃,過夜,去交聯(lián)。6、去除甲醛交聯(lián)①加5mlNaCl使用NaCl終濃度為0.2307、DNA純化①酚/氯仿抽提實驗樣本(600μl)50μl陰性對照10μlRNase√√50μl蛋白酶K√√等量酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）√√12000rmp離心5min上清液上清液1/10體積3mol/l乙酸鈉√√2倍體積冰凍無水乙醇√√-80℃冰箱1h.12000rmp離心20min，棄上清加入70%乙醇，懸浮沉淀，12000rpm離心10min，去上清，DNA干燥后，40μlTE溶解②硅膠柱純化7、DNA純化①酚/氯仿抽提實驗樣本(600μl)50μl陰318、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的鑒定(1)如果目的蛋白靶序列已知，或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列，則可選用定量或者半定量PCR方法。(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，則可采用ChIP克隆測序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。8、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點的32四、應用組蛋白修飾研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析藥物開發(fā)研究有絲分裂研究DNA損傷與凋亡分析四、應用組蛋白修飾研究33