薄層色譜分析法的應(yīng)用和發(fā)展一、薄層色譜分析在層析分離過(guò)程中的應(yīng)用生物技術(shù)、新型材料技術(shù)、信息技術(shù)是當(dāng)今科技發(fā)展的前沿，在某種程度上甚至可以代表一個(gè)國(guó)家的科學(xué)技術(shù)發(fā)展水平。層析分離過(guò)程是生化產(chǎn)物分離和純化的重要手段之一，作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的“下游技術(shù)”往往成為技術(shù)和經(jīng)濟(jì)的關(guān)鍵，直接關(guān)系到產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，其成本經(jīng)常占到總成本的60%?90%[2]。因此，層析分離過(guò)程的優(yōu)化和控制就顯得十分重要。薄層色譜分析方法，因其具有分析迅速快、成本低廉、可現(xiàn)場(chǎng)操作等特點(diǎn)在層析分離過(guò)程中不可缺少。薄層色譜分析的優(yōu)越性薄層色譜分析方法和高效液相色譜分析方法均遵循層析分離的基本原理，因此，層析分離過(guò)程的中間控制性分析和分離后的最終產(chǎn)物的檢驗(yàn)，用上述兩種分析方法是非常適合的。高效液相色譜分析方法的精度高、分離效能高、選擇性高、檢測(cè)器靈敏度高，比較適合最終產(chǎn)物的檢驗(yàn)。雖然高效液相色譜也可用于中控分析，但是分析檢驗(yàn)的成本非常高，需要設(shè)置專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行分析操作。由于樣品在分析前需要預(yù)處理，得到分析結(jié)果的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，對(duì)于層析過(guò)程的中間控制就顯得不夠及時(shí)，同時(shí)過(guò)高的分析精度也沒(méi)有必要。薄層色譜分析方法在對(duì)層析分離過(guò)程控制性分析中就顯示出了很高的優(yōu)越性。薄層色譜片的制作和分析操作用于層析分離過(guò)程的中間控制性分析的薄層色譜片可以在專(zhuān)業(yè)試劑商店買(mǎi)到，如果在實(shí)驗(yàn)室自己制備則可節(jié)約80%的成本，同時(shí)可以根據(jù)分析的實(shí)際需要靈活地調(diào)整固定相薄層的配方。固定相通常用GF254硅膠和一定比例的纖維素配合而成。將固定相的漿料均勻地涂布在毛玻璃片上，經(jīng)烘干活化后即可使用。每片薄層可以分析多個(gè)樣品，重復(fù)使用幾次。經(jīng)毛細(xì)管點(diǎn)樣、在層析缸用展開(kāi)劑展開(kāi)后，在紫外分析儀上可觀察到非常清晰的分析結(jié)果，一次分析過(guò)程基本可控制在10min左右，現(xiàn)場(chǎng)操作人員經(jīng)短時(shí)間的培訓(xùn)就可掌握。薄層色譜分析對(duì)層析分離過(guò)程的優(yōu)化應(yīng)用薄層色譜進(jìn)行層析中間控制分析，選用展開(kāi)劑和確定不同展開(kāi)劑的比例是薄層分析的關(guān)鍵。展開(kāi)劑的確定一般需要以下幾個(gè)前提條件：層析前的樣品要經(jīng)過(guò)高效液相色譜分析，獲得較高的分離度。確定樣品中各組份的組成，明確層析分離要得到的主產(chǎn)物。層析分離過(guò)程的操作方法及洗脫劑的配比要基本確定，各組份的洗脫次序要明確。層析分離要得到主產(chǎn)物的純度要規(guī)定一個(gè)在工藝上比較合理的范圍(關(guān)系到最終的收率和產(chǎn)品質(zhì)量)。（5）層析分離后的主產(chǎn)物和副產(chǎn)物要經(jīng)過(guò)高效液相色譜分析，確定產(chǎn)物的含量。其中（1）和（2）通常也是必不可少的工藝條件，可以和薄層色譜分析結(jié)果相互印證。在上述前提條件具備后，可以根據(jù)樣品的理化性質(zhì)，選用幾組常用的展開(kāi)劑，分別用層析前和層析后的樣品進(jìn)行試驗(yàn)。選定一組分離效果較好的再進(jìn)行微調(diào)，以圍繞主產(chǎn)物能獲得一個(gè)較好的分離度為準(zhǔn)。所獲得的分離度并非越高越好，因?yàn)橥ǔＧ闆r下最初確定的層析分離過(guò)程本身為薄層分析提供了足夠的時(shí)間和組份之間的空間。我們利用薄層分析方法對(duì)層析過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控的另一個(gè)很重要的一個(gè)目的在于，減少這種時(shí)間和空間，從而縮短層析分離過(guò)程的時(shí)間、降低洗脫劑的用量，擴(kuò)大最終產(chǎn)品的利用空間。薄層分析的這種作用在產(chǎn)品試制和工藝放大過(guò)程中是非常顯著。例如：用硅膠層析柱（①40X400）分離一種新型高效生物農(nóng)藥（各組份分子量在800?1000之間）小試產(chǎn)品時(shí)，用自制的薄層片對(duì)層析過(guò)程進(jìn)行控制性分析，并進(jìn)一步優(yōu)化層析過(guò)程。最終使層析時(shí)間縮短了20%，洗脫溶劑乙醇、乙酸乙酯的用量分別減少了10%和15%。層析分離過(guò)程中應(yīng)注意的問(wèn)題層析分離操作中，層析柱制備好后一般都要多次使用，層析柱的承載能力和分離效能是逐漸下降的。在層析操作方法和薄層分析方法確定下來(lái)后，要注意分析頻次只能做一個(gè)基本的規(guī)定。因?yàn)橥慌苽涞膶游鲋?，在使用過(guò)程中分離能力的衰減速度往往是不同的，不排除某一個(gè)柱子突然失效的可能。所以在薄層分析中要注意這一點(diǎn)，根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整分析頻次，工藝人員也要有相應(yīng)的預(yù)案。薄層分析結(jié)果與高效液相色譜分析結(jié)果對(duì)照時(shí)，要注意兩種方法所采用固定相的差異，確定好各組份的次序。結(jié)論薄層色譜分析方法對(duì)層析分離過(guò)程的控制性分析和優(yōu)化作用是十分顯著的。近年來(lái)，隨著生物制品的研制和中藥制劑的開(kāi)發(fā)，薄層色譜分析方法作為一種快速、高效、簡(jiǎn)便、低成本的分析方法，將有更加廣闊的應(yīng)用前景。二、薄層色譜分析法在藥物分析中應(yīng)用進(jìn)展薄層色譜法（TLC）是將供試品溶液點(diǎn)樣于薄層板上，經(jīng)展開(kāi)，檢視所得的色譜圖與適宜的對(duì)照物按同法所得的色譜圖對(duì)比，用于藥品的鑒別或雜質(zhì)檢查的方法。TLC是一種快速、靈敏、高效地分離微量物質(zhì)的方法，是最簡(jiǎn)單的色譜技術(shù)之一，具有操作方便、備簡(jiǎn)單、離效率高、屬性好、分析速度快、色譜參數(shù)易調(diào)整等特點(diǎn)，在藥物分析中應(yīng)用廣泛。1藥品真?zhèn)舞b別1.1化學(xué)藥品及其復(fù)方制劑阿片中含生物堿20余種，其含量差異較大。徐明琴等［1］將TLC用于阿片類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)。以硅膠為吸附劑，為展開(kāi)劑，顯色方法為254nm紫外燈、碘化鉀試劑、酸性碘鉑酸鉀試劑、蒸氣等。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)谋影濉㈤_(kāi)劑、色劑，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品比較比移值（Rf）和斑點(diǎn)大小，可初步確定阿片類(lèi)藥物的種類(lèi)。復(fù)方降壓膠囊中，組成成分近10種，董海彥［2］以TLC同時(shí)鑒別處方中利血平、利眠寧和鹽酸異丙嗪3種成分，取3種對(duì)照品及供試品制成溶液，分別點(diǎn)于硅膠GF254板上，以苯-丙酮（3:2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾干，置254nm紫外光燈下檢視，供試品與對(duì)照品3個(gè)斑點(diǎn)位置一致，Rf值適中，斑點(diǎn)明顯。薄層色譜中展開(kāi)劑應(yīng)盡量不使用毒性很大的溶劑。苯毒性較大，有致癌作用，除了必要情況下，盡量用其它溶劑代替。此方法展開(kāi)劑中的苯，如能以其它溶劑替代則更好。錢(qián)麗華等［3］采用薄層色譜法在同一薄層板上對(duì)抗結(jié)核類(lèi)藥物中的4種主要成分利福平、異煙肼、鹽酸乙胺丁醇、毗嗪酰胺進(jìn)行快速分離鑒別。使用硅膠GF254板，以甲醇-水-濃氨水（30:1:0.3）為展開(kāi)劑，點(diǎn)樣量為2Ml,展開(kāi)晾十后，先在紫外燈（254nm）下檢視，可見(jiàn)利福平、煙肼、嗪酰胺3個(gè)斑點(diǎn)，再進(jìn)行碘熏蒸，可見(jiàn)利福平、異煙肼、鹽酸乙胺丁醇3個(gè)斑點(diǎn)，Rf值適中，分離效果和重現(xiàn)性好。呂長(zhǎng)淮、阿利等對(duì)氨咖黃敏膠囊TLC鑒別方法進(jìn)行改進(jìn)，分別通過(guò)改變展開(kāi)劑配比、取樣量及色譜條件。使原標(biāo)準(zhǔn)中未檢出的成分得以檢出。1.2抗生素及其制劑麥迪霉素片原標(biāo)準(zhǔn)TLC操作上受溫度影響較大，所需硅膠H板較為特殊，顯色劑配置繁瑣。陳慶坤通過(guò)試驗(yàn)，該吸附劑為硅膠GF254,在室溫下展開(kāi)即可，樣品展開(kāi)后，置紫外光燈254nm下檢視，供試液所顯斑點(diǎn)的位置與顏色和對(duì)照液所顯斑點(diǎn)相同，Rf值為0.5,斑點(diǎn)清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象，靈敏度高，分離效果好。金建平通過(guò)采用乙醚溶液四環(huán)素眼膏和眼膏基質(zhì)，鹽酸提取的方法處理樣品，將對(duì)照品和樣品制成適宜溶液，分別點(diǎn)于同一硅藻土G板上，以5%乙二胺四醋酸二鈉溶液5ml與醋酸乙酯-氯仿-丙酮（2:2:1）200ml的混合液為展開(kāi)劑。展開(kāi)后，熱空氣中干燥，氨蒸汽熏，置紫外燈365nm下檢視。結(jié)果，供試液所顯斑點(diǎn)的顏色和位置與標(biāo)準(zhǔn)液所顯的斑點(diǎn)相同。黃玉清采用TLC鑒別牡丹皮及其偽品芍藥根皮，取牡丹皮、芍藥根皮粉格1g，用乙醚提取后揮發(fā)，殘?jiān)颖芙?，作為供試液；另取丹皮酚、芍藥苷分別加冰銅溶液制成對(duì)照液。分別點(diǎn)與同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3:1）為展開(kāi)劑。展開(kāi)后，晾十，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，牡丹皮供試液與丹皮酚對(duì)照液位置上顯相同的紫色斑點(diǎn)，芍藥根皮供試液與芍藥苷對(duì)照液相應(yīng)的位置上顯相同嘎品斑膈檢查有關(guān)物質(zhì)檢查通常采用色譜法，可根據(jù)有關(guān)物質(zhì)的性質(zhì)，選用專(zhuān)屬性好，靈敏度高的TLC法、高效液相色譜HPLC法及氣相色譜法GC法。TLC法設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，但影響重現(xiàn)性和精密度的因素較多，用作一般有關(guān)物質(zhì)檢查。施亞琴等采用反相薄層色譜法，建立了阿德福韋酯有關(guān)物質(zhì)檢查法。以反相高效F254薄層吧板（HPTLCRP18F254）為吸附劑，以甲醇-水3：1為展開(kāi)劑，在紫外光燈254nm下檢視，阿德福韋酯與其有關(guān)物質(zhì)的分離狀況良好，檢測(cè)靈敏度高，最小檢測(cè)限為0.1g。涂莉等采用TLC法，建立了雌三醇栓中有關(guān)物質(zhì)的檢查方法以硅膠G板為吸附劑，以氯仿-甲醇-丙酮-冰醋酸（9：05:05：05）為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾十，噴以30%硫酸乙醇液，在100°C加熱至斑點(diǎn)清晰。結(jié)果，3種有關(guān)物質(zhì)與原藥完全分離，Rf值適中，最低檢出量為0.2g，且重現(xiàn)性好。畢雪艷等采用TLC法檢查復(fù)方氨酚烷胺顆粒中的有關(guān)物質(zhì)對(duì)氯苯乙酰胺，使用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC）GF254硅膠板，以氯仿-丙酮-甲苯（13:5:2）為展開(kāi)劑，紫外光燈254nm下檢視。結(jié)果，檢出對(duì)氯苯乙酰胺雜質(zhì)斑點(diǎn)與其它主藥成分斑點(diǎn)分離良好，空白樣品溶液的斑點(diǎn)對(duì)雜質(zhì)斑點(diǎn)無(wú)干擾，重現(xiàn)性好，Rf值適中，能有效檢出有關(guān)物質(zhì)。3.中藥指紋圖譜分析中藥指紋圖譜可有效反映中藥成分的復(fù)雜性，表征中藥質(zhì)量。其作為中藥質(zhì)量準(zhǔn)的一個(gè)方面，廣泛用于鑒別樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地，有效成分研究等方面，色譜法中藥指紋圖譜的主流，主要有GC、HPLC、TLC等。TLC因其便宜、快速、開(kāi)放性、靈活性等優(yōu)點(diǎn)，用于中藥指紋圖譜分析。3.1中藥薄層圖像指紋圖譜TLC的一大優(yōu)勢(shì)是提供直觀形象的可見(jiàn)光或熒光圖像，特征圖像直觀，專(zhuān)屬性好，判斷速度快，非常適合基層日常分析與現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)使用。廣藿香主要含萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、醇、酸、銅、醛類(lèi)等化合物，廣藿香不同提取部位具有不同的藥物效應(yīng)。袁旭江等研究不同產(chǎn)地廣藿香藥材薄層色譜指紋圖譜的差別，取不同產(chǎn)地廣藿香品6個(gè)，采用TLC檢測(cè)其化學(xué)成分。結(jié)果,不同產(chǎn)地廣藿香揮發(fā)油部位中成分薄色譜行為相似，不同產(chǎn)地廣藿香甲醇提取部位與石油醚提取部位成分則存在明顯差異。3.2薄層掃描指紋圖譜薄層掃描儀具有原位掃描功能，通過(guò)測(cè)量薄層色譜Rf值，原位紫外-可見(jiàn)吸收譜，結(jié)合板上化學(xué)特征反應(yīng)形成薄層掃描中藥指紋圖譜。崔淑芬等使用薄層掃描法測(cè)定不同品種和產(chǎn)地的甘草并建立了指紋圖譜可快速判斷藥材品質(zhì)有控制甘草質(zhì)量。4.結(jié)語(yǔ)薄層色譜法專(zhuān)屬性好，分析速度快，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，不僅廣泛應(yīng)用于藥物分析中的鑒別和雜質(zhì)檢查，還用于基層快檢，大大提高了藥品抽樣陽(yáng)性率。隨著現(xiàn)代薄層色譜技術(shù)的發(fā)展，每一個(gè)環(huán)節(jié)都實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，部分彌補(bǔ)了其重現(xiàn)性分辨率的不足，使得薄層色譜在中藥指紋圖譜及手性藥物拆分等研究方面?zhèn)涫荜P(guān)注，其研究領(lǐng)域?qū)⒏訌V闊。三薄層色譜的發(fā)展與教學(xué)方法改進(jìn)自20世紀(jì)60年代薄層色譜取代紙色譜技術(shù)，至今已50余年的發(fā)展歷史。薄層色譜法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)、化學(xué)化工等各個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域，分離對(duì)象也無(wú)所不包。在大學(xué)教學(xué)中，基礎(chǔ)課《有機(jī)化學(xué)》便開(kāi)始教授，各專(zhuān)業(yè)課也常常涉及。近10年來(lái)，薄層色譜技術(shù)已有了迅猛的發(fā)展，教學(xué)內(nèi)容與方法也應(yīng)不斷改進(jìn)，以符合“教育發(fā)展必須與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展相適應(yīng)”的規(guī)律，使學(xué)生及時(shí)掌握新知識(shí)、新技術(shù)和新方法。薄層色譜應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)大薄層色譜最早用于草藥、植物等的鑒別。其方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏，成本較低。隨著薄層色譜技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷擴(kuò)大?，F(xiàn)在醫(yī)藥工業(yè)、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、食品科學(xué)、化學(xué)化工等領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。1.1醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用薄層色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于中草藥品種鑒別和成分分析、中成藥鑒別和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、合成藥物的定性鑒別、純度檢查、穩(wěn)定性考察和藥物代謝以及合成工藝監(jiān)控分析、生化和抗生素研究等方面。1.2臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用薄層色譜法用于生物樣品與毒物分析。分析的生物樣品多為血清，血漿或尿液等，用來(lái)進(jìn)行藥物生物利用度的分析，檢測(cè)臨床用藥的血藥濃度，以利于診斷臨床疾病等。毒物分析的內(nèi)容比較廣泛，包括植物毒素、真菌毒素、興奮劑、藥物中毒、走私毒品、農(nóng)藥以及尸檢刑偵破案等方面的樣品分析。1.3環(huán)境科學(xué)中應(yīng)用薄層色譜可以用來(lái)進(jìn)行環(huán)境有害物質(zhì)的分析。主要包括農(nóng)藥及農(nóng)藥殘留分析、有毒金屬測(cè)定和多環(huán)芳烴定等。1.4食品科學(xué)中應(yīng)用薄層色譜法還應(yīng)用于分離測(cè)定食品中所含有的碳水化合物、維生素、有機(jī)酸、氨基酸等天然營(yíng)養(yǎng)成分也用于食品添加劑如色素、防腐劑等，以及某些真菌毒素如黃曲霉毒素的分析。1.5化學(xué)化工中的應(yīng)用薄層色譜在化學(xué)化工方面也有很多應(yīng)用，例如無(wú)機(jī)及金屬有機(jī)化合物分析、染料及化妝品分析、石油和煤分析、手性化合物分離和化工及高分子材料分析。還適用于對(duì)高分子材料的助劑、填料等進(jìn)行分析。薄層色譜技術(shù)的深化直至2000年，我國(guó)薄層色譜鑒別基本是以手工點(diǎn)樣、實(shí)驗(yàn)室自制薄層板為基礎(chǔ)的較為粗放的操作進(jìn)行試驗(yàn)，由于硅膠材料的質(zhì)量不高和手工操作的個(gè)體差異較大，致使色譜結(jié)果不盡人意，分離度、重現(xiàn)性均難以達(dá)到滿(mǎn)意的效果。國(guó)外，尤其是歐洲國(guó)家在薄層色譜技術(shù)及相應(yīng)的儀器開(kāi)發(fā)上逐步有了很大發(fā)展，20世紀(jì)90年代已經(jīng)達(dá)到單元操作計(jì)算機(jī)自動(dòng)化，高質(zhì)量商品預(yù)制薄層板常規(guī)板與高效板代替了自制薄層板，進(jìn)入一個(gè)高層次的儀器和微機(jī)化的階段。隨著技術(shù)和儀器的引進(jìn)，我國(guó)在薄層色譜技術(shù)方面迅猛發(fā)展，高效薄層板及薄層色譜儀器已普遍使用。這就要求我們將教學(xué)內(nèi)容更新和實(shí)驗(yàn)課中操作方法改進(jìn)。高效薄層色譜法HPTLC是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種高效、快速、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高和重現(xiàn)性好的薄層色譜新技術(shù)。高效薄層色譜采用更細(xì)、更均勻的改性硅膠和纖維素為固定相，對(duì)吸附劑進(jìn)行疏水和親水改性，可以實(shí)現(xiàn)正相和反相薄層色譜分離，提高了色譜的選擇性，彌補(bǔ)了常規(guī)的普通薄層色譜TLC存在的展開(kāi)時(shí)間長(zhǎng)、展開(kāi)劑體積需求大和分離結(jié)果差等缺點(diǎn)。薄層色譜掃描儀由單板機(jī)控制和配備積分儀的薄層掃描儀，轉(zhuǎn)型為以工作站控制的臺(tái)式計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制操作的薄層掃描儀。使用薄層色譜掃描儀進(jìn)行定量檢測(cè)有吸收測(cè)定法、熒光測(cè)定法和熒光猝滅法。對(duì)在可見(jiàn)及紫外光區(qū)有吸收的化合物可用鎢燈和氘燈在190-800nm范圍進(jìn)行透射和反射吸收法測(cè)定；化合物本身或者經(jīng)過(guò)色譜前和色譜后衍生化生成對(duì)紫外有吸收并能放出更長(zhǎng)波長(zhǎng)的化合物適用熒光法測(cè)量，熒光法靈敏度高，最低可測(cè)至pg級(jí)；本身無(wú)顏色、又無(wú)特征紫外吸收或熒光，并且不易衍生的化合物，可使用含有熒光劑的薄層板，采用熒光猝滅法測(cè)量。此外，自動(dòng)鋪板儀、電動(dòng)噴霧器、自動(dòng)點(diǎn)樣儀、薄層色譜展開(kāi)儀、薄層色譜成像儀等的使用，使薄層色譜法逐步實(shí)現(xiàn)了儀器化。薄層色譜的規(guī)范化操作在