文章研究目的：探討了小麥-冰草6p染色體片段異位的遺傳組成，并且確定了6p染色體的易位片段對于小麥的千粒重以及穗的長度影響。背景介紹：一些野生近親材料為栽培作物提供了豐富的遺傳資源。引言：普通小麥（TriticumaestivumL.,2n=6x=42,genomes=AABBDD)是一種主要的谷類作隨著全世界人口的增加、氣候條件的改變以及農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的需求量的增加，這些都迫切的要求我們在未來幾十年里需要提高作物的產(chǎn)量。然而在長期的栽培過程中，精英小麥的種植已經(jīng)造成遺傳多樣性的下降。拓寬小麥的遺傳基礎(chǔ)對于提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，以及增強其生物脅迫和非生物脅迫的抗性方面的育種有非常重要的意義。而一些野生的材料正好擁有一些很好的基因和遺傳基礎(chǔ)。培育小麥-近親野生材料易位品種并且對其遺傳組成進行分析，這對于高效的轉(zhuǎn)移有價值的基因是非常關(guān)鍵的。近年來，將普通小麥與山羊草，中間堰麥草，大賴草，黑麥，簇毛麥以及新麥草進行雜交，許多種屬間雜合易位系已經(jīng)被培育出來了。這些野生材料具有一些新的抗病基因，如葉銹病，莖銹病，條銹病等等。材料介紹：冰草（Agropyroncristatum，2n=4x=28，genomespppp),是重要的小麥野生近緣物種，它擁有許多良好的性狀，如高分蘗數(shù)、高小花數(shù)、抗小麥銹病、白粉病和大麥黃矮病毒早在20世紀90年代通過大量的雜交和胚拯救途徑，獲得了一系列的commonwheatcv.Fukuhokomugi-A.cristatumaccessionZ559種屬間雜種。同受體親本Fukuho相比，異附加系4844-12每穗上具有更多數(shù)量的小花和籽粒Wu等人已經(jīng)在冰草6p染色體上定位出了能夠增加小花和籽粒數(shù)量的農(nóng)藝性狀。通過輻射技術(shù)和山羊草殺配子染色體效應(yīng)獲得了許多小麥-冰草6p易位系。小麥-冰草易位系Pubing3035來源于小麥-冰草異附加系的輻射雜交種，這是一個有價值的小麥-冰草6p染色體插入中間的易位系。為了詳細的了解Pubing3035的遺傳組成以及進一步探索位于冰草6p染色體上的優(yōu)良基因，嚴謹?shù)幕亟缓妥越皇潜匾氖侄巍ubing3035同普通小麥Fukuho進行雜交以此獲得F2分離群體和BC1F1分離的群體。有趣的是，在這兩個群體中，包含有6p易位染色體的片段易位系展現(xiàn)出了更優(yōu)秀的農(nóng)藝性狀（千粒重和穗長）。在本研究中，采用全基因組原位雜交、熒光原位雜交以及分子標記技術(shù)來研究Pubing3035的遺傳組成，同時也定位了插入冰草6p染色體中間的染色體片段上面的優(yōu)良農(nóng)藝特性。材料和方法：小麥-冰草6p雙體異附加系4844-12（2n=44）和雙體異代換系4844-8（2n=42）。材料的獲得：將冰草Z559（2n=4x=28，PPPP）同普通小麥T.aestivumcv.Fukuho雜交獲得。小麥-冰草6p易位系WATP6-32（輻射二代種），來源：將Gaocheng8901和4844-12的雜交種進行輻射得到。受體親本Fukuho和高強筋小麥T.aestivumcv.Gaocheng8901是普通小麥品種。從WATP6-32連續(xù)自交七代的后代中通過細胞遺傳學(xué)分析，將易位系Pubing3035分離出來。F2群體由Pubing3035和Fukuho雜交獲得。BC1F1回交群體由輪回親本同Pubing3035連續(xù)的回交獲得。F2群體和BC1F1群體大小分別為310和88個。這兩個群體用來研究優(yōu)秀的農(nóng)藝性狀同異源附加染色體片段之間的關(guān)系。方法：探針pAs1是一個長度為1kb的重復(fù)序列，來源于Ae.tauschiiCoss.(2n=2x=14,DD)，它使得我們能夠鑒定小麥所有D組的染色體。pHvG39克隆能夠同B基因組產(chǎn)生很強的特異性雜交信號而與A、D組雜交微弱。使用探針pAs1和pHvG39克隆作為探針進行雙色熒光原位雜交來鑒別發(fā)生易位的小麥染色體。分子標記分析：為確定易位的6p染色體片段和他的位置，從GrainGenes2.0網(wǎng)站上下載并篩選出位于小麥1A染色體上的462對ssr引物和13對STS標記。并且，根據(jù)已經(jīng)發(fā)布過的冰草轉(zhuǎn)錄組序列，設(shè)計出了680對6p染色體特異性EST-STS標記。農(nóng)藝性狀的評估：性狀的評估最初都是針對雙親和大群體。對于親本進行的區(qū)域試驗選擇了兩個地方（北京和河南新鄉(xiāng)），每個試驗三個重復(fù)，每行20株，種在兩米寬的地中，空出0.3m的田溝。重點調(diào)查所有親本幾個重要的農(nóng)藝性狀，如，株高，種子育性，穗長，每穗籽粒數(shù)，千粒重以及小花密度。同樣，310個F2群體以及由包含易位片段Pubing3035和普通小麥Fukuho雜交得到的88個BC1F1群體，在2013-2014年播種，并且調(diào)查性狀。每個單株都要通過特異的序列標簽標記來鑒定P基因組。之后，兩個群體被分成兩個組：通過冰草6p特異性標記的群體鑒定，將這兩個群體分為兩個組：6p易位植株和非易位植株。在收獲的時候，對F2群體和BC1F1群體每個單株進行性狀調(diào)查，同時也對Pubing3035,4844-12,Gaocheng8901及Fukuho親本的20個植株進行隨機選擇來調(diào)查性狀。使用SAS軟件進行數(shù)據(jù)分析，用t檢驗來調(diào)查6p易位植株和非易位植株之間，以及各親本之間農(nóng)藝性狀的差別。圖一：發(fā)生易位的小麥部分同源染色體GISH/FISH鑒定。a圖表示用P基因組的DNA（紅色）作探針來檢驗Pubing3035中的6p易位片段。b圖表示的雙色的熒光原位雜交技術(shù)，用pHvG39克隆（綠色）和pSs1（紅色）作為探針來鑒定Pubing3035.遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL作圖：為更進一步確定發(fā)生易位的位點以及冰草染色體同農(nóng)藝性狀之間的關(guān)系，我們使用了F2群體構(gòu)建了遺傳圖譜。用IciMapping3.3軟件進行了QTL作圖和關(guān)聯(lián)分析，LOD值取2.5為臨界值。結(jié)果：GISH和FISH分析用ＧＩＳＨ技術(shù)可以獲得易位系Ｐｕｂｉｎｇ３０３５基因組結(jié)構(gòu)的清晰圖片，這都得益于我們在有絲分裂中期使用的冰草全基因組的ＤＮＡ作為探針并且用ＦＵＫＵＨＯ的ＤＮＡ作為封阻探針。根尖體細胞成像結(jié)果可以看出：易位的Ｐｕｂｉｎｇ３０３５有著非常小的帶有紅色雜交信號的冰草染色體片段。從Ｐｕｂｉｎｇ３０３５的熒光信號圖中可以看出，在著絲粒附近有一段外源染色體片段插入。ＧＩＳＨ的結(jié)果表明Ｐｕｂｉｎｇ３０３５含有普通小麥的４２條染色體，所以它能夠被看做一個小麥－冰草中間插入的易位類型。雙色熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合全基因組熒光原位雜交技術(shù)揭示了６ｐ染色體片段易位到了普通小麥Ａ組１號染色體的短臂上面。因此Ｐｕｂｉｎｇ３０３５是１ＡＳ－６ｐ中間插入型的易位系。ＥＳＴ－ＳＴＳ分析：Ｐｕｂｉｎｇ３０３５上有著來源于冰草轉(zhuǎn)錄組的６８０對Ｐ基因組上的特異性序列標簽位點引物。從這６８０對引物中，我們又篩選出了８對ＥＳＴ－ＳＴＳ引物，這些引物對冰草、雙體異附加系４８４４－１２、雙體異代換系４８４４－８以及Ｐｕｂｉｎｇ３０３５能夠擴增出條帶而而對普通小麥Ｆｕｋｕｈｏ和Ｇａｏｃｈｅｎｇ８９０１則不能擴出條帶。這些引物擴增的長度多數(shù)在１１０到２５０個ｂｐ長度。結(jié)果表明這些ＥＳＴ－ＳＴＳ引物能夠作物分子標記來示蹤冰草的６ｐ異源染色體。圖二：易位系Ｐｕｂｉｎｇ３０３５的ＥＳＴ－ＳＴＳ引物擴增圖及陰性對照；１.冰草Ｚ５５９，２.４８４４－１２,３.４８４４－８,４.Ｇａｏｃｈｅｎｇ８９０１,５．Ｆｕｋｕｈｏ，６.ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇ，７.Ｐｕｂｉｎｇ３０３５.箭頭指向的是冰草的擴增產(chǎn)物的檢測。圖三：左邊的是小麥的１Ａ染色體遺傳連鎖圖，右邊是物理圖譜。遺傳圖距展示在遺傳圖譜的左邊，標記在右邊。冰草的特異標記以粗體展示。右側(cè)是１Ａ染色體的物理圖譜，包括C-1AS1-0.47、1AS1-0.47-1以及1AL。標明的缺體系和小塊的斷點在左側(cè)，bin-mapped標記在右側(cè)。橙色區(qū)域指代的是冰草6p染色體的缺少區(qū)域。物理圖譜來源于GrainGenes網(wǎng)站上。小麥-冰草6p易位系的易位點：為了證實易位的小麥的染色體和中間插入的位置，我們使用位于小麥1A染色體圖譜上的一共461對SSR引物和13對序列標簽位點標記來查看是否這個易位系僅僅只是插入了6p染色體的一個片段而沒有丟失任何其他的1A染色質(zhì)（表S1和S2）。分子標記分析的結(jié)果表明在Pubing3035中1A染色體上沒有標記丟失。用遺傳圖譜分析的方法來精確的定位易位的位點。檢測了這些標記在Pubing3035和Fukuho中的多態(tài)性。通過篩選后，這些標記中有34（7%）對SSR引物在兩個親本中能擴增出多態(tài)性條帶。選擇小麥多態(tài)性SSR引物和冰草EST-STS引物來確定發(fā)生易位的位點。在F2分離群體中，卡方檢測表明發(fā)生易位和未發(fā)生易位的植株比例遵循理論上的3:1比例。根據(jù)小麥的標記和冰草特異標記之間的連鎖關(guān)系，發(fā)生易位的染色體和易位的位點已被確定?；贔2群體的連鎖圖譜表明冰草6p特異性標記同位于1AS上的標記有著關(guān)聯(lián)。6p染色體片段被定位在SSR12引物1cM到SSR263引物3.52cM之間（圖3a）。這兩個與小麥基因組草圖序列一致的標記被定位在小麥1AS上靠近著絲粒區(qū)域（圖3b）。冰草6p中間插入的染色體片段來源分析：為查明冰草6p中間插入片段的來龍去脈，我們使用了基于SLAF-seq測序的AgropyronGaertn.p基因組高密度圖譜。開發(fā)了9個位于冰草6p染色體SLAF標記來分析在Pubing3035中的異源片段起源。如圖4所展示的，4個標記（SL4746，SL4100，SL10594和SL12433）從冰草6p染色體的短臂篩選出來，另外五個標記（SL11313,SL26496,SL17120,SL12396和SL45115)從冰草6p染色體長臂上篩選出來。不過僅僅只有一個SLAF引物（SL11313）能夠在Pubing3035中擴增出特異性條帶。與P基因組上遺傳圖譜的位置信息結(jié)合，我們發(fā)現(xiàn)SL11313標記同SL12396和SL45115兩個標記位于相同的位置。這結(jié)果表明在Pubing3035中冰草6p中間插入染色體片段來源于冰草的6p染色體長臂。Pubing3035農(nóng)藝性狀的調(diào)查：在生長期的時候，Pubing3035就表現(xiàn)出緊湊的植株表型并且要比普通小麥Gaocheng8901要高大。在收獲的時候，所有的親本都要調(diào)查性狀，性狀包括：株高、生殖枝、穗長、每穗小花數(shù)、每穗籽粒數(shù)、每個小花籽粒數(shù)、千粒重和小花密度。超過兩個地點的性狀調(diào)查，結(jié)果都是相似的顯著水平，這表明在獨立的環(huán)境中Pubing3035的表型遺傳上是穩(wěn)定的。在這三個親本中，Pubing3035的每穗小花數(shù)、每小花籽粒數(shù)和每穗粒數(shù)要低于另外兩個親本4844-12和Gaocheng8901。Pubing3035的高度要高于Gaocheng8901，但是低于4844-12.在生殖枝方面，Pubing3035和Gaocheng8901之間沒有顯著的差異。然而，這三個材料之間，在千粒重、穗長和小花密度方面表現(xiàn)出了顯著的變化。Pubing3035和4844-12相比于所有的Gaocheng8901植株有著更高的千粒重、更長的穗長以及更低的小花密度（表格2）。以上結(jié)果表明冰草6p中間插入片段對千粒重和穗長方面有著積極的調(diào)控作用，它為改善穗的性狀和增加產(chǎn)量而不延長生長期和成熟期提供了可能性。冰草6p易位片段遺傳上的影響：對F2群體進行了t測驗、對BC1F1群體更進一步的分析了6p染色體的片段在遺傳上的影響。結(jié)果顯示在穗長、千粒重和小花密度性狀方面有著顯著的差異；然而在F2群體中易位和非易位植株間在生殖枝和每穗籽粒數(shù)性狀上沒有明顯差異。通常來講，易位單株的（千粒重=45.4g）千粒重要比非易位的單株（千粒重=42.8g）要高2.5g。發(fā)生易位的單株穗長（10.2cm）大約要比非易位的個體長0.7cm。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在BC1F1群體中的易位和非易位個體之間（表3）。在BC1F1群體中，易位單株的千粒重也要比非易位的單株重2.5g，穗長也要長0.7cm。以上結(jié)果表明小麥-冰草6p易位單株對于增加千粒重和穗長的表型有促進作用，這對于提高小麥產(chǎn)量和改善穗子的性狀方面有著重要意義。為了找出小麥-冰草6p易位的個體不同的性狀的QTL位點，進行了QTL定位。這些性狀包括株高，分蘗數(shù)，穗長，穗粒數(shù)，千粒重以及小花密度。通過使用6個小麥SSR標記和8個冰草特異EST-STS標記構(gòu)建了1AS上的遺傳連鎖群。一共發(fā)現(xiàn)了3個QTL簇，并且將區(qū)間定位在Agc7155和SSR263之間（圖5）。發(fā)現(xiàn)有一個QTL集群與增加穗長相關(guān)，這也解釋了LOD值為4.89，12.38%表型方差。第二個QTL集群解釋了24.96%的千粒重表型方差，LOD值為10.63。第三個QTL同小穗密度性狀相關(guān)聯(lián)，其上有個異源基因能降低穗密度。這解釋了17.2%表型方差，LOD值為5.59（表4）?？偟膩碚fQTL作圖的結(jié)果更深層次的說明了6p異源的染色體片段中含有對提高產(chǎn)量和增加穗長方面重要的基因。圖5：通過QTL作圖發(fā)現(xiàn)異源的冰草6p易位片段對于不同性狀的遺傳影響。微衛(wèi)星標記和冰草EST-STS標記的連鎖圖用來對F2群體進行QTL分析。猜測的QTL集群展示在右側(cè)。TGW表示千粒重，SL表示穗長，SD代表穗密度。討論：小麥-冰草6p中間插入型易位系Pubing3035一個有價值的，片段小的易位系。野生的近親品種對于小麥的改良是一個豐富的遺傳資源庫。通過遠緣雜交將小麥的野生近親種中的的基因?qū)氲狡胀ㄐ←溨袕亩鴣硖岣咝←溸z傳多樣性，這是一個基本途徑。染色體工程在目標外源基因的漸滲方面的成功的關(guān)鍵在于消除了在作物中漸滲片段所帶來的不利影響。然而從一個基因組中將有利的基因轉(zhuǎn)移到另一個非同源的基因組之中也是一個難點。通過異源基因的漸滲來獲得有育種價值的材料本身就比較困難。比如，從57個自發(fā)或者誘導(dǎo)產(chǎn)生的小麥異源染色體易位系中也僅僅只在發(fā)現(xiàn)了兩個中間插入型的易位系。通常來講，含有越小外源片段的易位系在遺傳上是更加穩(wěn)定的并且出現(xiàn)不良影響的可能性也更加低。許多研究人員曾經(jīng)都探索過大量的方案來創(chuàng)建具有更小不利影響的小的片段易位系，他們使用輻射的方法和Ph1系統(tǒng)，如改良過的染色體工程方法，它能夠有效的消除山羊草染色質(zhì)周圍大量的Sr39，再如一個簡化的簇毛麥，它包含有抗白粉病Pm21位點的染色質(zhì)，還有小麥-黑麥的末端和中間插入型染色體易位系的創(chuàng)建。在我們的研究中，鑒定了Pubing3035是一個中間插入型的易位系而且它能增加千粒重和穗長，重要的是它沒有帶來不利影響。雖然Pubing3035易位系出現(xiàn)在小麥染色體1AS和冰草染色體6PL之間，但是在遺傳上它很可能是穩(wěn)定的。Pubing3035含有小的冰草6p片段不含有小麥1A染色質(zhì)的丟失。穩(wěn)定的遺傳特征和表型數(shù)據(jù)表明Pubing3035不會帶來明顯有害的性狀特征（表2）。而且前人的研究也表明在進化的過程中冰草6p染色體發(fā)生了遺傳重排。類似的，染色體重排也發(fā)生在小麥-簇毛麥和小麥-大賴草的易位系中。因此可以推測，在Pubing3035中的6p染色體插入片段可能存在一個對小麥1AS部分補償效應(yīng)。在將來新技術(shù)將會揭示在小麥1As染色體中的6p片段的序列共線性關(guān)系。而且，已經(jīng)有證明來自于小麥野生近緣物種中的許多有價值的基因同第六號部分同源染色體組有關(guān)。6VS/6AL易位系已經(jīng)被創(chuàng)建，并且它具有抗白粉病的基因Pm21。Du等人驗證了wheat-Ps.HuashanicaKeng6Ns雙體異附加系擁有成對的小穗、多個小花以及籽粒。Xie等人報道過抗白粉病基因PmG3M被定位在野生二粒小麥的6BL染色體上。我們的研究結(jié)果表明6p染色體片段也擁有讓人驚喜的農(nóng)藝性狀，更大的千粒重和更長的穗長，而且Pubing3035是一個有價值的小的片段易位系。我們研究的結(jié)論對更進一步研究基因挖掘方面奠定了基礎(chǔ)。6p染色體片段的漸滲能夠提高小麥的千粒重：千粒重在一些糧食作物中是一個重要的指標。然而許多不利的氣候原因給千粒重帶來了不良影響，近些年明顯影響了小麥的產(chǎn)量。因此，尋找能夠提高產(chǎn)量的新的遺傳資源庫已迫在眉睫。水稻中，許多基因包括GS3，GW2和GIF1已經(jīng)被驗證同產(chǎn)量相關(guān)。在小麥中水稻OsGW2基因的直系同源基因TaGW2也被視作為同產(chǎn)量相關(guān)的候選基因。單體型Hap-6A-A在TaGW2-6A啟動子區(qū)域形成，并且很大程度上同更高的千粒重相關(guān)。Hou等人報道過在小麥高產(chǎn)育種中與千粒重相關(guān)的胚乳淀粉的合成路徑是一個間接選擇的主要的目標。在小麥近緣物種中，帶有與千粒重相關(guān)的QTL1RS染色體能夠顯著的提高千粒重，穗長和穗寬。而且，已經(jīng)證明6VS/6AL易位系在增加千粒重和穗長方面有著積極的作用。本研究中包含冰草6p片段的中間插入型易位系Pubing3035擁有比普通小麥更高的千粒重。此外，從F2和BC1F1群體中進行的遺傳分析表明Pubing3035對于提高