第三章植物離體快繁技術(shù)植物離體快繁又叫微繁，是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對外植體進行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。

特點：

①繁殖速率高；②培養(yǎng)條件可以人為控制，可進行周年生產(chǎn)；③占地空間??；④管理方便，利于自動化控制。第一節(jié)離體快繁的一般方法第二節(jié)離體無性繁殖中存在的一些問題第三節(jié)離體無性繁殖的商業(yè)化生產(chǎn)的范圍和應用目錄第一節(jié)離體快繁的一般方法無菌培養(yǎng)物的建立莖芽的增殖無根苗的生根壯苗、煉苗和移栽一、無菌培養(yǎng)物的建立

1、采樣2、消毒3、接種4、培養(yǎng)外植體的選擇原則：①外植體類型的選擇，一定程度上是由所要采用的莖芽繁殖方式?jīng)Q定的。

脫除病毒

得到愈傷組織增加腋芽生枝數(shù)目1、采樣莖尖有營養(yǎng)芽的外植體葉片②外植體的生理狀態(tài)對莖芽的反應能力有明顯的影響

選取相對較為幼嫩、生長能力較強的部位的材料生長季節(jié)>休眠季節(jié)幼嫩部分>成熟組織接種后反應較敏感，生長能力強

根據(jù)外植體的特點選擇適宜的消毒劑種類、濃度和消毒時間進行外植體的表面消毒。參考第一章外植體的消毒技術(shù)。

在進行常規(guī)的外植體消毒之前，也可采取其他措施來保證培養(yǎng)材料的無菌性。

從入選的植株上切取插條，放入溫室中進行培養(yǎng)。

從田間取回的材料在室內(nèi)遮光水培（黃化預處理）。2、消毒進行無菌操作時有以下幾點需注意：

接種前提前10-20min開啟超凈工作臺，讓過濾器空氣吹拂工作臺面和四周臺壁，操作人員接種時在工作臺上應用70％乙醇擦拭雙手和臺面，操作時視情況應再擦拭數(shù)次。

接種時試管、培養(yǎng)瓶應，不能對著風口或自己，最好能在火焰附近打開或塞上塞子。3、接種斜拿

光照溫度濕度4、培養(yǎng)

光照時間

光照強度

光波長短普通培養(yǎng)室光照時間：12-16h/d，光照強度:1000-5000lx。

不同的光照強度、時間等對培養(yǎng)材料的分化與生長可能有影響，如誘導愈傷組織通常在黑暗條件下較好，但器官分化則需要光照，且不同光波對器官分化有密切關(guān)系，像百合在黑暗條件下長小球莖，在光照條件下長葉片，紅光與遠紅光對煙草芽苗分化有促進作用。在試管苗的生長過程中加強光照強度可使苗木生長健壯，提高移栽成活率。

光照

一般,植物離體培養(yǎng)的溫度低于15℃或高于35℃，對分化和生長都不利。大多數(shù)植物最適的培養(yǎng)溫度在23-32℃之間，一般控制在(25±2)℃條件下培養(yǎng)，熱帶園藝植物培養(yǎng)溫度稍高。溫度

離體培養(yǎng)中環(huán)境的濕度主要指培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度，相對濕度常達100％，但液體培養(yǎng)與固體培養(yǎng)時濕度可能有變化，固體培養(yǎng)時瓊脂的用量與質(zhì)量對培養(yǎng)環(huán)境的濕度有影響。濕度1、原球莖途徑2、胚狀體途徑3、不定芽途徑4、頂芽和腋芽萌發(fā)途徑二、莖芽的增殖原球莖：是蘭花的種子發(fā)芽過程中特有的一種形態(tài)學結(jié)構(gòu)，是縮短的、成珠狀、由胚性細胞組織的類似嫩莖的器官。在組培中常從莖尖或側(cè)芽的培養(yǎng)中產(chǎn)生。1、原球莖途徑

利用體細胞胚狀體來進行無性系的大量繁殖具有極大的潛力。其特點是：

繁殖系數(shù)高成苗快結(jié)構(gòu)完整不存在嵌合現(xiàn)象2、胚狀體途徑

不定芽：葉腋和莖尖以外的任何其他地方所形成的芽，由愈傷組織分化出的莖芽也稱為不定芽。3、不定芽途徑理論上講，植物任何部位的器官或組織都可以產(chǎn)生不定芽。

不定芽的產(chǎn)生方式：A直接發(fā)生不定芽；

B先形成愈傷組織；然后形成不定芽。

不定芽途徑的特點繁殖系數(shù)較高；易形成嵌合體；

再生的植株由于根和芽可能不是來自于同一個細胞，所以易形成嵌合體。發(fā)生變異的概率較高

由于經(jīng)過愈傷組織階段，發(fā)生變異的概率較高，影響無性系后代的遺傳穩(wěn)定性，有時使園藝植物的觀賞價值或商業(yè)價值喪失。扦插繁殖組培（莖段培養(yǎng)）

4、頂芽和腋芽萌發(fā)途徑？一年中插條的數(shù)目極為有限，因為自然界營養(yǎng)生長是有季節(jié)性的。

由頂芽和腋芽直接萌發(fā)形成植株的特點

無性系基本上能保持原品種的特性，發(fā)生變異的概率極低，快繁主要采用這種途徑。

繁殖系數(shù)較其他幾種繁殖方式低。此外，為脫除病毒時也采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進行培養(yǎng)。

基本培養(yǎng)基——培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基類型植物激素——激素調(diào)控理論光照和溫度——參照原產(chǎn)地的氣候條件5、影響莖芽增殖的因素試管內(nèi)生根

試管外生根三、無根苗的生根方法：把大于1cm的芽苗，接入生根培養(yǎng)基誘導生根。誘導條件：（1）較低的無機鹽濃度常采用1/2或1/4強度的MS培養(yǎng)基或低無機鹽的White培養(yǎng)基。（2）生長素加入適量的生長素（較常用的是NAA和IBA），可促進根的誘導。（3）較低的糖濃度降低糖濃度也有利于根的誘導。（4）一定的光照強度有研究表明，較強的光照能促進根的發(fā)育，并使植株變得堅忍。絕大多數(shù)植物在2-4周內(nèi)即可生根.1、試管內(nèi)生根2、試管外生根

具體方法：在插條基部用生根粉或生長素處理，移栽生根。試管內(nèi)先誘導形成根源基，移栽、保濕。離體條件下形成的枝條作為微插條進行扦插生根。

當試管內(nèi)難于誘導生根或市場拒絕自根苗的情況下，嫁接就成了離體快繁的最后一步必然選擇。3、無根苗的嫁接又叫微型嫁接或微體嫁接。在試管內(nèi)以0.1-0.2mm的莖尖為接穗，在無菌條件下借助于體視顯微鏡，嫁接在試管內(nèi)預先培養(yǎng)好的帶根實生苗上的一種方法。試管內(nèi)嫁接試管外嫁接生產(chǎn)上比較成功的例子就是三倍體無籽西瓜嫁接到瓢瓜上。四、壯苗、煉苗與移栽無菌帶菌低光強高光強適宜的溫度變溫100％的相對濕度低濕營養(yǎng)充足的培養(yǎng)基栽培介質(zhì)移栽時環(huán)境條件的變化試管苗生長在恒溫、高濕、弱光、無菌和完全營養(yǎng)供應的條件下，雖有葉綠素，但是“異養(yǎng)生活”，因此在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性上都很脆弱，如水分疏導系統(tǒng)存在障礙，葉面無角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，氣孔開張過大且不具備關(guān)閉功能等。組培苗的特點加一定數(shù)量的生長延緩劑高糖高生長素高光強打開瓶口，在半光、全光條件下煉苗3-5d壯苗煉苗注意事項第一，移栽前必須把附著于小苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈，以免由于污染而導致小苗死亡；同時注意避免根頸部損傷引起小苗感染。第二,移栽時介質(zhì)要疏松通氣，保水但濾水性能好。常用的介質(zhì)以粗粒狀的蛭石、珍珠巖、草炭、粗沙或?qū)⑺鼈円砸欢ǖ谋壤旌蠎幂^好。第三，移栽后保持小苗的水分供需平衡。常采用加覆塑料薄膜或燒杯等措施盡量使植株周圍空氣濕度接近100％，使葉面蒸騰減少，同時注意使植株的生活環(huán)境保持與周圍空氣順暢的氣體交換。移栽第四，要注意一定的光、溫條件。光照以4000lx左右強度的散射光為好，過強或過弱都不利于小苗健康生長。溫度要根據(jù)不同的植物種類而變化。如果有合適的設備使介質(zhì)溫度略高于空氣溫度則有利于組培苗根系的生長。最后，要注意適時迫肥、防霉菌及病蟲。追肥可以利用1／2大量元素的稀水溶液，防霉菌每隔7—10d噴1000倍左右的多菌靈或托布津溶液。一、物種的局限性

二、無性系變異第二節(jié)離體無性繁殖中存在的一些問題三、培養(yǎng)物污染污染的菌源包括細菌和真菌兩類。培養(yǎng)基污染的幾個可能來源外植體；培養(yǎng)基本身；接種和繼代時用以操作的器械；培養(yǎng)容器；接種室的環(huán)境；培養(yǎng)室的環(huán)境。四、玻璃化玻璃化是植物組織培養(yǎng)中特有的一種生理失調(diào)或生理病變。玻璃化苗與正常苗相比，其特點有：生長速度下降，甚至最后死亡；植株矮小腫脹，節(jié)間很短或幾乎沒有，葉片水漬化，半透明，厚而狹長，皺縮或縱向卷曲，脆弱易碎，葉片缺少角質(zhì)層，沒有功能性氣孔。顯微觀察表明，玻璃化苗葉片沒有柵欄組織，僅有海綿組織。生理生化研究表明，玻璃化苗細胞中含水量高、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等含量低；此外，一些酶的活性也發(fā)生了變化。五、褐化褐化是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。是離體繁殖中發(fā)生比較普遍的一種現(xiàn)象。褐化的發(fā)生褐化的發(fā)生與植物種類和品種、外植體年齡、大小和取材時間等都有一定關(guān)系。培養(yǎng)基的物理狀態(tài)及成分、繼代時間及培養(yǎng)環(huán)境對褐化的發(fā)生也有重要的影響。六、黃化

黃化是試管苗整株失綠，全部或部分葉片黃化、斑駁的現(xiàn)象。

黃化的原因：培養(yǎng)基中的鐵鹽含量不足、礦物質(zhì)營養(yǎng)不均衡、激素配比不當、pH變化過大、糖用量不足或已耗盡等。培養(yǎng)瓶內(nèi)通氣不良、乙烯含量升高、溫度不適、光照不足等。此外，也與培養(yǎng)過程中青霉素、鏈霉素等抗生素類物質(zhì)的添加有關(guān)。第三節(jié)離體無性繁殖的商業(yè)化

生產(chǎn)的范圍和應用一、用于稀缺或急需良種植物的繁殖二、用于脫毒苗的快速繁殖三、雌雄異株植物、三倍體、單倍體及基因工程植株的快速繁殖四、瀕危植物的拯救五、用于種質(zhì)的試管保存及交換

植物離體快繁的理論增殖值的計算

Y=mXn

Y：代表年理論增殖總數(shù)

m：代表外植體個數(shù)X：代表增殖倍數(shù)n：代表年理論增殖周期數(shù)1.概念：離體快繁技術(shù)、不定芽、褐化、玻璃化2.植物離體快繁的程序有哪些？3.植物離體快繁中增殖的途徑有哪些？4.防止褐化的措施有哪些？5.防止組培苗玻璃化的措施有哪些？6.植物組織培養(yǎng)中造成污染的可能原因有哪些？7.植物離體快繁的理論增殖值如何計算？思考與練習7.原球莖是蘭花的種子發(fā)芽過程中特有的一種形態(tài)學結(jié)構(gòu)。

（判斷正誤）8.玻璃化苗與正常苗