第八章菌種的保藏與復(fù)壯菌種衰退的基本原因是變異，變異是不可避免的，而減緩變異速度則是可能的。變異速度與菌種所處的環(huán)境有密切的關(guān)系，不良環(huán)境條件能促進(jìn)變異，頻繁或過(guò)多傳代也是造成衰退變異的重要原因。為菌種創(chuàng)造良好條件，減緩菌種衰退，這就是菌種保藏與復(fù)壯工作。第八章菌種的保藏與復(fù)壯菌種衰退的基本原1衰退：菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱(chēng)為菌種的衰退。衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。衰退：2常見(jiàn)的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降；常見(jiàn)的衰退現(xiàn)象：3防止菌種衰退的方法：

合理育種；合適的培養(yǎng)基；

選擇合適的培養(yǎng)條件；控制傳代次數(shù)；

利用不易衰退的細(xì)胞傳代；采用有效的菌種保藏方法。防止菌種衰退的方法：

合理育種；4第八章菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏

二、菌種的提純與復(fù)壯三、菌種保藏機(jī)構(gòu)第八章菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏

5一、菌種保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不同。工業(yè)微生物菌種保藏，是要使菌種生產(chǎn)能力和與生產(chǎn)工藝相適應(yīng)的優(yōu)良性狀保持穩(wěn)定，當(dāng)然做不到絕對(duì)不變，只是力求把這種衰退現(xiàn)象推遲減緩到最低限度。一、菌種保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不6菌種保藏菌種保藏有許多的方法，其共同的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良性狀保存下來(lái)，防止退化、死亡或雜菌污染。保藏的一般程序是選取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，在其休眠和停止生長(zhǎng)的條件下保藏。微生物生長(zhǎng)要求適宜的溫度、水分、空氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，如將菌種處于低溫、干燥、無(wú)氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)的條件下，就可以使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài)。菌種保藏菌種保藏有許多的方法，其共同的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良性狀7菌種保藏其中低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一種簡(jiǎn)單易行的方法。在作低溫保藏時(shí)，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時(shí)，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細(xì)胞水分外滲而大量脫水，可能使細(xì)胞死亡。如快速降溫，胞內(nèi)也很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時(shí)胞內(nèi)冰晶較小，對(duì)細(xì)胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。與低溫相關(guān)的保藏方法，如冷凍干燥法、超低溫保藏法等，都是利用低溫條件下細(xì)胞與環(huán)境的特殊平衡原理而設(shè)計(jì)的。菌種保藏其中低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一8一、菌種保藏(一)低溫保藏法

(二)低溫定期移植法

(三)石蠟油低溫保藏法

(四)干燥保藏

(五)甘油管保藏法(六)真空冷凍干燥法

(七)液氮超低溫保存

現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:一、菌種保藏(一)低溫保藏法現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:9(一)低溫保藏法

這是一種常用的簡(jiǎn)便方法。一般的斜面孢子、液態(tài)孢子、斜面種子以及用麩皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4℃冰箱內(nèi)保藏，這種溫度條件下不能使菌體進(jìn)入休眠，而僅是抑制微生物的生命活動(dòng)。因此，保藏時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)1～2個(gè)月為宜。本方法雖然簡(jiǎn)便，但由于菌株處于較高的水平活性下，這對(duì)保藏株的生產(chǎn)性狀是不利的，因此，生產(chǎn)菌種一般不采用此法保藏。(一)低溫保藏法這是一種常用的簡(jiǎn)便方法。一般的斜面孢子、液10(二)低溫定期移植法

把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，定期移植，一般3～6個(gè)月移植一次(視菌種特征而定)。也可以用穿刺培養(yǎng)，定期移植法保藏細(xì)菌，其效果也較好。穿刺培養(yǎng)是將含0.6％～0.8％的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌后直立冷凝后，用接種針尖挑取少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)好后即可放低溫保存，此法較斜面保存有利，大腸桿菌可保藏2年以上不發(fā)生明顯變異。(二)低溫定期移植法把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，11(二)低溫定期移植法斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷，即容易發(fā)生遺傳變異；連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱，也易于污染雜菌，培養(yǎng)基干枯。因此，一些貴重菌株及生產(chǎn)優(yōu)良菌株不宜用此法保藏。(二)低溫定期移植法斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷，即12(三)石蠟油低溫保藏法

本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長(zhǎng)和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長(zhǎng)期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。不宜用于能利用石蠟為碳源的微生物。(三)石蠟油低溫保藏法本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅13(三)石蠟油低溫保藏法具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過(guò)長(zhǎng)；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過(guò)121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時(shí)滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm左右為宜。普通冰箱保藏。(三)石蠟油低溫保藏法具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不14(四)干燥保藏

微生物生長(zhǎng)需要水分，干燥法是使菌處于干燥條件下停止生長(zhǎng)及處于休眠狀態(tài)，達(dá)到較長(zhǎng)期保藏的目的。此法用于細(xì)菌芽孢或產(chǎn)分生孢子的菌種，是現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中較常用的菌種保藏方法。為了轉(zhuǎn)接方便，控制接種量以及對(duì)菌種的保護(hù)作用，通常將菌種的分生孢子、芽孢，甚至菌絲體吸附于一些載體表面放至干燥容器里進(jìn)行常壓干燥或真空干燥，所用載體有沙土、濾紙、硅膠及大(小)米等。(四)干燥保藏微生物生長(zhǎng)需要水分，干燥法是使菌處于干燥條件151.沙土管法取河(海)沙，過(guò)0.78mm(24目)篩，用10％鹽酸浸泡24h，倒去鹽酸用清水沖洗至pH呈中性，去水烘干或曬干。取菜園或果園土粉碎過(guò)篩，把烘干的沙土按3：2或1：1混合裝入指形管或高100mm，直徑為10mm的小試管中，高約1cm(約2g)，塞棉塞121℃滅菌1h，也可用170℃2h干熱滅菌(或蒸汽三次間歇滅菌)，蒸汽滅菌后需烘干。經(jīng)肉湯檢查確實(shí)證明無(wú)菌即可使用。將要保存的斜面菌種制成濃孢子懸液(≥106/ml)，用滅菌滴管或吸管吸取孢子懸液滴入無(wú)菌沙土上，每管約0.3～0.5ml，用接種環(huán)將其混合均勻。1.沙土管法取河(海)沙，過(guò)0.78mm(24目)篩161.沙土管法也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土中。然后將沙土管抽真空干燥。這時(shí)管內(nèi)砂土松散，表明已干燥。將干燥的砂土管放置在干燥器或密閉容器內(nèi)、干燥器下部放置變色硅膠等干燥劑，于4℃下保存。從斜面取出的孢子放入沙土管中混勻后，可以不抽真空直接放干燥器內(nèi)保存。1.沙土管法也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土171.沙土管法在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐漸減慢，存活下來(lái)的孢子在以后保存期間穩(wěn)定性較好，保藏的有效時(shí)間與菌種存活率的關(guān)系見(jiàn)圖2-10。用沙土管保藏的某些抗生素產(chǎn)生菌保藏期可達(dá)18年(土霉素和鏈霉素產(chǎn)生菌)到22年(新霉素產(chǎn)生菌)，但對(duì)利福霉素、卡那霉素、四環(huán)素等容易產(chǎn)生變異的菌種，就不適合作長(zhǎng)期的沙土管保存。1.沙土管法在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐漸減慢，存活下181.沙土管法1.沙土管法192.濾紙保藏法

本法是將要保藏的微生物細(xì)胞或孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。其方法是濾紙剪成5mm×50mm的小條，放入干燥的培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準(zhǔn)備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中，充分吸附菌細(xì)胞，取出后放入滅菌小試管或安瓿管中，在真空干燥機(jī)上抽干，真空條件下火焰熔封，冷藏。2.濾紙保藏法本法是將要保藏的微生物細(xì)胞或孢子吸附在滅菌濾203.大(小)米保藏法

是根據(jù)我國(guó)制曲原理加以改進(jìn)的一種方法。此法是將曲霉等大量產(chǎn)生孢子的菌直接培養(yǎng)在大(小)米培養(yǎng)基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。

3.大(小)米保藏法是根據(jù)我國(guó)制曲原理加以改進(jìn)的一種方21(五)甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無(wú)菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與等體積菌夜充分混勻，使甘油濃度約為40%，于-20℃下凍存。(五)甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑22(六)真空冷凍干燥法

真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對(duì)病毒、細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母及絲狀菌孢子等各類(lèi)微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長(zhǎng)、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。(六)真空冷凍干燥法真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、23(六)真空冷凍干燥法冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長(zhǎng)和酶活動(dòng)停止。為了防止在冷凍和水分升華過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損害，要采用保護(hù)劑來(lái)制備細(xì)菌懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過(guò)程中起到保護(hù)作用的溶質(zhì)，通過(guò)氫鍵和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。(六)真空冷凍干燥法冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然24(六)真空冷凍干燥法1.冷凍干燥的基本原理

即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達(dá)到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。2.設(shè)備

冷凍干燥備有不同型號(hào)和類(lèi)型，但都由四個(gè)部分組成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為-40～40℃。

(六)真空冷凍干燥法1.冷凍干燥的基本原理25第七章菌種的保藏與復(fù)壯第二章菌種的保藏與復(fù)壯課件26

純化后的桿菌素凍干粉末

純化后的桿菌素凍干粉末27(六)真空冷凍干燥法3.操作方法

(1)安瓿管準(zhǔn)備

選取規(guī)格直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經(jīng)自來(lái)水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；在每管內(nèi)放入打好菌號(hào)及日期的標(biāo)簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。

(六)真空冷凍干燥法3.操作方法28(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑的選擇及制備冷凍干燥保藏法使用的保護(hù)劑種類(lèi)很多，效果不盡相同，通常采用高分子化合物與低分子化合物混合使用效果更好。在配制時(shí)注意比例、濃度、pH和滅菌方法。一些對(duì)熱敏感的保護(hù)劑如血清等用過(guò)濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫脂乳為保護(hù)劑。(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑的選擇及制備冷凍干燥29(六)真空冷凍干燥法(3)菌種準(zhǔn)備及分裝

菌種要求為生長(zhǎng)良好的純種，菌齡以處于穩(wěn)定期為好，孢子是新鮮的。每支長(zhǎng)好的斜面加2～3ml保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基)，制成菌懸液。如用液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數(shù)要求達(dá)到108～1010cfu/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結(jié)。分裝安瓿時(shí)可用滅菌的長(zhǎng)滴管滴入安瓿管底部，裝量可依據(jù)冷凍干燥機(jī)效能而定。

(六)真空冷凍干燥法(3)菌種準(zhǔn)備及分裝菌種要求為生30(六)真空冷凍干燥法(4)預(yù)凍分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍，即放在-30～40℃下凍結(jié)20～60min，也可以用干冰和無(wú)水乙醇凍5～10min。(5)冷凍干燥經(jīng)預(yù)凍的安瓿放入干燥箱中開(kāi)始抽真空干燥。此時(shí)干燥箱溫度控制在-30℃以下，并盡快使真度達(dá)到66Pa以下。此后還可緩慢升溫以加速水分升華，但升溫不宜過(guò)快，以免引起樣品融化。干燥時(shí)間視凍干機(jī)效率、樣品裝量及性質(zhì)等而寂，以樣品最終水分含量達(dá)到1%～3%為準(zhǔn)。具體操作時(shí)是根據(jù)凍干樣品呈酥塊工松散片狀；真空度接近空載時(shí)最高真空；樣品溫度與管外溫度接近。干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封，并用高頻真空檢測(cè)真空度。(六)真空冷凍干燥法(4)預(yù)凍分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍31(六)真空冷凍干燥法(6)保藏及凍干管的啟用密封好的凍干管在4℃或-18℃下保藏。當(dāng)需用凍干菌種時(shí)，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無(wú)菌條件下打開(kāi)，或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻?，迅速滴上冷的無(wú)菌水，使管破裂，然后用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.3～0.5ml液體培養(yǎng)基溶解凍干菌塊成為懸液，用無(wú)菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。(六)真空冷凍干燥法(6)保藏及凍干管的啟用密封好的32(六)真空冷凍干燥法影響真空干燥的幾個(gè)主要因素（1）菌的質(zhì)量保藏的菌種應(yīng)培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的最適條件下，使之進(jìn)入穩(wěn)定期，稍老一些的菌體對(duì)環(huán)境抵抗力強(qiáng)。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細(xì)胞濃度要高，不同的菌對(duì)冷凍干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細(xì)胞濃度不高，就會(huì)使以后傳種造成困難，保存期也會(huì)受到影響。(六)真空冷凍干燥法影響真空干燥的幾個(gè)主要因素33(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑不同種類(lèi)的保護(hù)劑對(duì)不同微生物的作用是不同的，如個(gè)別菌種在脫脂乳作保護(hù)劑的情況下死亡率高達(dá)99.99%，而采用葡聚糖等混和保護(hù)劑時(shí)死亡率大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求不很?chē)?yán)格，而不易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護(hù)劑是冷凍干燥保存菌種的關(guān)鍵因素。(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑不同種類(lèi)的保護(hù)劑對(duì)不34(六)真空冷凍干燥法（3）干燥速度實(shí)驗(yàn)表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。（4）空氣的影響

冷凍干燥后空氣對(duì)細(xì)菌細(xì)胞影響較大，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷進(jìn)而死亡，故在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長(zhǎng)期保存。

(六)真空冷凍干燥法（3）干燥速度實(shí)驗(yàn)表明，慢速干燥35(5)溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠(yuǎn)沒(méi)有上述幾項(xiàng)因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。(6)含水量的影響

水分含量過(guò)高對(duì)菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。

(六)真空冷凍干燥法(5)溫度的影響(六)真空冷凍干燥法36(六)真空冷凍干燥法(7)復(fù)蘇培養(yǎng)打開(kāi)安瓿管后加入無(wú)菌水使凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌種能否適宜于凍干保存，需經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明，一般是在保存1個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，以后6個(gè)月、2年、5年、10年再進(jìn)行檢查存活情況，以確定保存期的上限。凍干保藏的效果因微生物種類(lèi)而異，一般是細(xì)菌＞放線(xiàn)菌＞真菌＞藻類(lèi)，而菌絲體不宜用此法保存。(六)真空冷凍干燥法(7)復(fù)蘇培養(yǎng)打開(kāi)安瓿管后加入無(wú)37(七)液氮超低溫保存

本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類(lèi)和原蟲(chóng)，特別是一些無(wú)法用凍干保存的微生物，都可用此法長(zhǎng)期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下溫度時(shí)，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達(dá)-196℃，在這種情況下可以長(zhǎng)期保存。

(七)液氮超低溫保存本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法38第七章菌種的保藏與復(fù)壯第二章菌種的保藏與復(fù)壯課件39(七)液氮超低溫保存1.保護(hù)劑與冷凍干燥保存一樣，液氮保存菌種也需要有保護(hù)物質(zhì)，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌對(duì)甘油敏感，效果不佳，可選用其他保護(hù)劑，常用的有5%～10%(V/V)二甲基亞砜；20%二甲亞砜加1%蛋白陳；吐溫80等，糖類(lèi)也可作為一種保護(hù)劑，但濃度適當(dāng)加以控制。(七)液氮超低溫保存1.保護(hù)劑與冷凍干燥保存一樣，40(七)液氮超低溫保存2.操作程序(1)安瓿管強(qiáng)度要高，以能承受巨大的溫差變化而不破損，大小根據(jù)需要而定。在管壁上書(shū)寫(xiě)菌號(hào)，160℃烘干，加棉塞滅菌備用。(2)菌種準(zhǔn)備在最適培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)得到健壯菌種，制成懸浮液，如為不產(chǎn)孢子的真菌，則采用斜面或液體振蕩培養(yǎng)，制成菌絲片段。將菌懸液分裝至滅菌安瓿管中，每管0.2～0.5ml，然后用火焰將安瓿熔封。(七)液氮超低溫保存2.操作程序41(七)液氮超低溫保存3)凍結(jié)將熔封后的安瓿管放入慢速凍結(jié)器內(nèi)，以每分鐘下降1℃的速度冷凍，當(dāng)安瓿管溫度下降至-35℃時(shí)，即可把安瓿管移入液氮內(nèi)作長(zhǎng)期保藏。(4)菌種的復(fù)蘇培養(yǎng)等菌液全部溶化為止，當(dāng)溶化后即開(kāi)啟安瓿瓶并移至培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，操作時(shí)應(yīng)特別注意安全，防止爆炸或凍傷，不宜戴線(xiàn)手套，要戴皮手套操作。(七)液氮超低溫保存3)凍結(jié)將熔封后的安瓿管放入慢速42第七章菌種的保藏與復(fù)壯第二章菌種的保藏與復(fù)壯課件43二、菌種的提純與復(fù)壯(一)菌種的提純(二)通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯

(三)淘汰已衰退的個(gè)體

二、菌種的提純與復(fù)壯(一)菌種的提純44(一)菌種的提純即從已衰退的菌種中，通過(guò)分離純化，將尚未退化的個(gè)體分離出來(lái)，以恢復(fù)和建立具有原來(lái)生產(chǎn)性狀的群體，繼續(xù)供科研及生產(chǎn)使用。菌種提純：一是只要求達(dá)到菌落純化的水平，通過(guò)稀釋平板法、劃線(xiàn)法、表面涂布法等常規(guī)操作法，該方法較為粗放，適用于菌退化不太嚴(yán)重的情況。另一類(lèi)方法，可達(dá)到“細(xì)胞純”的水平，采用單胞分離法，也可以二者結(jié)合，先用前一種方法獲得較純的菌種后再采用單胞分離法進(jìn)一步純化。(一)菌種的提純即從已衰退的菌種中，通過(guò)分離純化，將尚未退45(二)通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯

對(duì)于寄生性的退化菌株,可回接到相應(yīng)寄主體上,以恢復(fù)或提高其寄生性能。例如,根瘤菌屬經(jīng)人工移接,結(jié)瘤固氮能力減退,將其回接到相應(yīng)豆科寄主植物上,令其侵染結(jié)瘤,再?gòu)母鲋蟹蛛x出根瘤菌,其結(jié)瘤固氮性能就可恢復(fù)甚至提高。

(二)通過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯對(duì)于寄生性的退化菌株,可回接到相46(三)淘汰已衰退的個(gè)體

通過(guò)物理、化學(xué)的方法處理菌體(或孢子)，使大部分死亡(80%以上)，存活的菌多為生長(zhǎng)健壯者，可從中選出優(yōu)良菌種來(lái)。(三)淘汰已衰退的個(gè)體

通過(guò)物理、化學(xué)的方法處理菌體(或孢47

三、菌種保藏機(jī)構(gòu)

（一）國(guó)內(nèi)1978年7月，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM）在北京成立。三、菌種保藏機(jī)構(gòu)

（一）國(guó)內(nèi)1978年48下設(shè)六個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心1.普通微生物菌種保藏管理中心中科院微生物研究所：細(xì)菌、真菌中科院武漢病毒研究所：病毒2.農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心中國(guó)農(nóng)科院3.工業(yè)微生物菌種保藏管理中心輕工部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所下設(shè)六個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心494.醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心衛(wèi)生部藥品生物檢定所：細(xì)菌中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所：真菌中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所：病毒5.抗生素菌種保藏管理中心國(guó)家醫(yī)藥總局四川抗生素研究所：新抗生素菌種華北制藥廠抗生素研究所：生產(chǎn)用抗生素菌種6.獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所4.醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心50（二）國(guó)外1.國(guó)際性機(jī)構(gòu)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)（WFCC）2.美國(guó)美國(guó)典型菌種收藏館（ATCC）農(nóng)業(yè)研究服務(wù)處菌種收藏館（ARS）（二）國(guó)外1.國(guó)際性機(jī)構(gòu)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)（WFCC）2.513.荷蘭真菌中心保藏所（CBS）4.英國(guó)國(guó)立典型菌種收藏館（NCTC）英聯(lián)邦真菌研究所（CMI）國(guó)立工業(yè)細(xì)菌收藏所（NCIB）3.荷蘭真菌中心保藏所（CBS）4.英國(guó)國(guó)立典型菌種收藏525.日本日本微生物菌種保藏聯(lián)合會(huì)（JFCC）東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（TAM）大阪發(fā)酵研究所（IFO）6.西德發(fā)酵工業(yè)研究所微生物收藏館（MIC）5.日本日本微生物菌種保藏聯(lián)合會(huì)（JFCC）6.西德發(fā)酵53第八章菌種的保藏與復(fù)壯菌種衰退的基本原因是變異，變異是不可避免的，而減緩變異速度則是可能的。變異速度與菌種所處的環(huán)境有密切的關(guān)系，不良環(huán)境條件能促進(jìn)變異，頻繁或過(guò)多傳代也是造成衰退變異的重要原因。為菌種創(chuàng)造良好條件，減緩菌種衰退，這就是菌種保藏與復(fù)壯工作。第八章菌種的保藏與復(fù)壯菌種衰退的基本原54衰退：菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱(chēng)為菌種的衰退。衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。衰退：55常見(jiàn)的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降；常見(jiàn)的衰退現(xiàn)象：56防止菌種衰退的方法：

合理育種；合適的培養(yǎng)基；

選擇合適的培養(yǎng)條件；控制傳代次數(shù)；

利用不易衰退的細(xì)胞傳代；采用有效的菌種保藏方法。防止菌種衰退的方法：

合理育種；57第八章菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏

二、菌種的提純與復(fù)壯三、菌種保藏機(jī)構(gòu)第八章菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種保藏

58一、菌種保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不同。工業(yè)微生物菌種保藏，是要使菌種生產(chǎn)能力和與生產(chǎn)工藝相適應(yīng)的優(yōu)良性狀保持穩(wěn)定，當(dāng)然做不到絕對(duì)不變，只是力求把這種衰退現(xiàn)象推遲減緩到最低限度。一、菌種保藏工業(yè)微生物菌種保藏與其他目的的菌種保藏要求有所不59菌種保藏菌種保藏有許多的方法，其共同的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良性狀保存下來(lái)，防止退化、死亡或雜菌污染。保藏的一般程序是選取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，在其休眠和停止生長(zhǎng)的條件下保藏。微生物生長(zhǎng)要求適宜的溫度、水分、空氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，如將菌種處于低溫、干燥、無(wú)氧和缺乏營(yíng)養(yǎng)的條件下，就可以使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài)。菌種保藏菌種保藏有許多的方法，其共同的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良性狀60菌種保藏其中低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一種簡(jiǎn)單易行的方法。在作低溫保藏時(shí)，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時(shí)，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細(xì)胞水分外滲而大量脫水，可能使細(xì)胞死亡。如快速降溫，胞內(nèi)也很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時(shí)胞內(nèi)冰晶較小，對(duì)細(xì)胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，菌株不易死亡，影響也較小。與低溫相關(guān)的保藏方法，如冷凍干燥法、超低溫保藏法等，都是利用低溫條件下細(xì)胞與環(huán)境的特殊平衡原理而設(shè)計(jì)的。菌種保藏其中低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一61一、菌種保藏(一)低溫保藏法

(二)低溫定期移植法

(三)石蠟油低溫保藏法

(四)干燥保藏

(五)甘油管保藏法(六)真空冷凍干燥法

(七)液氮超低溫保存

現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:一、菌種保藏(一)低溫保藏法現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:62(一)低溫保藏法

這是一種常用的簡(jiǎn)便方法。一般的斜面孢子、液態(tài)孢子、斜面種子以及用麩皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4℃冰箱內(nèi)保藏，這種溫度條件下不能使菌體進(jìn)入休眠，而僅是抑制微生物的生命活動(dòng)。因此，保藏時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)1～2個(gè)月為宜。本方法雖然簡(jiǎn)便，但由于菌株處于較高的水平活性下，這對(duì)保藏株的生產(chǎn)性狀是不利的，因此，生產(chǎn)菌種一般不采用此法保藏。(一)低溫保藏法這是一種常用的簡(jiǎn)便方法。一般的斜面孢子、液63(二)低溫定期移植法

把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，定期移植，一般3～6個(gè)月移植一次(視菌種特征而定)。也可以用穿刺培養(yǎng)，定期移植法保藏細(xì)菌，其效果也較好。穿刺培養(yǎng)是將含0.6％～0.8％的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌后直立冷凝后，用接種針尖挑取少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)好后即可放低溫保存，此法較斜面保存有利，大腸桿菌可保藏2年以上不發(fā)生明顯變異。(二)低溫定期移植法把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，64(二)低溫定期移植法斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷，即容易發(fā)生遺傳變異；連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱，也易于污染雜菌，培養(yǎng)基干枯。因此，一些貴重菌株及生產(chǎn)優(yōu)良菌株不宜用此法保藏。(二)低溫定期移植法斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷，即65(三)石蠟油低溫保藏法

本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長(zhǎng)和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長(zhǎng)期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。不宜用于能利用石蠟為碳源的微生物。(三)石蠟油低溫保藏法本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅66(三)石蠟油低溫保藏法具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過(guò)長(zhǎng)；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過(guò)121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時(shí)滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm左右為宜。普通冰箱保藏。(三)石蠟油低溫保藏法具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不67(四)干燥保藏

微生物生長(zhǎng)需要水分，干燥法是使菌處于干燥條件下停止生長(zhǎng)及處于休眠狀態(tài)，達(dá)到較長(zhǎng)期保藏的目的。此法用于細(xì)菌芽孢或產(chǎn)分生孢子的菌種，是現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中較常用的菌種保藏方法。為了轉(zhuǎn)接方便，控制接種量以及對(duì)菌種的保護(hù)作用，通常將菌種的分生孢子、芽孢，甚至菌絲體吸附于一些載體表面放至干燥容器里進(jìn)行常壓干燥或真空干燥，所用載體有沙土、濾紙、硅膠及大(小)米等。(四)干燥保藏微生物生長(zhǎng)需要水分，干燥法是使菌處于干燥條件681.沙土管法取河(海)沙，過(guò)0.78mm(24目)篩，用10％鹽酸浸泡24h，倒去鹽酸用清水沖洗至pH呈中性，去水烘干或曬干。取菜園或果園土粉碎過(guò)篩，把烘干的沙土按3：2或1：1混合裝入指形管或高100mm，直徑為10mm的小試管中，高約1cm(約2g)，塞棉塞121℃滅菌1h，也可用170℃2h干熱滅菌(或蒸汽三次間歇滅菌)，蒸汽滅菌后需烘干。經(jīng)肉湯檢查確實(shí)證明無(wú)菌即可使用。將要保存的斜面菌種制成濃孢子懸液(≥106/ml)，用滅菌滴管或吸管吸取孢子懸液滴入無(wú)菌沙土上，每管約0.3～0.5ml，用接種環(huán)將其混合均勻。1.沙土管法取河(海)沙，過(guò)0.78mm(24目)篩691.沙土管法也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土中。然后將沙土管抽真空干燥。這時(shí)管內(nèi)砂土松散，表明已干燥。將干燥的砂土管放置在干燥器或密閉容器內(nèi)、干燥器下部放置變色硅膠等干燥劑，于4℃下保存。從斜面取出的孢子放入沙土管中混勻后，可以不抽真空直接放干燥器內(nèi)保存。1.沙土管法也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土701.沙土管法在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐漸減慢，存活下來(lái)的孢子在以后保存期間穩(wěn)定性較好，保藏的有效時(shí)間與菌種存活率的關(guān)系見(jiàn)圖2-10。用沙土管保藏的某些抗生素產(chǎn)生菌保藏期可達(dá)18年(土霉素和鏈霉素產(chǎn)生菌)到22年(新霉素產(chǎn)生菌)，但對(duì)利福霉素、卡那霉素、四環(huán)素等容易產(chǎn)生變異的菌種，就不適合作長(zhǎng)期的沙土管保存。1.沙土管法在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐漸減慢，存活下711.沙土管法1.沙土管法722.濾紙保藏法

本法是將要保藏的微生物細(xì)胞或孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。其方法是濾紙剪成5mm×50mm的小條，放入干燥的培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準(zhǔn)備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中，充分吸附菌細(xì)胞，取出后放入滅菌小試管或安瓿管中，在真空干燥機(jī)上抽干，真空條件下火焰熔封，冷藏。2.濾紙保藏法本法是將要保藏的微生物細(xì)胞或孢子吸附在滅菌濾733.大(小)米保藏法

是根據(jù)我國(guó)制曲原理加以改進(jìn)的一種方法。此法是將曲霉等大量產(chǎn)生孢子的菌直接培養(yǎng)在大(小)米培養(yǎng)基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。

3.大(小)米保藏法是根據(jù)我國(guó)制曲原理加以改進(jìn)的一種方74(五)甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無(wú)菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與等體積菌夜充分混勻，使甘油濃度約為40%，于-20℃下凍存。(五)甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑75(六)真空冷凍干燥法

真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對(duì)病毒、細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母及絲狀菌孢子等各類(lèi)微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長(zhǎng)、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。(六)真空冷凍干燥法真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、76(六)真空冷凍干燥法冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長(zhǎng)和酶活動(dòng)停止。為了防止在冷凍和水分升華過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損害，要采用保護(hù)劑來(lái)制備細(xì)菌懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過(guò)程中起到保護(hù)作用的溶質(zhì)，通過(guò)氫鍵和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。(六)真空冷凍干燥法冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然77(六)真空冷凍干燥法1.冷凍干燥的基本原理

即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達(dá)到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。2.設(shè)備

冷凍干燥備有不同型號(hào)和類(lèi)型，但都由四個(gè)部分組成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為-40～40℃。

(六)真空冷凍干燥法1.冷凍干燥的基本原理78第七章菌種的保藏與復(fù)壯第二章菌種的保藏與復(fù)壯課件79

純化后的桿菌素凍干粉末

純化后的桿菌素凍干粉末80(六)真空冷凍干燥法3.操作方法

(1)安瓿管準(zhǔn)備

選取規(guī)格直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經(jīng)自來(lái)水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；在每管內(nèi)放入打好菌號(hào)及日期的標(biāo)簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。

(六)真空冷凍干燥法3.操作方法81(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑的選擇及制備冷凍干燥保藏法使用的保護(hù)劑種類(lèi)很多，效果不盡相同，通常采用高分子化合物與低分子化合物混合使用效果更好。在配制時(shí)注意比例、濃度、pH和滅菌方法。一些對(duì)熱敏感的保護(hù)劑如血清等用過(guò)濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫脂乳為保護(hù)劑。(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑的選擇及制備冷凍干燥82(六)真空冷凍干燥法(3)菌種準(zhǔn)備及分裝

菌種要求為生長(zhǎng)良好的純種，菌齡以處于穩(wěn)定期為好，孢子是新鮮的。每支長(zhǎng)好的斜面加2～3ml保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基)，制成菌懸液。如用液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數(shù)要求達(dá)到108～1010cfu/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結(jié)。分裝安瓿時(shí)可用滅菌的長(zhǎng)滴管滴入安瓿管底部，裝量可依據(jù)冷凍干燥機(jī)效能而定。

(六)真空冷凍干燥法(3)菌種準(zhǔn)備及分裝菌種要求為生83(六)真空冷凍干燥法(4)預(yù)凍分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍，即放在-30～40℃下凍結(jié)20～60min，也可以用干冰和無(wú)水乙醇凍5～10min。(5)冷凍干燥經(jīng)預(yù)凍的安瓿放入干燥箱中開(kāi)始抽真空干燥。此時(shí)干燥箱溫度控制在-30℃以下，并盡快使真度達(dá)到66Pa以下。此后還可緩慢升溫以加速水分升華，但升溫不宜過(guò)快，以免引起樣品融化。干燥時(shí)間視凍干機(jī)效率、樣品裝量及性質(zhì)等而寂，以樣品最終水分含量達(dá)到1%～3%為準(zhǔn)。具體操作時(shí)是根據(jù)凍干樣品呈酥塊工松散片狀；真空度接近空載時(shí)最高真空；樣品溫度與管外溫度接近。干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封，并用高頻真空檢測(cè)真空度。(六)真空冷凍干燥法(4)預(yù)凍分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍84(六)真空冷凍干燥法(6)保藏及凍干管的啟用密封好的凍干管在4℃或-18℃下保藏。當(dāng)需用凍干菌種時(shí)，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無(wú)菌條件下打開(kāi)，或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻?，迅速滴上冷的無(wú)菌水，使管破裂，然后用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.3～0.5ml液體培養(yǎng)基溶解凍干菌塊成為懸液，用無(wú)菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。(六)真空冷凍干燥法(6)保藏及凍干管的啟用密封好的85(六)真空冷凍干燥法影響真空干燥的幾個(gè)主要因素（1）菌的質(zhì)量保藏的菌種應(yīng)培養(yǎng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的最適條件下，使之進(jìn)入穩(wěn)定期，稍老一些的菌體對(duì)環(huán)境抵抗力強(qiáng)。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細(xì)胞濃度要高，不同的菌對(duì)冷凍干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細(xì)胞濃度不高，就會(huì)使以后傳種造成困難，保存期也會(huì)受到影響。(六)真空冷凍干燥法影響真空干燥的幾個(gè)主要因素86(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑不同種類(lèi)的保護(hù)劑對(duì)不同微生物的作用是不同的，如個(gè)別菌種在脫脂乳作保護(hù)劑的情況下死亡率高達(dá)99.99%，而采用葡聚糖等混和保護(hù)劑時(shí)死亡率大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求不很?chē)?yán)格，而不易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護(hù)劑是冷凍干燥保存菌種的關(guān)鍵因素。(六)真空冷凍干燥法(2)保護(hù)劑不同種類(lèi)的保護(hù)劑對(duì)不87(六)真空冷凍干燥法（3）干燥速度實(shí)驗(yàn)表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。（4）空氣的影響

冷凍干燥后空氣對(duì)細(xì)菌細(xì)胞影響較大，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷進(jìn)而死亡，故在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長(zhǎng)期保存。

(六)真空冷凍干燥法（3）干燥速度實(shí)驗(yàn)表明，慢速干燥88(5)溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠(yuǎn)沒(méi)有上述幾項(xiàng)因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。(6)含水量的影響

水分含量過(guò)高對(duì)菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。

(六)真空冷凍干燥法(5)溫度的影響(六)真空冷凍干燥法89(六)真空冷凍干燥法(7)復(fù)蘇培養(yǎng)打開(kāi)安瓿管后加入無(wú)菌水使凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌種能否適宜于凍干保存，需經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明，一般是在保存1個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，以后6個(gè)月、2年、5年、10年再進(jìn)行檢查存活情況，以確定保存期的上限。凍干保藏的效果因微生物種類(lèi)而異，一般是細(xì)菌＞放線(xiàn)菌＞真菌＞藻類(lèi)，而菌絲體不宜用此法保存。(六)真空冷凍干燥法(7)復(fù)蘇培養(yǎng)打開(kāi)安瓿管后加入無(wú)90(七)液氮超低溫保存

本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類(lèi)和原蟲(chóng)，特別是一些無(wú)法用凍干保存的微生物，都可用此法長(zhǎng)期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下溫度時(shí)，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達(dá)-196℃，在這種情況下可以長(zhǎng)期保存。

(七)液氮超低溫保存本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法91第七章菌種的保藏與復(fù)壯第二章菌種的保藏與復(fù)壯課件92(七)液氮超低溫保存1.保護(hù)劑與冷凍干燥保存一樣，液氮保存菌種也需要有保護(hù)物質(zhì)，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌對(duì)甘油敏感，效果不佳，可選用其他保護(hù)劑，常用的有5%～10%(V/V)二甲基亞砜；20%二甲亞砜加1%蛋白陳；吐溫80等，糖類(lèi)也可作為一種保護(hù)劑，但濃度適當(dāng)加以控制。(七)液氮超低溫保存1.保護(hù)劑與冷凍干燥保存一樣，93(七)液氮超低溫保存2.操作程序(1)安瓿管強(qiáng)度要高，以能承