報告人：王浩丞2012年4月26日

用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法 用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法1主要內(nèi)容DNA-DNA雜交16SrDNA在細菌分類鑒定的應(yīng)用幾種“看家基因”（Housekeepinggenes）在細菌分類鑒定的應(yīng)用主要內(nèi)容DNA-DNA雜交2DNA-DNA雜交現(xiàn)代細菌分類學中，DNA-DNA分子雜交一直認為是作為細菌分類和鑒定的“黃金法則”?；驹恚菏褂肈NA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的DNA在體外變性（高溫或pH)，并在合適的條件下(鹽類濃度和溫度），使互補的堿基重新配對，測量雜交百分數(shù)(常以同源%表示；也有稱堿基相似性%）百分數(shù)越高，雜交的兩種DNA之間堿基線性序列的相似性就越高，說明它們之間的親緣關(guān)系也就越近。

常見的幾種方法：（1）標記法（2）吸光度法（3）熒光強度法等DNA-DNA雜交現(xiàn)代細菌分類學中，DNA-D3DNA-DNA雜交核酸雜交目前常采用固相雜交法，將待測菌株雙鏈核酸解成單鏈固定在硝酸纖維素濾膜等固相支持物上，置入含有經(jīng)標記的并解鏈的參照菌株的單鏈核酸(探針)液中復性，形成新的雙鏈核酸，測定雜合雙鏈的相對放射性強度來確定菌株問的同源性程度。計算公式：DNA-DNA雜交核酸雜交目前常采用固相雜交法，4結(jié)果的判定：一般認為核酸雜交同源性小于20％為不同菌屬，20％～60％為屬內(nèi)緊密相關(guān)的種，60％～70％為同種內(nèi)不同亞種，大于70％為同一亞種。DNA-DNA雜交結(jié)果的判定：一般認為核酸雜交同源性小于DNA-DNA雜交516SrDNA在細菌分類鑒定的應(yīng)用

細菌核糖體的RNA含有3種類型，即23srRNA、16SrRNA和5SrRNA，它們含有的核苷酸分別約為2900個，1540個和120個。20世紀60年代末，Woese等學者開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細胞的rRNA特征序列，認為16srRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。其主要依據(jù)為，它們?yōu)榧毎灿?，其功能同源且最為古老，既含有保守序列又含可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進化距離相適應(yīng)。16s

rRNA和16s

rDNA的區(qū)別：16S中的"S"是一個沉降系數(shù)，亦即反映生物大分子在離心場中向下沉降速度的一個指標，值越高，說明分子越大。rDNA和rRNA中的小寫字母"r"是ribosome(核糖體)的縮寫。rDNA指的是基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對應(yīng)的DNA序列，也就是編碼16SrRNA的基因。rRNA指的是rDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它是構(gòu)成核糖體的重要成分，核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成，16SrDNA在細菌分類鑒定的應(yīng)用

細菌核糖體6其序列包含10個可變區(qū)（variableregion）和11個恒定區(qū)（constantregion），其中V1、V2、V3和V4共4個高變區(qū)，尤其是V2這一高變區(qū)，由于其進化速度相對較快，其中所包含的信息，足夠用于物種屬及屬以上分類單位的比較分析。因此，JohesSW和NellerHF等報道測定16SrDNA基因的部分序列即可達到鑒定的目的16SrRNA基因結(jié)構(gòu)圖其序列包含10個可變區(qū)（variableregion）和7第一，由于16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量較少，對于親緣關(guān)系較近的細菌，其分辨率不高。第二，16SrDNA序列分析只能在屬的水平上區(qū)分細菌，而在水平分類這個環(huán)節(jié)上仍然需要借助其他手段加以輔助分析。16srRNA序列和DNA-DNA同源性相關(guān)關(guān)系的研究表明:序列的相性不在99.8%以上就不能達到70%以上DNA-DNA的同源性。16srRNA總共約有1500bp,0.2%的不同相當于3個堿基。由于數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)不一定完全而且個人讀取數(shù)據(jù)也可能出現(xiàn)錯讀,因此由16srRNA序列鑒定種是很難的。16srRNA的同源性分析最適用于屬及屬以上的遠緣關(guān)系。目前,已對2000種(約相當于50%)以上的真細菌的16srRNA進行了測序,不同菌屬的16srRNA序列同源性為70%～95%,第一，由于16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的8細菌核心基因（看家基因）雖然說細菌的基因組的大小和基因段是千差萬別，但是無論多么小，它們必須包含有所有的信息去允許細菌去執(zhí)行多種必要的功能，給予細胞維持內(nèi)部的代謝平衡的能力，復制和進化，這三種主要的活細胞的功能。細胞經(jīng)常能夠吸收代謝物但其不是功能蛋白，因此，它們必須去依賴它們自有的基因產(chǎn)物去執(zhí)行不要的功能。

細菌核心基因（看家基因）91.信息的存儲和加工DNA的代謝：（1）基本的復制功能（2）DNA的修復、限制和修飾RNA的代謝：（1）基本的轉(zhuǎn)運功能（2）翻譯（3）

RNA的降解2蛋白質(zhì)的加工、折疊、分泌3細胞的結(jié)構(gòu)和細胞壁的加工4活躍且處于中間的代謝1.信息的存儲和加工10gyrB基因gyrB基因是普遍存在于細菌內(nèi)編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，屬于信息通路中與DNA復制、限制、修飾或修復有關(guān)的蛋白編碼基因。在大多數(shù)細菌中，以單拷貝的形式存在細菌基因組的rnpA—rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。編碼的是唯一一種能誘導DNA負超螺旋的拓撲異構(gòu)酶一DNA促旋酶的B亞單位蛋白GyrB。

gyrB基因gyrB基因是普遍存在于細菌內(nèi)編碼DNA促旋酶中11DNA促旋酶是一種細菌Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶，在DNA復制及DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的維持過程中起著重要的作用。（1）gyrB基因序列全長約為1．2—1．4kb，平均堿基替換率為每100萬年變化0．7％~0．8％，比16SrDNA的每5000萬年變化1％的速度快。（2）由于其作為蛋白編碼基因，其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，尤其是密碼子的第3位堿基，這就使得gyrB基因序列在區(qū)分和鑒定細菌近緣種方面，比非蛋白編碼基因16SrDNA具有更高的分辨率。DNA促旋酶是一種細菌Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶，在DNA復制及DNA超12Kasai在對小單孢菌屬(Micromonospora)15個有效描述的種和4個亞種的gyrB序列的研究中，得到了與基于16SrDNA序列相似的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但種內(nèi)關(guān)系結(jié)果不同。經(jīng)過與DNA—DNA雜交的比較分析，結(jié)果表明：基于gyrB序列的分類關(guān)系更符合DNA—DNA雜交結(jié)果。Daug在利用gyrB基因比較腸桿菌科(Enterobacteriaceae)不同屬的系統(tǒng)進化關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，與16SrRNA相比，gyrB序列比較適用于屬內(nèi)或?qū)匍g關(guān)系的比較分析。Kasai在對小單孢菌屬(Micromonospora)1513Soler等用gyrB和rpoD序列分析氣單胞菌屬(Aeromonas)的系統(tǒng)發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，這2個基因具有相同的置換率(小于2％)和相似的變異位點(分別為34％和32％)，分別用gyrB、rpoD或結(jié)合這2個基因的序列分析的結(jié)果均與已有分類結(jié)果一致。在種內(nèi)水平上，gyrB對相近的種具有很高的分辨率，rpoD能把混雜在一起的種區(qū)分開來，綜合這2個基因的序列分析能更好地區(qū)分相近的分類單元。Wang等對枯草芽孢桿菌屬的16SrRNA基因、gyrB基因序列和DNA–DNAhybridization比較發(fā)現(xiàn)，gyrB基因序列的相似性在75.4%~95%之間，而且結(jié)果與DNA–DNAhybridization的一致性很高。Soler等用gyrB和rpoD序列分析氣單胞菌屬(Aero14rpoB:核糖核酸聚合酶是在所有的生物體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄以及最終的目標是控制基因表達的調(diào)控路徑。rpoB基因編碼五個亞單位中的一種，β亞單位基因所編碼的。rpoB基因已經(jīng)用于在臨床微生物中的細菌的分子鑒定,它是細菌的一個核心基因。其可變區(qū)域位于2300bp到3300bp之間，sodA基因,其具有錳的金屬依賴性依賴。超氧化物歧化酶歧化酶（編碼超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶可以催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)產(chǎn)生氧分子和過氧化氫。groEL:編碼一種熱休克蛋白60Kda。recN:編碼一個重組修復蛋白多種看家基因的用于進化分析的比較rpoB:核糖核酸聚合酶是在所有的生物體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄以及最終的目1516Srrna：1468~1478bpsodA:435bprpoB:680BPgyrB

；458bpgroEL:757bpPartialsequencecomparisonoftherpoB,sodA,groELandgyrBgeneswithinthegenusStreptococcusPartialrecNgenesequencing:anewtoolforidentificationandphylogenywithinthegenusStreptococcusOlgaO.Glazunova,DidierRaoultandVe′roniqueRoux研究了65株鏈球菌（其中有58個種和9個亞種）16Srrna：1468~1478bp16在不同種的細菌類型中，16SrRNA的基因序列的相似性是88.8%到99.7%之間，sodA基因的序列相似性是63.6%到100%，ropB序列的相似性是在76.1%到97.6%之間。gyrB基因序列的相似性是在64.6%到97.5%之間，groEL的序列相似性是在72.6%到96.6%。recN基因序列的相似性是從56.4%到98.2%之間16SrRNA序列相似性在兩種亞種之間是從97.6%到99.9%。sodA基因的序列相似性是88%到98.9%，ropB序列的相似性是在97.95到99.6%之間。gyrB基因序列的相似性是在93.7%到98.5%之間，groEL的序列相似性是在93.9%到98.8%。recN基因序列的相似性是從98%到89.8%之間.在不同種的細菌類型中，16SrRNA的基因序列的相似性是8817NucleotidesequencesimilaritiesbetweenspeciesanddivergencebetweensubspeciesofthegenusStreptococcusNucleotidesequencesimilariti18recNrepresentsthebesttooltoidentifystreptococciandtostudyevolutioninthisgroupofbacteria。recNrepresentsthebesttool19系統(tǒng)發(fā)育分析和分子鑒定不用當僅僅基于一個所推薦的基因因為可能的基因復制、側(cè)面基因的轉(zhuǎn)移或者缺失，可能導致錯誤的結(jié)果，16Srna的基因的部分測序時細菌種類鑒定的第一步，它能夠從屬的水平和新種類的識別中鑒定出分離株和已公認的菌株(Stackebrandtetal，2002）系統(tǒng)發(fā)育分析和分子鑒定不用當僅僅基于一個所推薦的20

謝謝大家！

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報告人：王浩丞2012年4月26日

用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法 用于細菌鑒定和分類的分子生物學方法22主要內(nèi)容DNA-DNA雜交16SrDNA在細菌分類鑒定的應(yīng)用幾種“看家基因”（Housekeepinggenes）在細菌分類鑒定的應(yīng)用主要內(nèi)容DNA-DNA雜交23DNA-DNA雜交現(xiàn)代細菌分類學中，DNA-DNA分子雜交一直認為是作為細菌分類和鑒定的“黃金法則”?；驹恚菏褂肈NA解鏈的可逆性和堿基配對的專一性，將不同來源的DNA在體外變性（高溫或pH)，并在合適的條件下(鹽類濃度和溫度），使互補的堿基重新配對，測量雜交百分數(shù)(常以同源%表示；也有稱堿基相似性%）百分數(shù)越高，雜交的兩種DNA之間堿基線性序列的相似性就越高，說明它們之間的親緣關(guān)系也就越近。

常見的幾種方法：（1）標記法（2）吸光度法（3）熒光強度法等DNA-DNA雜交現(xiàn)代細菌分類學中，DNA-D24DNA-DNA雜交核酸雜交目前常采用固相雜交法，將待測菌株雙鏈核酸解成單鏈固定在硝酸纖維素濾膜等固相支持物上，置入含有經(jīng)標記的并解鏈的參照菌株的單鏈核酸(探針)液中復性，形成新的雙鏈核酸，測定雜合雙鏈的相對放射性強度來確定菌株問的同源性程度。計算公式：DNA-DNA雜交核酸雜交目前常采用固相雜交法，25結(jié)果的判定：一般認為核酸雜交同源性小于20％為不同菌屬，20％～60％為屬內(nèi)緊密相關(guān)的種，60％～70％為同種內(nèi)不同亞種，大于70％為同一亞種。DNA-DNA雜交結(jié)果的判定：一般認為核酸雜交同源性小于DNA-DNA雜交2616SrDNA在細菌分類鑒定的應(yīng)用

細菌核糖體的RNA含有3種類型，即23srRNA、16SrRNA和5SrRNA，它們含有的核苷酸分別約為2900個，1540個和120個。20世紀60年代末，Woese等學者開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細胞的rRNA特征序列，認為16srRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標最為合適。其主要依據(jù)為，它們?yōu)榧毎灿?，其功能同源且最為古老，既含有保守序列又含可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進化距離相適應(yīng)。16s

rRNA和16s

rDNA的區(qū)別：16S中的"S"是一個沉降系數(shù)，亦即反映生物大分子在離心場中向下沉降速度的一個指標，值越高，說明分子越大。rDNA和rRNA中的小寫字母"r"是ribosome(核糖體)的縮寫。rDNA指的是基因組中編碼核糖體RNA（rRNA）分子的對應(yīng)的DNA序列，也就是編碼16SrRNA的基因。rRNA指的是rDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它是構(gòu)成核糖體的重要成分，核糖體由許多小的rRNA分子組裝而成，16SrDNA在細菌分類鑒定的應(yīng)用

細菌核糖體27其序列包含10個可變區(qū)（variableregion）和11個恒定區(qū)（constantregion），其中V1、V2、V3和V4共4個高變區(qū)，尤其是V2這一高變區(qū)，由于其進化速度相對較快，其中所包含的信息，足夠用于物種屬及屬以上分類單位的比較分析。因此，JohesSW和NellerHF等報道測定16SrDNA基因的部分序列即可達到鑒定的目的16SrRNA基因結(jié)構(gòu)圖其序列包含10個可變區(qū)（variableregion）和28第一，由于16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量較少，對于親緣關(guān)系較近的細菌，其分辨率不高。第二，16SrDNA序列分析只能在屬的水平上區(qū)分細菌，而在水平分類這個環(huán)節(jié)上仍然需要借助其他手段加以輔助分析。16srRNA序列和DNA-DNA同源性相關(guān)關(guān)系的研究表明:序列的相性不在99.8%以上就不能達到70%以上DNA-DNA的同源性。16srRNA總共約有1500bp,0.2%的不同相當于3個堿基。由于數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)不一定完全而且個人讀取數(shù)據(jù)也可能出現(xiàn)錯讀,因此由16srRNA序列鑒定種是很難的。16srRNA的同源性分析最適用于屬及屬以上的遠緣關(guān)系。目前,已對2000種(約相當于50%)以上的真細菌的16srRNA進行了測序,不同菌屬的16srRNA序列同源性為70%～95%,第一，由于16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的29細菌核心基因（看家基因）雖然說細菌的基因組的大小和基因段是千差萬別，但是無論多么小，它們必須包含有所有的信息去允許細菌去執(zhí)行多種必要的功能，給予細胞維持內(nèi)部的代謝平衡的能力，復制和進化，這三種主要的活細胞的功能。細胞經(jīng)常能夠吸收代謝物但其不是功能蛋白，因此，它們必須去依賴它們自有的基因產(chǎn)物去執(zhí)行不要的功能。

細菌核心基因（看家基因）301.信息的存儲和加工DNA的代謝：（1）基本的復制功能（2）DNA的修復、限制和修飾RNA的代謝：（1）基本的轉(zhuǎn)運功能（2）翻譯（3）

RNA的降解2蛋白質(zhì)的加工、折疊、分泌3細胞的結(jié)構(gòu)和細胞壁的加工4活躍且處于中間的代謝1.信息的存儲和加工31gyrB基因gyrB基因是普遍存在于細菌內(nèi)編碼DNA促旋酶中B亞單位蛋白的基因，屬于信息通路中與DNA復制、限制、修飾或修復有關(guān)的蛋白編碼基因。在大多數(shù)細菌中，以單拷貝的形式存在細菌基因組的rnpA—rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。編碼的是唯一一種能誘導DNA負超螺旋的拓撲異構(gòu)酶一DNA促旋酶的B亞單位蛋白GyrB。

gyrB基因gyrB基因是普遍存在于細菌內(nèi)編碼DNA促旋酶中32DNA促旋酶是一種細菌Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶，在DNA復制及DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的維持過程中起著重要的作用。（1）gyrB基因序列全長約為1．2—1．4kb，平均堿基替換率為每100萬年變化0．7％~0．8％，比16SrDNA的每5000萬年變化1％的速度快。（2）由于其作為蛋白編碼基因，其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，尤其是密碼子的第3位堿基，這就使得gyrB基因序列在區(qū)分和鑒定細菌近緣種方面，比非蛋白編碼基因16SrDNA具有更高的分辨率。DNA促旋酶是一種細菌Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶，在DNA復制及DNA超33Kasai在對小單孢菌屬(Micromonospora)15個有效描述的種和4個亞種的gyrB序列的研究中，得到了與基于16SrDNA序列相似的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但種內(nèi)關(guān)系結(jié)果不同。經(jīng)過與DNA—DNA雜交的比較分析，結(jié)果表明：基于gyrB序列的分類關(guān)系更符合DNA—DNA雜交結(jié)果。Daug在利用gyrB基因比較腸桿菌科(Enterobacteriaceae)不同屬的系統(tǒng)進化關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，與16SrRNA相比，gyrB序列比較適用于屬內(nèi)或?qū)匍g關(guān)系的比較分析。Kasai在對小單孢菌屬(Micromonospora)1534Soler等用gyrB和rpoD序列分析氣單胞菌屬(Aeromonas)的系統(tǒng)發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，這2個基因具有相同的置換率(小于2％)和相似的變異位點(分別為34％和32％)，分別用gyrB、rpoD或結(jié)合這2個基因的序列分析的結(jié)果均與已有分類結(jié)果一致。在種內(nèi)水平上，gyrB對相近的種具有很高的分辨率，rpoD能把混雜在一起的種區(qū)分開來，綜合這2個基因的序列分析能更好地區(qū)分相近的分類單元。Wang等對枯草芽孢桿菌屬的16SrRNA基因、gyrB基因序列和DNA–DNAhybridization比較發(fā)現(xiàn)，gyrB基因序列的相似性在75.4%~95%之間，而且結(jié)果與DNA–DNAhybridization的一致性很高。Soler等用gyrB和rpoD序列分析氣單胞菌屬(Aero35rpoB:核糖核酸聚合酶是在所有的生物體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄以及最終的目標是控制基因表達的調(diào)控路徑。rpoB基因編碼五個亞單位中的一種，β亞單位基因所編碼的。rpoB基因已經(jīng)用于在臨床微生物中的細菌的分子鑒定,它是細菌的一個核心基因。其可變區(qū)域位于2300bp到3300bp之間，sodA基因,其具有錳的金屬依賴性依賴。超氧化物歧化酶歧化酶（編碼超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶可以催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)產(chǎn)生氧分子和過氧化氫。groEL:編碼一種熱休克蛋白60Kda。recN:編碼一個重組修復蛋白多種看家基因的用于進化分析的比較rpoB:核糖核酸聚合酶是在所有的生物體內(nèi)在轉(zhuǎn)錄以及最終的目3616Srrna：1468~1478bpsodA:435bprpoB:680BPgyrB

；458bpgroEL:757bpPartialsequencecomparisonoftherpoB,sodA,groELandgyrBgeneswithinthegenusStreptococcusPartialrecNgenesequencing:anewtoolforidentifi